JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويعرض هذا البروتوكول إجراء كاملة ومفصلة لتطبيق RNA-يليها، قوية تكنولوجيا الحمض النووي من الجيل التالي تسلسل، لtranscriptomes الشخصي في خلايا الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الرئوي البطانية مع أو بدون العلاج ثرومبين. هذا البروتوكول هو تعميم لمختلف الخلايا أو الأنسجة المتضررة من الكواشف المختلفة أو الحالات المرضية.

Abstract

توصيف التعبير الجيني في الخلايا عن طريق قياس مستويات مرنا هو أداة مفيدة في تحديد كيفية تأثر الجهاز النسخي للخلية بواسطة إشارات خارجية (على سبيل المثال العلاج من تعاطي المخدرات)، أو كيف تختلف الخلايا بين حالة صحية ودولة مريضة. مع ظهور والتحسين المتواصل لتكنولوجيا DNA الجيل القادم التسلسل، أصبح RNA-التسلسل (RNA-يليها) وسيلة شعبية متزايدة لتحليل transcriptome الى الدليل كافة أنواع النصوص، لتحديد هيكل الترانسكربتي من جميع الجينات التي أعرب عنها وتحديد ل مستويات التعبير المتغيرة للمجموعة مجموع النصوص في الخلية 1،2، أو الأنسجة كائن معين. RNA-يليها إلى تغييره بالتدريج ميكروأرس DNA كأسلوب مفضل للتحليل transcriptome لأنه يحتوي على مزايا أنشأ حسابا باسم transcriptome كاملة، وتوفير نوع مسند الرقمية (عدد نسخة من أي نص) وليس الاعتماد على أي sequen الجيني المعروفةم 3.

هنا، نقدم بروتوكول كاملة ومفصلة لتطبيق RNA-يليها لtranscriptomes الشخصي في خلايا الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الرئوي البطانية مع أو بدون العلاج ثرومبين. ويستند هذا البروتوكول على دراسة حديثة نشرت لدينا بعنوان "RNA-يليها يكشف Transcriptome الرواية الجينات والأشكال الإسوية خلايا الاوعية الدموية الدقيقة في الإنسان الرئوي غشائي المعالجة مع الثرومبين،" 4 التي نفذنا بنجاح أول تحليل transcriptome كاملة من خلايا الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الرئوي البطانية تعامل مع الثرومبين باستخدام RNA-يليها. أسفرت موارد تكنولوجيا المعلومات لم يسبق لها مثيل لمزيد من التجارب للحصول على أفكار في الآليات الجزيئية الكامنة ثرومبين بوساطة ضعف البطانية في التسبب في حالات الالتهابات، والسرطان، والسكري، وأمراض القلب التاجية، ويوفر إمكانية خيوط جديدة الأهداف العلاجية لتلك الأمراض.

النص الوصفي من هذا البروتوكولوينقسم إلى أربعة أجزاء. الجزء الأول يصف العلاج للخلايا الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الرئوي البطانية مع الثرومبين والعزلة RNA، والتحليل الكمي والجودة. الجزء الثاني يصف بناء مكتبة والتسلسل. الجزء الثالث ويصف تحليل البيانات. الجزء الرابع يصف مقايسة التحقق من صحة RT-PCR. يتم عرض نتائج ممثلة من الخطوات الرئيسية عدة. وتقدم نصائح مفيدة لتعزيز الاحتياطات أو النجاح في الخطوات الرئيسية في قسم المناقشات. على الرغم من أن هذا البروتوكول يستخدم الرئوي الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الخلايا البطانية تعامل مع الثرومبين، يمكن أن يكون تعميمها على transcriptomes الشخصي في كل من خلايا الثدييات وغير الثدييات والأنسجة في التعامل مع محفزات مختلفة أو مثبطات، أو لمقارنة transcriptomes في الخلايا أو الأنسجة بين حالة صحية ودولة المرض.

Protocol

يتم عرض مخطط يحدد هذا البروتوكول في الشكل 1.

1. علاج الخلايا مع الثرومبين، RNA العزلة، وتقييم جودة الكمي لRNA

  1. ثقافة الاوعية الدموية الدقيقة الرئة الخلايا البطانية الإنسان (HMVEC-LBL) لالتقاء 90-100٪ في 6 وحات جيدة في EGM-2 مع المتوسط ​​5٪ FBS، عوامل النمو والمضادات الحيوية (Lonza، القط # CC-3202).
  2. تغيير وسائل الاعلام الى وسائل الاعلام المجاعة (0٪ FBS) 30 دقيقة قبل العلاج مع ثرومبين.
  3. علاج الخلايا مع 0.05 U / مل الثرومبين أو ترك دون علاج كعنصر تحكم لمدة 6 ساعة عند 37 ° C و 5٪ CO 2.
  4. عزل الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا المعالجة والتحكم باستخدام مير Ambion فانا عدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  5. تقييم نوعية RNA مع رقاقة StdSense Experion RNA حقيقية النواة وفقا للبروتوكول قياسي الكهربائي على محطة Experion الآلي (= "_blank"> www.bio-rad.com).
  6. قياس الحمض النووي الريبي باستخدام أسلوب قياسي الطيفي.

2. مكتبة البناء وتسلسل

  1. استخدام 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع ذات جودة عالية لكل عينة عن بدء المادية.
  2. لبناء المكتبة، اتبع الإجراء القياسي من البورشيد (البروتوكول # 15008136 القس A). في هذا البروتوكول، جولتين من بولي (A) يتم إجراء التحديدات التي تحتوي مرنا لإزالة الرنا الريباسي للحد من تسلسل الرنا الريباسي.
  3. تقييم جودة المكتبات باستخدام رقاقة الحمض النووي Experion 1K وفقا لبروتوكول قياسي الكهربائي على محطة Experion الآلي ( www.bio-rad.com ).
  4. قياس مكتبة باستخدام qPCR: استخدام المكتبة التي سبق التسلسل كما منحنى القياسية والاشعال محددة لمحولات ligated. استخدام مجموعة من التخفيفات من مكتبات غير معروف (أي 1:100، 1:500 و1:1،000). تشغيل ACCO qPCRrding في البروتوكول MM SyberGreen وحساب تركيز المخزون الأصلي من كل مكتبة.
  5. تمييع الأسهم مكتبة إلى 10 نانومتر وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى جاهزة للكتلة خلية تدفق.
  6. عندما تصبح مستعدة لخلية تدفق الكتلة، ذوبان الجليد لوحة كاشف CBOT في حمام مائي. CBOT أداة تستخدم البورشيد لتبسيط عملية توليد الكتلة.
  7. غسل الصك CBOT.
  8. تفسد المكتبات: الجمع بين ميكرولتر 1X 13 TE ميكرولتر و 6 10 و مكتبة ميكرومتر، إلى جانب الأنبوب، إضافة 1 ميكرولتر 1 N هيدروكسيد الصوديوم (التي قدمها البورشيد). دوامة، وتدور إلى أسفل، احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ووضع المكتبات التشويه والتحريف على الجليد.
  9. يخفف من المكتبات: مكتبات تمييع مع العازلة التهجين التشويه والتحريف ما قبل المبردة (HT1، التي تقدمها البورشيد) من خلال الجمع بين 996 و 4 ميكرولتر HT1 ميكرولتر مكتبة التشويه والتحريف لتركيز النهائي من 12 مساء. وضع المكتبات التشويه والتحريف والمخفف على الجليد.
  10. عكس كل صف من الأنابيب لوحة CBOT،ضمان إذابة كل الكواشف. تدور أسفل لوحة، إزالة / ثقب الأختام احباط وتحميله إلى CBOT.
  11. قسامة 120 ميكرولتر من المكتبات، والمخفف التشويه والتحريف لأنبوب قطاع، وصفت 1-8. تضيف 1.2 ميكرولتر المخفف، ومراقبة PhiX التشويه والتحريف مكتبة (من البورشيد) في كل أنبوب وتصاعد في السيطرة. وتدور دوامة أسفل أنابيب وتحميلها على CBOT في الاتجاه الصحيح (أنبوب # 1 إلى اليمين).
  12. تحميل خلية تدفق ومتعددة على وCBOT.
  13. استكمال فحص وتدفق على المدى تبدأ المجموعات.
  14. بعد اكتمال التشغيل، تحقق التسليم في جميع الممرات كاشف. دون أي تشوهات. بدء إما على المدى التسلسل مباشرة أو تخزين الخلية في أنبوب تدفق المقدمة في C. ° 4
  15. ذوبان الجليد في تسلسل على حدة التوليف (SBS، البورشيد) الكواشف.
  16. تحميل الكواشف إلى المناطق المناسبة على الصواني كاشف، والتأكد من عدم لمس الكواشف الأخرى بعد لمس مزيج الانقسام.
  17. باستخدام أيN-التسلسل خلية تدفق (أي تلك التي كانت في السابق التسلسل)، رئيس وخطوط كاشف مرتين.
  18. تنظيف شامل لخلية تدفق التسلسل مع EtOH 70٪ وKimwipes، تليها EtOH 70٪ ورقة العدسة. تفقد الخلية التدفق لأي الشرائط. إعادة تنظيفه إذا لزم الأمر.
  19. تحميل خلية تدفق على التسلسل وإجراء فحص تدفق للتأكد من أن الختم بين الفتحات وخلية تدفق ضيق.
  20. بدء تشغيل التسلسل.
  21. تقييم مقاييس الجودة (مثل كثافة الكتلة، مجموعات تمرير مرشح، Q30، وكثافة) عندما تصبح متاحة خلال الفترة السابقة.
  22. رصد كثافة في جميع أنحاء المدى.
  23. بعد الانتهاء من 101 دورات، نفذ الكيمياء تحول لإكمال الثانية كما يلي: ذوبان الجليد في نهاية الاقتران الكواشف وإدماج الاحتياطي قراءة الثاني (ICB، وهو مكون من الكواشف SBS، البورشيد) وتحميل الكواشف.
  24. تواصل على المدى التسلسل، وتقييم شدة 2 الثانية قراءة، وQ30مقاييس الجودة الثانية الأخرى ومع تقدم التشغيل.

3. تحليل البيانات

  1. استخدام أحدث إصدار من CASAVA (البورشيد، حاليا 1.8.2) لتحويل الملفات مكالمة قاعدة (. BCL) الملفات إلى ملفات fastq.، ووضع fastq للمجموعة العد إلى 0 لضمان إنشاء ملف واحد لfastq كل عينة . بفك الملفات fastq لتحليل المصب.
  2. أداء المقترنة باستخدام المحاذاة نهاية الإصدارات الأحدث من TopHat (1.4.1) 5، والتي تؤيد RNA-يليها يقرأ لالثدييات بحجم الجينوم باستخدام فائقة الإنتاجية العالية اليجنر قراءة قصيرة (بووتي، 0.12.7) 6 و SAMtools (0.1. 17) 7. SAMtools تنفذ المرافق المختلفة لمرحلة ما بعد المعالجة التحالفات في شكل SAM. يمكن تحميل transcriptome مرجعية الإنسان من iGenomes ( www.illumina.com ). في إدارة TopHat، استخدمنا كافة الإعدادات الافتراضية المعلمة بما في ذلك مكتبة نوع الخيار كما FR-unstranded (افتراضي).
  3. لناجي في برنامج CuffDiff، وهي جزء من أزرار أكمام (1.3.0) 8 حزمة البرامج، قارن الخلايا ثرومبين المعالجة إلى الخلايا ضوابط لحجب النصوص الجينات أعرب تفاضلي في السابق على أساس مرجعية transcriptome الإنسان. هذه المقارنة بالكشف عن التعبير الفرق النصوص المعروفة. استخدام Microsoft Excel لتصور النتيجة في شكل جدول. في تشغيل أزرار أكمام البرنامج، استخدمنا كافة الإعدادات الافتراضية المعلمة. هذه النصوص الجينات مع FPKM <0.05 و p> يتم تصفيتها من 0،05.
  4. للكشف عن الأشكال الإسوية الرواية، تشغيل بدون أزرار أكمام transcriptome المرجعية. مقارنة الملفات نص عينة إلى إشارة الجينوم باستخدام Cuffcompare واختبار التعبير الفرق مع Cuffdiff باستخدام نسخة ثرومبين مجتمعة الملفات كما الجينوم مرجعية واحدة وتحليل نص السيطرة المشتركة الملفات كما الجينوم مرجعية للتحليل الثاني. استخدام Microsoft Excel لتصور النتيجة في شكل جداول. مرة أخرى، THOSمحاضر الجين ه مع FPKM <0.05 و p> يتم تصفيتها من 0،05. بعد هذه الخطوة، قد تختار المحققين لتحميل قائمة النصوص التي أبلغ عنها حديثا إلى موقع الجينوم UCSC متصفح ( http://genome.ucsc.edu/ ) للتحقق من صحتها من قبل التفتيش اليدوي.
  5. تقديم قوائم الجينات أعرب تفاضلي لتحليل المسارات الإبداع (IPA، www.ingenuity.com ) لتوصيف الجينات والمسارات المتضررة من العلاج ثرومبين. في هذه الخطوة، قد تختار لاستخدام المحققين CummeRbund ( http://compbio.mit.edu/cummeRbund/ )، حزمة R التي تم تصميمها لمساعدة وتسهيل مهمة تحليل RNA-أزرار أكمام يليها الإخراج، للمساعدة في إدارة والتخيل ودمج جميع البيانات التي تنتجها تحليل Cuffdiff.

4. المصادقة على النتائج RNA-يليها من الكمية بو في الوقت الحقيقيlymerase سلسلة من ردود الفعل (QRT-PCR)

  1. أداء مجموع RNA بمعزل عن السيطرة والمعالجة ثرومبين HMVEC-LBL الخلايا، RNA RNA نوعية التقييم والقياس الكمي موضح في الخطوات 1،4 حتي 1،6.
  2. توليد DNA مكملة من الحمض النووي الريبي ميكروغرام 1 المجموع من كل عينة III مع أطقم مرتفع التجميعي الأول حبلا RT النظام، باتباع إرشادات الشركة المصنعة (إينفيتروجن، 18080-051).
  3. أداء QRT-PCR تحليل النظم البيولوجية التطبيقية على ViiA 7 نظام PCR في الوقت الحقيقي باستخدام Taqman الفحص عند الطلب أليغنوكليوتيد] مصممة للكشف عن، CUGBP Elav-likefamilymember1 (CELF1، Hs00198069_m1)، Fanconianemia، complementationgroupD2 (FANDCD2، Hs00276992_m1)، TNFreceptor المرتبطة عامل 1 (TRAF1، Hs01090170_m1)، وβ أكتين-(ACTB، Hs99999903_m1). كان كل عينة قالب يعادل 5 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع. قياس الكميات باستخدام طريقة DDCt وتطبيع للأكتين-β. تم إجراء الفحص عبر كل ثلاثة على الأقل البيولوجية مكررات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

لخطوة 1: 28S: يستخدم تقليديا 18S نسبة كمؤشر على تدهور RNA. ومن الناحية المثالية، ذروة 28S يجب أن يكون حوالي ضعف مساحة الفرقة 18S (نسبة 2)، ولكن هذا في كثير من الأحيان لا ينظر النسبة المثالية من الناحية العملية. وعلاوة على ذلك، 28S: يمكن الحصول عليها من نسب 18S طرق طيفية نقل?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الخطوات الرئيسية

التعامل مع RNA: RNases سوف تتحلل حتى أكثر عالية الجودة RNA، لذلك يجب توخي الحذر خلال العزلة، تخزين واستخدام RNA 10. يتم ارتداؤها دائما قفازات لمنع التلوث من RNases العثور على الأيدي البشرية. يجب تغيير القفازات ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور ستيفن Kingsmore والطب الجينوم مركز طب الأطفال في مستشفيات الرحمة للأطفال وعيادات لاستخدام مجموعات الحوسبة من أجل تحليل البيانات المتوفرة لدينا، البورشيد لفريق الخدمة الميدانية (اليزابيث بوير، كوك سكوت وكوك مارك) والتقنية فريق استشاري لردودها سريعة ومقترحات مفيدة على التوالي الصك الجيل القادم التسلسل DNA، HiScanSQ، وتحليل البيانات النوعية. وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح HL080042 (لSQY) وبدء صندوق الوقف للمستشفيات والرحمة للأطفال وعيادات. جامعة ميسوري في مدينة كنساس (لSQY)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
الكواشف أو معدات شركة كتالوج رقم تعليقات
خلايا الاوعية الدموية الدقيقة الرئة الإنسان غشائي Lonza CC-2815
Lonza، كيت رصاصة Lonza CC-3202 يحتوي EGM-2، FBS، عوامل النمو والمضادات الحيوية
ثرومبين سيجما T4393
Ambion مير فانا كيت الحياة تكنولوجيز 1560 AM
ريبونوكلياز-زاب الحياة تكنولوجيز AM9782
Experion StdSens RNA بيو راد 700-7103
TruSeq RNA إعدادعدة البورشيد FC-122-1001
الخرز AMPureXP بيكمان كولتر A63881
مرتفع عكس المنتسخة II الحياة تكنولوجيز 18064-014
Experion DNA 1K بيو راد 700-7107
QuantiTect SyberGreen QIAGEN 204163
PE الكتلة الجيل كيت البورشيد PE-401-3001
PhiX التحكم كيت البورشيد FC110-301
200 دورة SBS كيت البورشيد FC-401-3001
HiScanSQ * البورشيد SY-103-2001
CBOT البورشيد SY-301-2002
qPCR آلة - Viia7 الحياة تكنولوجيز نموذج # VIIA7 / 10631261 # المعدات أو ما يعادلها
Experion نظام راد الحيوي 7007001 Bioanalyzer هو نظام بديل
الطيف الحيوي تك عصر صفيحة ميكروسكوبية الطيف أو ما يعادلها
الطرد المركزي - الكتب التي أسطورة XTR الحرارية العلمية 75004521 أو ما يعادلها
موقف المغناطيسي الحياة تكنولوجيز AM10027
96-جيدا thermocycler مختبر مزود العامة
الجدول 3. قائمة الكواشف الرئيسية وE الرئيسيةquipment. *، وفي شريط الفيديو، وقد تجلى HiSeq1000 بدلا من HiScanSQ.

References

  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
  3. Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays. Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).
  4. Zhang, L. Q., et al. RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin. PLoS One. 7, e31229(2012).
  5. Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq. Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).
  6. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10, R25(2009).
  7. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  8. Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).
  9. Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges. PLoS Comput. Biol. 8, e1002375(2012).
  10. Nielsen, H. Working with RNA. Methods. Mol. Biol. 703, 15-28 (2011).
  11. Trapnell, C., et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).
  12. Robertson, G., et al. De novo assembly and analysis of RNA-seq data. Nat. Methods. 7, 909-912 (2010).
  13. Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq. Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).
  14. Martin, J. A., Wang, Z. Next-generation transcriptome assembly. Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

72 RNA Transcriptome DNA RT PCR PCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved