JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

المهندسة الأنسجة العضلية لديها امكانات كبيرة في مجال الطب التجديدي، ونموذج المرض وأيضا كمصدر بديل للحوم. نحن هنا وصف الهندسية لبناء العضلات، في هذه الحالة من خلايا فأر السلف myoblast، والتحفيز من قبل النبضات الكهربائية.

Abstract

ويمكن استخدام هندسة الأنسجة العضلية لأغراض مختلفة، والتي تشمل إنتاج أنسجة لاستخدامها كنموذج المرض في المختبر، على سبيل المثال لدراسة التقرحات الناتجة عن الضغط، للطب التجديدي وكبديل اللحوم 1. تم إجراء المرة الأولى التي يبلغ يبني العضلات 3D قبل سنوات عديدة والرواد في مجال Vandenburgh هي وزملاؤها 2،3. التقدم المحرز في هندسة الأنسجة العضلية ليست سوى نتيجة من مكاسب واسعة في معرفة العوامل البيوكيميائية، والخلايا الجذعية والخلايا الاولية، ولكن هي في مقرها بصفة خاصة على الخبرات المكتسبة من قبل الباحثين أن العوامل المادية تلعب دورا أساسيا في السيطرة على سلوك الخلية و الأنسجة التنمية. دولة من بين الفن العضلات الهندسة يبني تتكون حاليا من يبني هيدروجيل الخلية بالسكان. في مختبرنا هذه تتكون عادة من الفئران الخلايا الاصلية myoblast، معزولة عن الفئران عضلات الأطراف الخلفية أو خلية myoblast خط الفئران C2C12، ميلxed مع خليط من الكولاجين / Matrigel ومطلي بين نقطتين ترسيخ، ومحاكاة الأربطة العضلية. ويمكن اعتبار الخلايا الأخرى أيضا، مثل خطوط الخلايا البديلة مثل الفئران myoblasts L6 4، الوليد خلايا العضلات السلف المستمدة 5، الخلايا المشتقة من الأنسجة العضلية الكبار من الأنواع الأخرى مثل 6 أو بفعل الإنسان حتى الخلايا الجذعية المحفزة (خلايا الجذع) 7 . انقباض الخلايا يسبب محاذاة الخلايا على طول المحور الطويل للبناء 8،9 والتمايز للخلايا العضلات السلف بعد حوالي أسبوع واحد من الثقافة. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق التحفيز الكهربائي تعزيز عملية التمايز إلى حد ما 8. بسبب حجمها محدود (8 × 2 × 0.5 مم) ويمكن تحليل الأنسجة باستخدام المجهر متحد البؤر كاملة لرصد جدوى مثل تمايز الخلايا والمواءمة. اعتمادا على تطبيق معين متطلبات engineeسوف تختلف الأنسجة العضلية الحمراء، واستخدام مثل للطب التجديدي يتطلب رفع مستوى حجم الأنسجة والأوعية الدموية، في حين ليكون بمثابة ترجمة لحوم بديلة الأنواع الأخرى أمر ضروري.

Protocol

1. ثقافة الفئران الخلايا الاصلية Myoblast أو خلايا C2C12

  1. عزل الخلايا وفقا للبروتوكول نشر في البداية من قبل شيفر وزملاؤه (10) وتكييفها في وقت لاحق من قبل كولينز وآخرون (11) وبونين وآخرون 12 و تخزين هذه في النيتروجين السائل. هذا يتطلب الفئران، على سبيل المثال C57BL / 6. وتستخدم أساليب بديلة في مختبرات أخرى، على سبيل المثال طريقة التي نشرت في مجلة التجارب تصور من قبل شركة Y لى وآخرون 13. لالكواشف والمعدات ويشار لك الجدول في الصفحة 7 و 8. من العضلات من الماوس سوف تحصل عموما الخلايا بما يكفي لنحو 20 قارورة cryopreserve في النيتروجين السائل. المقبل، ونحن نبدأ البروتوكول لذوبان الجليد في الخلايا من تخزين النيتروجين السائل.
  2. وضع الخلايا من 1 فيال في Matrigel 25 2 سم (1 ملغ / مل) قارورة المغلفة زراعة الأنسجة والمتوسطة إضافة النمو (GM)، ويتألف من (335 مل DMEM المتقدمة، بوفين الجنين 100 مله المصل (FBS)، 50 مل HS، 5 مل البنسلين / الستربتوميسين، 5 مل L-glutamin، 5 مل استخراج الجنين الدجاج (CEE)).

ملاحظة: معطف لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة وإزالة Matrigel من الطموح.

  1. ثقافة فرعية الخلايا 1:03 تقريبا كل 3 أيام.
    وهذا يعني: في يوم 3: الخلايا المرور من 25 سم إلى احدة 2 قارورة 75 2 سم، في يوم 6: الانتقال من الخلايا 75 قارورة 2 سم لمدة 150 قوارير 2 سم (مع 30 دقيقة في قوارير preplating غير المصقول). على يوم 9 خدمة النقل 150 سم 2 إلى 1 قارورة قارورة الثلاثي 150 2 سم، أو إذا غير متوفرة لثلاث قوارير 150 سم 2 (إذا لزم الأمر preplate يتوقف مرة أخرى على النمط الظاهري للخلايا). على يوم 12 الخلايا على استعداد لزرع البذور في بناء العضلات.

ملاحظات: - لكل 150 سم الثلاثي (2) وعدد الخلايا ستكون حوالي 4.5 × 10 6 خلايا.
عبر استخدام -LS من العزلة مختلفة لمزجها للحصول على مزيج من الخلايا في وقت البذر.

ملاحظة: إذا اخترت عدم العمل مع الخلايا الأولية، C2C12 myoblasts هي بديل جيد.

2. الهندسة الأنسجة العضلية الهيكلية

  1. إعداد الغراء السيليكون عن طريق خلط "الاستومر" مع "وكيل علاج" (10:1). قطع + / - 5 ملم مربع من شرائح الفيلكرو مع جانب واحد الثلاثي (مثل منزل الشكل، الشكل 1). الغراء الفيلكرو في آبار لوحة الثقافة جيدا في 6 مساحة ما يقرب من 12 ملم بين المربعات.

ملاحظات: - لا تستخدم إلا لينة الجانب من الفيلكرو ومواجهة هذا الجانب الصعودي.
- تأكد من أن أسطح المنازل مواجهة بعضها البعض.
- لا تغطي سوى الفيلكرو مع الغراء السيليكون، لا تنتشر في جميع أنحاء البئر الغراء.
- للحصول على التحفيز الكهربائي في وقت لاحق من ذات الصلة لتحقيق المواءمة بين ثوابت في الاتجاه العمودي للجمع بشكل جيديأكلون (على طول المحور الطويل).

  1. ترك ليجف بين عشية وضحاها في الفرن فراغ، وليس ساخنة، في المقام الأول لإزالة فقاعات الهواء. تعقيم بإضافة EtOH 70٪ إلى الآبار واحتضان لمدة 15 دقيقة. شطف 3x مع PBS وضعت تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة. إزالة جميع PBS من الآبار والفيلكرو ومكان في الحاضنة حتى الاستخدام.
  2. ذوبان الجليد حل Matrigel في الثلاجة وإعداد الحل الكولاجين إلى التركيز المطلوب قبل فترة وجيزة جعل يبني 3D. تمييع الأسهم الكولاجين مع حمض الخليك العقيمة 0.02٪ (تركيز النهائي 3،2 ملغ / مل).

ملاحظة: ترك كل شيء على الجليد.

  1. يعرض للتريبسين الخلايا، resuspend في GM والعد. ترك الخلايا في أنبوب الطرد المركزي في الحاضنة.
  2. إضافة المبلغ المطلوب من محلول المخزون الكولاجين لأعداد التركيبات التي تريد القيام بها لأنبوب (وفقا لجدول 1)، إضافة إلى هيدروكسيد الصوديوم 0.5M هذا الحل الكولاجين حتى كولو ردي فاتحوتشير R الرقم الهيدروجيني من 7.5. مزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا وتجنب تكوين فقاعة. ثم يضاف مزيج Matrigel ولكن بلطف جدا بدقة. وأخيرا، إضافة إلى خليط GM الكولاجين / Matrigel (على الكميات المناسبة انظر الجدول 1).

ملاحظات: - تنفيذ كل خطوة على الجليد! سوف Matrigel والكولاجين هلام بسهولة في زيادة درجة الحرارة.
- مراعاة أن اللون الوردي هو في الواقع! وزيادة في درجة الحموضة حمل أيضا دبق السريع.
- تركيز النهائي من الكولاجين: 1.6 ملغ / مل.

  1. أجهزة الطرد المركزي المبلغ المطلوب من الخلايا في 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق وإزالة طاف.

ملاحظة: - اعتمادا على نشاط الخلايا عدد الخلايا في بناء يحتاج إلى تعديل. عادة، وعدد من الخلايا تقع بين 750،000 و 1250000 الخلايا في بناء.

  1. استخدام بعض من خليط جل ل resuspend بيليه الخليةونقل الخلايا إلى الخليط المتبقي وتخلط جيدا، ولكن دون إدخال فقاعات الهواء.
  2. تأخذ لوحات محمى بشكل جيد للخروج من الحاضنة وماصة 0.35 -0.4 مل من الخليط خلية جل في أول الفيلكرو. ثم، والبدء في ماصة الخليط من وسط بين المواقع المرفقات وتمتد إلى الفيلكرو. وأخيرا، استخدام ما تبقى من هلام لتملأ الفجوة بين اثنين والمراسي الفيلكرو ماصة حول قطع الفيلكرو.
  3. تحقق بعناية بعد 5-10 دقيقة إذا كان الهلام صلبة بما فيه الكفاية على أن يتم تحويلها، أي الاستفادة بلطف الأطباق وتفتيش بصريا إذا كان جل جامد. إذا كان الأمر كذلك، بعناية ضع الأطباق في حاضنة. عادة، يمكن اعتقلوا بعد عشر دقائق. ثم، وبعد ساعة 1-2، تراكب بلطف كل هلام مع 4 مل من GM الدافئة.

ملاحظة:-لا تجعل أي حركات قوية عند التعامل مع لوحات.

  1. استبدال GM من تمايز المتوسطة (متوسطة النمواستخراج الجنين دون كتكوت) بعد 24 ساعة، واستبدال المتوسطة جديدة كل 2-3 أيام. على يوم واحد 7 وأن يكون حاصلا كنت ناضجة ألياف العضلات المنحى، كما يمكن تقييم مع تلطيخ للتنمية تثليم عبر ألياف العضلات في تنصهر.

3. التحفيز الكهربائي

  1. تعقيم الأقطاب من لوحة ionoptix (انظر الجدول الكواشف والمعدات) قبل استخدامه مع الايثانول 70٪ والجافة في وقت لاحق تحت الأشعة فوق البنفسجية في خزانة السلامة. وضع لوحة الأقطاب الكهربائية مع الثقافة على طبق مع البنى وتغطية مع غطاء من لوحة الثقافة ونقلها إلى الحاضنة. توصيل Ionoptix C-محدد السرعة مع الكابلات المناسبة.

ملاحظة: يتم وضع أقطاب متوازية جنبا إلى جنب مع بناء العضلات (الشكل 2).

  1. تطبيق بروتوكول التحفيز كما كان متوقعا.

ملاحظة: نحن نستخدم عموما 4 V / CM،6ms البقول على تردد 2Hz. تغيير ثقافة المتوسط ​​على مدار 24 ساعة خلال كل التحفيز.

النتائج

وسوف يكون المنتج النهائي يبني العضلات كما هو مبين في الشكل 3. فإن حجم الأنسجة تكون حوالي 8 مم، 2 مم واسعة و 0.5 مم. سوف التحفيز الكهربائي خلال التمايز تغيير التعبير عن الأشكال الإسوية الميوسين السلسلة الثقيلة، ولكن لا يعزز إلى حد كبير عملية التمايز والناجمة عن ت...

Discussion

الهندسة من الأنسجة العضلية لديها امكانات كبيرة لاستخدام كنموذج المرض، لفحص المخدرات، في الطب التجديدي وإنتاج اللحوم. ومع ذلك، فإن المتطلبات لهذه التطبيقات تختلف. اخترنا العمل مع مجموعة من الكولاجين وmatrigel، لأن الكولاجين يسمح لمحاذاة الخلية ولأن الخلايا الاصلية myobla...

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

كان الكتاب أن أشكر Yabin وو لزراعة الأنسجة المعروضة في الشكل 2، التقاط الصورة من قبل بارت فان Overbeeke. والدعم المالي لعمل SenterNovem، ومنحة ISO 42022.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة كتالوج رقم التعليقات (اختياري)
تخفيض Matrigel-عامل النمو بيكتون ديكنسون و
DMEM (ارتفاع نسبة الجلوكوز) * Gibco 42430
المتقدمة DMEM Gibco 12491
الحصان مصل Gibco 65050-122
المصل البقري الجنين غرينر 758075
0.45 و 0.22 ميكرون حقنة مرشح * Whatmann (شلايشر وScheull) 10462100
الجلوتامين L- Gibco 25030024
البنسلين / الستربتوميسين Gibco 10378016
الأمفوتريسين Gibco 15290-018
ثقافة البلاستيك غرينر يتضمن قوارير الثقافة وماصات
فرخ الجنين استخراج الولايات المتحدة الأمريكية البيولوجي C3999
باستور ماصة * Hilgenberg ماصات باستور، مع انقباض، مع والقطن L تلميح فتح: قطر 230 مم مع غيض من 0،9 - 1،1 مم
باستور ماصة * Hilgenberg ماصات باستور، مع انقباض، مع والقطن L تلميح فتح: قطر 230 مم مع غيض من 1،4 - 1،6 مم
ماصة باستور VWR 612-1702
النوع الأول كولاجيناز* سيجما C0130-16
40 ميكرومتر مصفاة الخلية * BD الصقر 352340
19G إبرة
الاستومر شركة داو كورنينج 3097358-1004 حية مزروعة سيلوستيكيا MDX 4-4210 #
علاج وكيل شركة داو كورنينج حية مزروعة سيلوستيكيا MDX 4-4210 #
الفيلكرو متجر العادية يمكنك شراء هذا في متجر العادية، فقط استخدام الجانب لينة
الكولاجين النوع الأول، وذيل الفئران BD العلوم البيولوجية 3544236
C-EP بيس محدد السرعة الثقافة Ionoptix
الأطباق ثقافة 6 جيدا لالتحفيز الكهربائي تيروkton ديكنسون، فالكون BD الصقر # 353846
C-الطبق أقطاب الثقافة طبق Ionoptix
* مطلوب لعزل الخلايا (نقطة 1.1)
# معا في مجموعة واحدة

References

  1. Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle. Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).
  2. Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).
  3. Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
  4. Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).
  5. Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
  6. Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle. Tissue Eng. Part A. , (2011).
  7. Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells. Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).
  8. Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).
  9. van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF. Tissue Eng. Part A. , (2011).
  10. Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway. J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).
  11. Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
  12. Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).
  13. Li, Y., Pan, H., Huard, J. Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues. J. Vis. Exp. (41), e2011 (2010).
  14. Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering. J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).
  15. Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).
  16. Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC. , (2013).
  17. Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).
  18. Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

73 myoblasts Matrigel

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved