قعدة اختبار لتنشيط التحقيق في إيج بوساطة آليات في فرط الحساسية للمخدرات

Summary

قعدة اختبار التنشيط هو أداة فعالة للكشف عن الحساسية التي تعتمد على إيج في المختبر. هنا ، يتم استخدام بروتوكول الأمثل لاختبار التنشيط قعدة فرط الحساسية للتحقيق في المخدرات. تم وصف طريقة لإنتاج المخدرات تقارن كفاءة البروتين التساهمية وتكييفها الفيزيائية.

Abstract

يمكن تفاعلات فرط الحساسية ضد الأدوية المضادة للالتهاب غير الستيرويدية (المسكنات) مثل propyphenazone (PP) وديكلوفيناك (مدافع) واضح ونوع I - ¹ مثل الحساسية. في الممارسة السريرية ، يتم تنفيذ أساسا تشخيص فرط المخدرات عن طريق تاريخ المريض ، واختبار الجلد هو غير موثوق بها الاختبار الشفوي واستفزاز تتحمل المخاطر التي تهدد الحياة للمريض ^2. وبالتالي ، فإن الأدلة لpathomechanism إيج بوساطة الكامنة من الصعب الحصول عليها.

هنا ، ونحن في أسلوب تقديم المختبر على أساس استخدام الأسسة حقوق الإنسان مستمد من مرضى الحساسية للأدوية الذي يحاكي المستجيب الحساسية في الجسم الحي. وقعدات للأدوية المرضى بالحساسية تحمل جزيئات محددة لإيج المخدرات المذنب ، أصبح عليهم تنشيط مستقبلات IgE ويشابك وإطلاق الجزيئات المستجيب للحساسية. يمكن رصد تفعيل الأسسة من عزم upregulation من سطح CD63 التعبير باستخدام التدفق الخلوي ^3.

في حالة انخفاض الوزن الجزيئي المخدرات ، مصممة لتمكين تقارن إيج يشابك على مستقبلات الأسسة. كما هو مبين في الشكل (1) ، وممثلين اثنين من المسكنات وبولي بروبلين ومدافع ، لا بد أن تساهمي ألبومين المصل البشري (HSA) عن طريق مجموعة الكربوكسيل التفاعل مع المجموعة الأمينية الأساسية من بقايا يسين. مدافع يحمل مجموعة الكربوكسيل الجوهرية ، وبالتالي يمكن استخدامها مباشرة ⁴ ، في حين أن المجموعة التي تحتوي على مشتقات من الكربوكسيل PP كان لا بد من تجميع organochemically قبل الدراسة ^1.

درجة اقتران من المركبات ذات الوزن الجزيئي المنخفض على جزيء البروتين الناقل وتوزيعها المكاني مهم لضمان يشابك اثنين من جزيئات مستقبلات IgE و. بروتوكول الموصوفة هنا ينطبق عالية الأداء اللوني الاستبعاد الحجم (HPSEC) مجهزة الإنكسار المتسلسل (RI) وفوق البنفسجي (UV) نظام الكشف عن تحديد درجة اقتران.

كما يمكن تطبيق هذه المنهجية لوصف عقاقير أخرى ، واختبار التنشيط قعدة (BAT) يحمل إمكانات ليتم استخدامها لتحديد IgE وبوساطة آليات فرط في المخدرات. هنا ، علينا أن نحدد PP فرط الحساسية وإيج بوساطة فرط الحساسية ، ومدافع عن عدم إيج بوساطة BAT.

Protocol

1. إعداد تقارن المخدرات

1. حل 10 مدافع ملغ في 1 مل O ₂ درهم في أنبوب مل تفاعل 1.5. في المضي قدما 95 ميكرولتر من استخدام هذا الحل DF. لالمتقارن PP إلى حل HSA 30.4 المشتقة PP ملغ (304 غرام / مول) في 500 ميكرولتر هيدروكسيد الصوديوم 0.3 M (هيدروكسيد الصوديوم).
2. إضافة ميكرولتر 430.6 درهم ₂ O و 100 ميكرولتر 0.5 م 2 -- (N - morpholino) ethanesulfonic حمض (MES) درجة الحموضة عازلة 6،5-95 ميكرولتر من مدافع المنحل. إضافة ميكرولتر 33.1 درهم ₂ O و 140 م 2 ميكرولتر من الحموضة عازلة MES 2.9 إلى نموذج PP.
3. إضافة 57.5 ميكرولتر من 'N - N - إيثيل الطازجة -- (3 - dimethylaminopropyl) carbodiimide حل هيدروكلوريد الأسهم (EDC) الذائب في DH ₂ O مع تركيز 100 ملغ / مل من العينة مدافع ، أو 10 ميكرولتر إلى حل EDC PP لعينة. دوامة العينات لمدة 1 دقيقة.
4. إضافة 16.9 ميكرولتر من حل مع تركيز هائل سعيد أنعم من 118 ملغ / مل لكل عينة.
5. احتضان هذه العينات لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، بينما تهتز في 300 طلقة / دقيقة.
6. Dialyze للمدافع وعينات PP 3 مرات مقابل 2 ليتر من الفوسفات مخزنة درجة الحموضة (PBS) المالحة 7.4 لعدة ساعات لكل منهما. تنفيذ كافة الخطوات dialyzing في 4 درجة مئوية.
7. الطرد المركزي للعينة 10 دقائق في 14000 XG وجمع مدافع طاف تحتوي على أو PP مترافق لهائل سعيد أنعم.
8. الاختيار طاف للبروتينات عن طريق إجراء SDS - PAGE ، وذلك باستخدام المواد الهلامية 12 ٪. تحميل حوالي 12 ميكروغرام من المتقارن HSA في فتحة هلام واحد.

2. تحديد سعر اقتران تقارن المخدرات (الشكل 2)

1. لتحليل معدل اقتران مدافع وتقارن PP HPSEC بواسطة استخدام الفوسفات الصوديوم 100 ملم تحتوي على 6.5 درجة الحموضة عازلة 150 مم كلوريد الصوديوم و 0.05 ٪ أزيد الصوديوم. استخدام 7.8 X - 300 مم TSK - G2000 جل العمود _SWXL.
2. إجراء الكشف عن إشارات باستخدام الإنترنت ، إلى جانب ري والأشعة فوق البنفسجية نظام كاشف.
3. تحضير عينة HSA قياسية مع تركيز 1 ملغ / مل في DH ₂ O. لمعايرة الكاشف بضخ 50 ميكرولتر حل HSA القياسية.
4. حساب _ري ري ك المستمر للأشعة فوق البنفسجية _{والأشعة فوق البنفسجية} ك المستمر للكشف. استخدام الصيغ منطقة _RI = ك _ري * [(DN / DC) _HSA * ج (HSA)] ومنطقة _{الأشعة فوق البنفسجية UV} = ك * [(دا / DC) _HSA * ج (HSA)] مع (DN / DC) _HSA = 0،185 و (دا / DC) _HSA = 0.518 ⁵
5. إعداد معايير ومدافع عن HPSEC PP المشتقة التي يمكن أن 5 ، 10 ، و 30 لكل من المبالغ nmol معايير حقن بسهولة.
6. حساب متوسط ​​القيم (DN / DC) _{والمخدرات} (دا / DC) _{المخدرات} على حد سواء المعايير. لمدافع ، وهو (DN / DC) من 0.235 ± 0.010 تقرر و(دا / دي سي) من 39.000 ± 0.493. لمؤتمر المندوبين المفوضين ، وهو (DN / DC) من 0.328 ± 0.016 من و(دا / DC) 53.155 ± 2.464 تقرر.
7. تقارن حقن المخدرات على HPSEC وتحديد المناطق وRI ذروة فوق البنفسجية.
8. حساب تركيز مدافع ، PP المشتقة ، وHSA من خلال حل معادلات المنطقة two _{RI RI} = ك * [(DN / DC) * ج _{المخدرات} (المخدرات) + (DN / DC) _HSA * ج (HSA)] _{الأشعة فوق البنفسجية} والمنطقة = ك _{للأشعة فوق البنفسجية} * [(دا / DC) * ج _{المخدرات} (المخدرات) + (دا / DC) _HSA * ج (HSA)] لمجهولين.

3. BAT تقارن به المخدرات

1. إعداد seven قارورة التدفق الخلوي والتسمية لهم اعتمادا على محتواها : سيطرة غير ملوثين ، ومراقبة سلبية ، والتحكم إيجابية ، وتقارن المخدرات.
2. 50 ماصة ميكرولتر من التحفيز العازلة B - CCR - STB (CAST Flow2 ، بولمان مختبرات ، Schönenbuch ، CH) في قارورة محفوظة لمراقبة غير ملوثين والسلبية. كعنصر تحكم إيجابية ، استخدام 50 ميكرولتر من محلول مكافحة FcεRI التي قدمتها مجموعة CAST Flow2. إضافة كميات مناسبة من محلول المتقارن إلى قارورة محفوظة لتقارن المخدرات عن طريق خلق سلسلة من 0.02 التخفيف 1:10 -20 ميكروغرام / مل مدافع المتقارن والبولي بروبيلين المتقارن (تركيزات النهائي في حجم مقايسة من 200 ميكرولتر). يجب إجراء هذه التجارب المعايرة لتحديد تركيز التنشيط قعدة الأمثل لكل عينة مريض.
3. إضافة 100 ميكرولتر العازلة التحفيز لكل مريض أنبوب و 50 ميكرولتر من الدم EDTA كله. خلط العينات بعناية.
4. ماصة 20 ميكرولتر تلطيخ CAST Flow2 كاشف تحتوي على أجسام مضادة لمكافحة CCR3 المسمى مع فيكوإيريترين (PE) والمضادة للأضداد CD63 المسمى مع ثيوسيانات فلوريسئين (FITC) لكل أنبوب ومزيج مرة أخرى. لا ماصة كاشف تلطيخ في العينة غير ملوثين!
5. احتضان هذه العينات لمدة 45 دقيقة في حمام ماء C ° 37.
6. وقف رد الفعل على الجليد لمدة 5 دقائق.
7. ليز كريات الدم الحمراء عن طريق إضافة 2.0 مل CAST Flow2 كاشف lysing إلى كل قنينة ودوامة بلطف. احتضان العينات في الظلام لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
8. الطرد المركزي عينات لمدة 5 دقائق في 500 XG وطاف صب بعناية.
9. Resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر Flow2 CAST العازلة يغسل وتخزينها على الجليد حتى التدفق الخلوي.
10. ضبط ق تدفق عداد الكريات والجهدettings لمبعثر إلى الأمام والجانب (FSC ، SSC) ، في حين الحصول على عينة غير ملوثين.
11. وتوقع بوابة الخلايا كما الخلايا الليمفاوية من مؤامرة SSC - FSC إلى مؤامرة SSC - PE. يتم تحديدها من قبل الأسسة الأضداد المضادة للCCR3 PE - SSC CCR3 صفت بأنها ^لو وبوابة ^مرحبا بهم في مؤامرة FITC - PE. هو المسمى الأضداد المضادة للكشف عن CD63 الأسسة تفعيلها مع FITC.
12. ضبط قطع إلى الحد الأقصى 2.5 ٪ من قعدات كما CD63 ^مرحبا في السيطرة السلبية. ويعتبر نموذج إيجابي لتفعيل قعدة إذا> قعدات 5 ٪ هي CD63 ^مرحبا ومؤشر يعني مضان (MFI) من العينة مقسوما على مؤسسات التمويل الأصغر للسيطرة سلبية يتجاوز 2 (الشكل 3).

4. ممثل النتائج :

تقيم هذه التجربة BAT كأداة مفيدة لاكتشاف فرط IgE والتي تعتمد على المخدرات. وتستخدم تقارن بروتين المسكنات لتفعيل الأسسة. بواسطة HPSEC مع RI تجميع الأشعة فوق البنفسجية والدولة الكشف ، ودرجة اقتران ، والعائد الفعلي للتقارن مصممون. كما يظهر الشكل رقم 4 ، ظلت 43.5 ٪ من مدافع موحودي تقارن مع درجة اقتران مدافع 5.0 / هائل سعيد أنعم. لمجاميع تم تحديد درجة اقتران 9.5. وقد أظهرت المتقارن propyphenazone تتألف من مونومرات 68.5 ٪ مع درجة اقتران 21.2. كانت درجة اقتران المجاميع 27.9. في المجموع ، وكانت درجة اقتران العزم من 7.6 تقارن مدافع مدافع وذلك من تقارن PP كان 23.2.

BAT تنفيذ تقارن مع الظروف الأمثل (تركيز تقارن ، والوقت التحفيز) سمح التحقيق في IgE والتي تعتمد على ردود الفعل في فرط الحساسية والأدوية المضادة للالتهاب. لم يكن سوى المتقارن PP كما هو مبين في الشكل (5) ، قادرة على تحريك تفعيل قعدة تصور من قبل upregulation في التعبير سطح CD63 : تم تنشيط 20.6 ٪ من قعدات تتميز تحولا في الدخول في كثافة مضان. زادت مؤسسة التمويل الأصغر بمعامل قدره 4.9 من 386 (الرقابة السلبية) لعام 1893. في المقابل ، باستخدام مدافع المتقارن تم تنشيط فقط 3.1 ٪ من قعدات الذي كان أقل من 5 ٪ الانشطارية. كما زادت مؤسسة التمويل الأصغر فقط بعامل 1.1 (حد 2.0) من 197 (الرقابة السلبية) إلى 210. وتعطى صلاحية فحص من قبل (ط) <التنشيط قعدة 5 ٪ في السيطرة السلبية ، (ب) سجل التحول في كثافة مضان بعض الفئات السكانية قعدة ، و (الثالث)> 50 ٪ الأسسة تنشيط (مراقبة إيجابية).

الشكل 1. مشتقة من توصيلات مدافع والبولي بروبيلين لهائل سعيد أنعم. بعد حل تضاف هذه العقاقير ، والمياه ، وزارة التربية والعلم العازلة ، وEDC (اقتران الكاشف). وvortexed العينات لمدة 1 دقيقة قبل pipetted هائل سعيد أنعم للحلول المخدرات. في غضون 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة تهتز المخدرات ربط تساهمي لهائل سعيد أنعم. قد مونومرات فضلا عن المجاميع النتيجة.

الشكل 2. حساب درجة اقتران. أولا ، تحدد الثوابت ك ك _ري والأشعة فوق _{البنفسجية.} لذلك ، يتم حقن HSA القياسية مع تركيز معروف في النظام HPSEC. (DN / العاصمة) ، وتعطى (دا / دي سي) لهائل سعيد أنعم وقيم 0.185 0.518 على التوالي ^5. وتستخدم المناطق الذروة لحساب الثوابت. الثانية ، عن كل دواء يتم حقن ثلاثة معايير لتحديد المخدرات والتركيز RI محددة ومناطق الأشعة فوق البنفسجية. منذ معروفة والثوابت _RI ك ك _{الأشعة فوق البنفسجية} من الخطوات المذكورة أعلاه ، يمكن حساب المشتقات المخدرات محددة (DN / DC) و (دا / دي سي). يتم حقن الثالثة ، المخدرات HSA تقارن في HPSEC. وتستخدم المناطق الذروة مما أدى لحساب تركيزات المخدرات وHSA في الذروة من خلال حل المعادلات اثنين مع اثنين من المتغيرات غير معروف.

الشكل 3. قعدة النابضة. وتوقع الخلايا الليمفاوية كما هي بوابات مبعثر الجانب مقابل مبعثر إلى الأمام (SSC - FSC المؤامرة). وحددت محكمة أمن الدولة CCR3 الأسسة كما ^{لو مرحبا} من الخلايا الليمفاوية بوابات (SSC - CCR3 مؤامرة - PE). ويتم تحليل قعدات للتنشيط (CD63 ^مرحبا) في المؤامرة - CD63 - FITC CCR3 - PE. يستخدم عنصر التحكم السلبي لضبط قطع من الحد الأقصى 2.5 ٪ المتبقية الأسسة CD63 ^مرحبا.

الشكل 4. درجة اقتران تصميما من تقارن المخدرات. RI وإشارات الأشعة فوق البنفسجية تظهر ذروتين تمثل مجاميع (يبلغ حجمه حجم الاحتفاظ في منخفض) ومونومرات (يبلغ حجمه في حجم الاحتفاظ عالية) من المخدرات HSA تقارن. وصفت والنسب المئوية للمونومرات المجاميع (تحديدها من إشارات RI) وشهاداتهم اقتران (ن = 1).

الشكل 5. قعدة activatiعلى الاختبار. وتظهر نتائج العينات المتقارن تنشيط المخدرات ، وضوابط السلبية ، والضوابط الإيجابية في CD63 - FITC CCR3 - PE - المؤامرات (ن = 1).

Discussion

BAT هي راسخة وإن لم يكن حتى الآن تستخدم بشكل روتيني طريقة لتشخيص المرض إيج بوساطة حساسية ^6،7. فرط الحساسية للدواء ، ولكن ، للخطر انطباقها على المركبات منخفضة الوزن الجزيئي ليست قادرة على مستقبلات IgE وتشعبي ، وهو شرط أساسي لتفعيل قعدة ^8. ولذلك ، والمخدرات ، قيد التحقيق ضرورة أن يقترن تساهميا الناقل مناسبة للبروتينات (مثل HSA). الأهم من ذلك ، لدرجة اقتران (أي عدد جزيئات الدواء في البروتين الناقل) يجب أن يكون للرقابة لضمان النشاط المناعي (IgE وأي مستقبلات عبر ربط) من تقارن. نظريا ، ينبغي أن اثنين من haptens في الجزيء الناقل تكون كافية لمستقبلات IgE وعبر ربط وثبت قليلة مثل الجزيئات مدافع خمسة في HSA لتحريك الافراج عن الوسيط في مقايسة الخلية المستندة إلى ^4. وقد تم تحديد كلا تقارن ، PP - HSA وDF - HSA ، لعرض على درجة عالية بما فيه الكفاية اقتران (HPSEC) ، وتكون نشطة مناعيا الكواشف جعلها مناسبة للاستخدام في BAT. قد تكون قضية أخرى أن الأيضات المخدرات قد تلعب دورا ، وذلك بدلا من المستقلب المخدرات الأم قد يسبب رد فعل حساسية. في حالة وجود مدافع ، وقد تم تقييم هذا الاحتمال بالتفصيل به سابقا five المرحلة الرئيسية الأيضات أنا واحد مغاير الربط ^4. عوامل هامة لاتقان تقنية صفها تشمل جودة عينة من الدم (<12 ساعة منذ جمع الدم ، والكشف عن عدد من قعدات> 500) وتحسين ظروف التحفيز (الوقت والجرعة). بالإضافة إلى ذلك ، ما يسمى غير المستجيبين الذين لا تتفاعل حتى مع السيطرة الايجابية (الأجسام المضادة الموجهة ضد مستقبلات إيج) يتعين تحديدها. ولذلك ، ومعايير يجب أن تتضمن التحقق من صحة جسم مكافحة FcεRI كما تحكم إيجابية. ميزة هامة من استخدام تقارن المخدرات هو حقيقة أنها غير سامة تظهر على النقيض من العقاقير نقية ، كما هو موضح لDF - HSA المتقارن بواسطة التحفيز بالتعاون مع المضادة للأجسام المضادة في FcεRI BAT ^4. مدافع نقية ، في المقابل ، يعرض الآثار السامة للخلايا عند تركيز من 1.25 ملغ / مل يسبب مشاكل مع تفسيرها من BAT ^9. عموما ، ينصح بشدة لاختبار السمية المحتملة لكل المتقارن المخدرات المنتجة حديثا.

هنا ، لقد أظهرنا إمكانات PP - HSA المتقارن BAT المستخدمة في الكشف عن فريق الخبراء الحكومي الدولي بوساطة فرط الحساسية. في المقابل ، لا يرتبط مع مدافع فرط IgE وأثبت عدم وجود تفعيل قعدة ردا على DF - HSA المتقارن. الأهم من ذلك ، في حالة من عدم اليقين بشأن آلية إيج بوساطة ، تقارن يتعين تقييمها لنشاط المناعية التي كتبها في أنظمة الفحص المختبري خلية القاعدة كما تبين للمدافع ^4.

باستخدام الإعداد لوصف العقاقير التصريف منخفضة الوزن الجزيئي لتساهميا البروتين الناقل مناسبة جزيئات عددا من تفاعلات فرط الحساسية ضد الأدوية بما فيها المضادات الحيوية ، المسكنات الأخرى ، radiocontrast وسائل الإعلام ، مرخيات العضلات ، والتخدير ، قد يكون التحقيق وما إلى ذلك للحصول على اشتراك لفريق الخبراء الحكومي الدولي بوساطة الآلية. وبالتالي ، قد يكون بمثابة BAT بالإضافة إلى الأساليب الحالية لتشخيص (اختبار الجلد ، واختبار الاستفزاز عن طريق الفم).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف / الجهاز	شركة	فهرس العدد	تعليقات
2 -- (N - Morpholino) ethanesulfonic حمض	سيغما	M3671	--
7.8 × 300 مم جل TSK - G2000SWXL العمود	العلوم البيولوجية Tosoh	08540	--
دينار بحريني FACSCanto الثاني	بيكتون ديكنسون	338962	--
الطرد المركزي مقاعد البدلاء الأعلى	سيغما	--	--
ديكلوفيناك الصوديوم الملح	سيغما	D6899	--
EDTA - Vacutainer	بيكتون ديكنسون	368589	--
Flow2 CAST كيت	بولمان مختبرات	FK - CCR	مجموعة فعالة CAST 14 يونيو 2011 Flow2 الآن CAST تدفق
HP1100 HPLC نظام	هيوليت باكارد	--	--
مصل الزلال البشري	سيغما	A9511	--
مختبر أجهزة الطرد المركزي	إيبندورف	--	--
N - الأثيل - N' - (3 - dimethylaminopropyl) carbodiimide هيدروكلوريد (EDC)	سيغما	E6383	--
أقراص PBS	AppliChem	A9199	--
Propyphenazone المشتقة	قسم البيولوجيا الجزيئية ، جامعة سالزبورغ ، النمسا	--	--
شاكر	إيبندورف	--	--
أزيد الصوديوم	سيغما	S8032	--
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)	سيغما	S1679	--
كربونات الصوديوم الهيدروجينية	سيغما	90421C	--
هيدروكسيد الصوديوم	سيغما	S5881	--
فوسفات الصوديوم	سيغما	342483	--
الثلاثي مجموعة كاشف	Viscotek	TDA302	--
الشخصية BioVortex V - 1 زائد	Peqlab	90 - V - 1	--
حمام ماء 1012	GFL	1012	--