العزلة وتنقية كينيسين من ذبابة الفاكهة الأجنة

Summary

هذا هو بروتوكول لعزل نشط كينيسين طول كامل من ذبابة الفاكهة الأجنة لواحدة جزيء دراسات البيوفيزيائية. نبين كيفية جمع الأجنة، وجعل المحللة جنين، وتتبلمر ثم ميكروتثبول (MTS). يتم تنقيته بواسطة شل حركة كينيسين على النظام التجاري المتعدد الأطراف، والغزل أسفل المجمعات كينيسين-طن متري، ومن ثم الافراج عن كينيسين من النظام التجاري المتعدد الأطراف عن طريق إضافة للاعبي التنس المحترفين.

Abstract

البروتينات محرك نقل الشحنات على طول الأنابيب الدقيقة، ونقلهم إلى مواقع فرعية الخلوية محددة. ولأن يقترح نقل تغييرها لتشكل أساس مجموعة متنوعة من أمراض الاعصاب، فهم نقل أنيبيب محرك أساس ولائحته من المرجح أن يؤدي في نهاية المطاف إلى تحسين الطرق العلاجية. كينيسين-1 هو بروتين محرك حقيقية النواة التي تتحرك في اتجاه تقدمي (زائد النهاية) على طول الأنابيب الدقيقة (MTS)، والمدعوم من التحلل المائي للاعبي التنس المحترفين. نحن هنا نورد بروتوكول تنقية مفصل لعزل نشط كينيسين طول كامل من أجنة ذبابة الفاكهة، مما يسمح للمزيج من الوراثة ذبابة الفاكهة مع دراسات البيوفيزيائية واحدة جزيء. بداية مع ما يقرب من 50 أكواب زرع، مع ما يقرب من 1000 من الإناث في الكأس، وأجرينا مجموعات بين عشية وضحاها. قدمت هذا ما يقرب من 10 مل من أجنة معبأة. وكانت الأجنة تبييض dechorionated (استسلام حوالي 9 غرامات من الأجنة)، وبعد ذلك المتجانس. AFثالثا انقطاع، وأوضح أن جناسة باستخدام تدور بسرعة منخفضة تليها الطرد المركزي عالية السرعة. تمت معالجة طاف مع توضيح GTP والتاكسول إلى تتبلمر MTS. وثبتوا على النظام التجاري المتعدد الأطراف كينيسين بلمرة بإضافة التناظرية للاعبي التنس المحترفين، 5'-أدينيليل imidodiphosphate في درجة حرارة الغرفة. بعد ملزم كينيسين، وsedimented ميكروتثبول عن طريق الطرد المركزي بسرعة عالية من خلال وسادة السكروز. وكان بيليه أنيبيب ثم إعادة وقف التنفيذ، وتكررت هذه العملية. أخيرا، تمت إضافة للاعبي التنس المحترفين للافراج عن كينيسين من النظام التجاري المتعدد الأطراف. ارتفاع سرعة الطرد المركزي نسج ثم تراجع النظام التجاري المتعدد الأطراف، وترك كينيسين في طاف. وقد تعرض هذا كينيسين لترشيح الطرد المركزي باستخدام قطع 100 دينار كويتي من مرشح لمزيد من تنقية، aliquoted، المفاجئة مجمدة في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية. تم تنفيذ SDS هلام الكهربائي والغربية النشاف باستخدام عينة تنقيته. والنشاط الحركي للعينات تنقيته قبل وبعد خطوة الترشيح الطرد المركزي النهائيتم تقييم استخدام واحد في المختبر فحص جزيء أنيبيب. وأظهرت الكسور كينيسين قبل وبعد الترشيح الطرد المركزي processivity كما ذكرت سابقا في الأدب. تجارب أخرى تجرى حاليا لتقييم التفاعل بين كينيسين وبروتينات النقل الأخرى ذات الصلة.

Protocol

ويمكن شراء سلالات الذباب وتضخيمها في المختبر. اعتمادا على كمية من قوارير ثقافة ذبابة الفاكهة وردت، لا يحتاج المرء إلى كثير من الأحيان 'الوجه' في قارورة والثقافة، ومرة واحدة في قارورة وصلت الطاقة الإنتاجية القصوى. والتضخيم يستمر حتى يتم شغل ما يقرب من 50 قارورة ثقافة ذبابة الفاكهة. واحد يجعل من ثم "يطير الكؤوس" مع 100 الأكواب البطين الثلاثي القرون مل (تطير صنع كوب وتناقش في القسم التالي). بعد 24 ساعة، واستخدام الأجنة من هذه الكؤوس على البذور الجديدة قارورة ثقافة ذبابة الفاكهة مع الطعام ذبابة اضافته في القاع. في درجة حرارة الغرفة، في الوقت النمو للأجنة ذبابة الفاكهة من أجنة بين عشية وضحاها إلى كامل الذباب نمت هي حوالي 8.5 أيام. الأجنة المصنف تفقس بعد 12-15 ساعة في مرحلة اليرقات الأولى. اليرقات تنمو لمدة 4 أيام طرح الريش مرتين في مرحلة اليرقات الثانية والثالثة، في 24 و 48 ساعة بعد الفقس. اليرقات ثم تغلف في pupariums وتقديمها إلى مسخ 4 ايام حتى تخرج من تيقضايا وريث العذراء ^1. السماح لمزيد من النمو لحوالي يومين أو ثلاثة أيام في قارورة ثقافة ذبابة الفاكهة لزيادة كمية من الذباب في كل منهما. عندما تمتلئ 400 قارورة، وسيكون هناك كمية كافية من الذباب لكؤوس البيض 50 وضع (حوالي 1،000 الذباب الإناث في الكأس). الذباب تحتاج الى وقت للتكيف مع البيئة الجديدة. وعادة ما يستغرق حوالي يومين بالنسبة لهم ليكون جاهزا للجمع، بعد نقله الى الكؤوس. وسوف تحل محل لوحات أجار يومي الحفاظ على كؤوس ذبابة نظيفة، والتي تسمح الذباب على العيش لفترة أطول. (للحصول على مزيد من الفهم رعاية ذبابة الفاكهة والتضخيم، يرجى الرجوع إلى ذبابة الفاكهة DB روبرتس: نهج عملي ^2).

مصدر جيد للحصول على كميات كبيرة من أجنة ذبابة الفاكهة هي أقفاص سكان ^3، والتي هي متاحة تجاريا. ويمكن رؤية الجمعية وصيانة أقفاص السكان في الفصل 5 و 7 في الكتاب ذبابة الفاكهة السوداء البطن: Practical الأغراض في الخلية والبيولوجيا الجزيئية ⁴ علم الأحياء. ومع ذلك، أقفاص سكان مكلفة ويصعب الحفاظ عليها. منذ أقفاص السكان يمكن عقد كمية وفيرة من الذباب، واستخدام غاز ثاني أكسيد الكربون هو ضروري لنقل وتغذية الذباب. كما ذكر من قبل، وغاز ثاني أكسيد الكربون يقلل من الصحة من الذباب، وتسبب لهم عدم وضع كذلك. على نطاق صغير، ويمكن استخدام 100 مل الأكواب البطين الثلاثي القرون. مع الأكواب 50 مل 100، قد يتحقق 9 غرامات من أجنة dechorionated. من أجل إزالة الذباب الميت، غير مستخدمة معجون الخميرة وغيرها من الشوائب التي أنشأناها مزدوج الصيد غربال الطبقات ذات أحجام شبكة مختلفة. واحد الفخاخ غربال المواد غير المرغوب فيها مثل الذباب الميت في الوقت الذي تسمح الأجنة لتمرير من خلال (350 حجم المسام ميكرون). الجزء الثاني يحتوي على شبكة (120 ميكرون حجم المسام)، والذي يهدف الى جذب أجنة ذبابة الفاكهة وغيرها من الشوائب سوف تمر عبر الشبكة.

1. يطير التحضير لكرة القدم ومجموعة جنين

1. قلبالذباب تضخيمها من قوارير متعددة الى قنينة بلاستيكية فارغة، حتى وصلت كمية من الذباب شبر واحد من ارتفاع القارورة ل. ثم، ونقل هؤلاء الذباب الى 100 مل بيضة جمع كوب (تريكون الكأس مع شبكة من النايلون ويندوز). الحفاظ على الاستفادة من كأس على سطح صلب لمنع هروب من الذباب عند نقل الذباب. تغطية كأس مع معجون أجار لوحة تحتوي على خميرة، والسماح 24-48 ساعة من الوقت لتحقيق الاستقرار.
2. جمع لوحات أجار بين عشية وضحاها من كؤوس الطاير 50، ويغسل محتويات لوحات لافت غربال باستخدام فرشاة الطلاء نظيفة ومياه جارية. لحم الأجنة في غربال مع الكثير من الماء حتى يتم غسلها كل عجينة الخميرة بعيدا.
3. Dechorionate الأجنة تنظيفها عن طريق غمر بها في التبييض 50٪ لمدة 3 دقائق.
4. شطف مع الماء المقطر على نطاق واسع حتى الأجنة فضفاض رائحة مبيض. تجف ثم تتشابك مع الأجنة عن طريق وضعها في أوقات AC منشفة أضعاف عدة. نقل الأجنة إلى قارورة نظيفة وتسجيل الوزن.

2. التجانس الجنين وتوضيح

1. وضع الأجنة dechorionated في الخالط Dounce مع حجم × 1.5 من عازلة استخراج جليد الباردة.
2. تفعل 5 السكتات الدماغية مع مدقة فضفاض. قسامة وجناسة في أنابيب الطرد المركزي نظيفة. الطرد المركزي في 15000 جم لمدة 40 دقيقة. في 4 درجات مئوية.
3. بعناية جمع السائل واضح طاف دون طبقة الدهون البيضاء العلوي أو السفلي بيليه.
4. نقل طاف لتنظيف أنابيب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 50000 جم لمدة 30 دقيقة. في 4 درجات مئوية
5. ويمكن استخدام الناتج عالية السرعة طاف جمعها على النحو المبين أعلاه مباشرة أو يمكن أن تكون مفاجئة المجمدة والمخزنة في -80 درجة مئوية لمدة شهور.

3. البلمرة أنيبيب وتجليد كينيسين

1. ذوبان الجليد في المجمدة عالية السرعة طاف على درجة حرارة الغرفة. إلى تتبلمر ميكروتثبول، إضافة GTP (0.3 ملم) والتاكسول (20 ميكرون)، وتستنهض الهمم بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في1 شاكر الدورية.
2. لربط كينيسين، إضافة 2.5 ملم nonhydrolyzable ATP التناظرية 5'-أدينيليل imidodiphosphate (AMPPNP)، تليها الإثارة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في شاكر الدورية.

4. الترسيب التفاضلية من ميكروتثبول وكينيسين

1. الرواسب من خلال حجم وسادة السكروز المساواة (السكروز 20٪ و 10 ميكرومتر في التاكسول العازلة الاستخراج) عن طريق الطرد المركزي في 23000 ز (sw41ti الدوار، TLS-55) لمدة 30 دقيقة. في 4 درجات مئوية.
2. غسل بيليه بواسطة إعادة تعليق في 10٪ من حجم جناسة الأصلي في استخراج العازلة التي تحتوي على 10 ميكرومتر التاكسول و 75 ملي مول كلوريد الصوديوم.
3. تكرار الترسيب مع آخر وسادة حجم السكروز متساوية كما في الخطوة 4.1.
4. اعادة تعليق بيليه من يغسل الملح في عازلة استخلاص 5٪ مع 20 ميكرون التاكسول، 75 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي MgSO _4، و 10 ملم للاعبي التنس المحترفين.
5. الرواسب في 120000 ز (sw41ti الدوار: 31000 دورة في الدقيقة، TLS-55: 42،000 دورة في الدقيقة) لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. جمع طاف (كينيسين جزء).
6. تنفيذ عملية الترشيح الطرد المركزي في 14000 جم لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. استعادة عينة المركزة وكرر الترشيح مع فلتر جديد على النحو الوارد أعلاه لمدة 30 دقيقة وجمع عينة المركزة.
7. إجراء فحص البروتين لتحديد تركيز. لفترة وجيزة، تركيزات مختلفة من البروتين المعروفة (مصل بقري، BSA) كانت مختلطة مع حجم معروفة من كاشف برادفورد وقياس الكثافة البصرية في طول موجة 595nm. ثم تأسست في كثافة ضوئية مقابل تركيز منحنى معيار لحساب تركيز غير معروف من تنقية كينيسين جزء باستخدام الكثافة البصرية من هذه العينة يقاس تحت ظروف مماثلة كما ان من عينات BSA القياسية. وقد أجريت أيضا الكهربائي للهلام، وكذلك غرب النشاف باستخدام مبلغ معروف من كينيسين المنقى.
8. قسامة جزء كينيسين إلى كميات صغيرة من التركيز المطلوب وتجميد المفاجئة في النيتروجين السائل لتخزين في -80 درجة مئوية.

ق ق = "jove_title"> 5. ممثل النتائج

تمت تنقية كامل طول كينيسين وظيفي من أجنة ذبابة الفاكهة. الشكل 1 يصور الجل الملون الفضة تظهر كسور مختلفة خلال تنقية. لين 1 هي عينة من طاف بسرعة عالية بعد توضيح (الخطوة 2.5)، 2 لين هو عينة من بيليه بعد توضيح، لين 3 هو عينة من طاف بعد الترسيب الأولى مع وسادة السكروز (الخطوة 4.1)، لين 4 وعينة من بيليه بعد الترسيب الأولى، لين 5 هو عينة من طاف بعد الترسيب الثاني (خطوة 4.3)، لين 6 هو عينة من بيليه بعد الترسيب الثاني، لين 7 هو عينة من بيليه من والترسيب النهائي (الخطوة 4.5)، لين 8 هو عينة كينيسين تنقيته، لين 9 هو عينة كينيسين تمت تصفيتها، وممر 10 هو علامة. الفرقة تتركز في حارة 8 و 9 في نحو 115 دينار كويتي هو كينيسين الثقيلة سلسلة 1، وهو ما يتسق مع الارقام ..الكشف عن E-1، لين 8 من ورقة ساكستون نشرت في عام 1988 ^5. الشكل رقم 2 يمثل لطخة غربية (ج) من الكسر كينيسين تنقية باستخدام الأجسام المضادة سلسلة كينيسين الثقيلة. الأجسام المضادة AKINO1-A لا بشكل ملحوظ مع غيرهم من أفراد الأسرة كينيسين ⁶ عبر رد فعل. لاحظ أنه على الرغم من هذه النتائج في بروتوكول مصدرا جيدا للكينيسين وظيفية، في حين يتم تخصيب الكسر لكينيسين-1، وهناك على الأرجح الملوثات، بما في ذلك kinesins أخرى يحتمل أن تكون والبروتينات السيارات الأخرى. أزلنا مجموعة متنوعة من أصغر الملوثات عن طريق الترشيح. بقدر إزالة المحركات الأخرى التي لا يمكن القيام به من حيث حجم وحده، وتنقية يشبه ما قامت به من قبل الآخرين لدراسة كينيسين ^7، ونحن نعتقد أن الغالبية العظمى من السيارات النشط هو كينيسين-1، ولكن تنقية اكثر تطورا تسمح سوف وقد تم إزالة الملوثات محرك المحتملة، مثل كول وآخرون ⁽⁸⁾ وساكستون وآخرون. ⁹

تم تقييم processivity من كينيسين من قبل واحد في المختبر فحص جزيء أنيبيب ملزمة، كما هو موضح في مزيد من التفاصيل في كتاب من قبل Scholey بعنوان "الفحص على الحركة لبروتينات موتور" ^(10). لفترة وجيزة، تم جلب الخرز البوليسترين مع محرك نشط واحد على اتصال مع أنيبيب، في ظل وجود تشبع (1 ملم) للاعبي التنس المحترفين. المحرك تعلق على أنيبيب، وبدأ بالمشي بعيدا عن مركز في فخ الليزر. في تشريد محددة مسبقا من حبة من مركز فخ (100 نانومتر) وتحول تلقائيا قوة شعاع الليزر خارج، والسماح للسيارات بالسير على طول MT تحت أي حمولة. ويعرض الفيلم يبلغ قطرها 500 نانومتر حبة مع كينيسين واحد يمشي طن متري. طول شاشة الفيديو يناظر 20 ميكرون. الشكل (3) يمثل التوزيع المعياري للأطوال التي تديرها واحدة لكامل طول جزيئات كينيسين ذبابة الفاكهة، المنقى وفقا لبروتوكول المقدمة هنا. وexponentiآل صالح للتوزيع يوفر runlength متوسط ​​كينيسين واحد 1.55 ± 0.1 ميكرون و 1.28 ± 0.12 ميكرون للعينة التي تمت تصفيتها وفلتر على التوالي.

الشكل 1 فضة هلام ملون من الكسور النقي: تم تشغيل عينات من كل جزء في مادة هلامية بنسبة 10٪. تم تحميل 10 ميكروغرام من البروتين في كل حارة. لين 1 هي عينة من طاف بسرعة عالية بعد توضيح (الخطوة 2.5)، 2 لين هو عينة من بيليه بعد توضيح، لين 3 هو عينة من طاف بعد الترسيب الأولى مع وسادة السكروز (الخطوة 4.1)، لين 4 وعينة من بيليه بعد الترسيب الأولى، لين 5 هو عينة من طاف بعد الترسيب الثاني (خطوة 4.3)، لين 6 هو عينة من بيليه بعد الترسيب الثاني، لين 7 هو عينة من بيليه من والترسيب النهائي (الخطوة 4.5)، لين 8 هو كينيسين المنقىعينة، لين 9 هو كينيسين تصفيته باستخدام 100 دينار قطع Amicon المتطرف مرشح مل 0،5 الطرد المركزي (ميليبور، الولايات المتحدة الأمريكية). الأسهم الزرقاء تدل على البروتينات التي كانت انخفضت كميات والسهم الأحمر يشير إلى تركيز كينيسين نظرا لخطوة الترشيح الطرد المركزي المستخدمة في هذا البروتوكول.

الشكل 2 نشف منقى شركة المملكة القابضة جزء ضد المضادة للكينيسين الأضداد: تعرض منقى كينيسين عينة لهلام إستشراد ونشف (في غشاء النيتروسليلوز) ضد الأجسام المضادة الأولية AKINO1-A (1:1،000 في TBST) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة تليها حضانة في حمار المضادة للأرنب الأجسام المضادة (1:10،000 في TBST) لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. تم استخدام (chemiluminescent) ECL عدة للكشف عن إشارة كينيسين هو مبين أعلاه.

الشكل 3. Runlength وسرعة واحدة ذبابة الفاكهة كينيسين طول كامل: (أ) و (ب) Runlength وسرعة عينة كينيسين التي تمت تصفيتها. (ج) و (D). Runlength وسرعة عينة كينيسين فلتر

الشكل 4. فيديو من الحركة كينيسين. اضغط هنا لمشاهدة الفيديو .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الدماغ البقري هو المادة الأكثر استخداما على نطاق واسع بدءا من ¹¹ إلى تنقية كاملة الطول كينيسين، على الرغم من واستخدمت في الدماغ الفئران وكذلك ^12. والعيب الكبير في استخدام الدماغ البقري كمصدر كينيسين هو توافر المواد الطازجة بدءا: المسالخ وعادة ما تكون غير ق?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الكاشف أو المواد	شركة	فهرس العدد	تعليقات
أجار (حبيبات)	الصياد	1423-500
سكر العنب (مد الجلوكوز) اللامائى	الصياد	D16-3
أطباق بتري	بيكتون	35 1007	60x15mm ستايل (البوليستر) 20/bag
ذبابة الفاكهة الثقافة قوارير	الاتحاد الدولي للدراجات
البطين الثلاثي القرون الكأس	ECONO مختبر شركة	B700-100	حجم: 100ML، الحجم: 58x72mm
خميرة	النجم الاحمر	2751
شبكة النايلون	Genesse العلمية	57-102	120 مicron حجم المسام
شبكة النايلون	أجزاء صغيرة	06-350/35
أنابيب	سيغما	108321-27-3
أنابيب	سيغما	108321-27-3
الغليسيرول	الصياد	56-81-5
EGTA	سيغما	67-42-5
MgS0 4 (اللامائى)	الصياد	7487-88-9
PMSF	سيغما	329-98-6
Leupeptin	سيغما	103476-89-7
Aprotأونين	سيغما	9087-70-1
تامى	سيغما	178403-8
STI	Calbiochem	65635
GTP	سيغما	36051-31-7
التاكسول	سيغما	33069-62-4
ATP التناظرية 5'-أدينيليل imidodiphosphate	سيغما	3605-31-7
كلوريد الصوديوم	مالينكرودت	7647-14-5
ATP	سيغما	74804-12-9
Amicon مرشحات الترا الطرد المركزي: 0.5 مل، 100kD قطع (8)، حزمة	ميليبور	UFC510008