الخلوي الجماعي: بروتوكول لضبط اليومية وعينات الخلايا تشغيل عداد الكريات الشامل على CyTOF

Summary

يتم وصف الخطوات الضرورية لضبط اليومية والاستفادة المثلى من أداء عداد الكريات الشامل CyTOF. وتناقش التعليقات على إعداد العينات ومعدل التدفق الأمثل

Abstract

في السنوات الأخيرة، وتحليل السريع للخلايا واحدة وعادة أجريت باستخدام التدفق الخلوي والأجسام المضادة التي تحمل علامات fluorescently. ومع ذلك فقد حد مسألة التداخل الطيفي للانبعاثات fluorophore عدد من التحقيقات في وقت واحد. في المقابل، فإن كتلة CyTOF جديدة عداد الكريات من قبل الأزواج العلوم DVS السائل نظام إدخال وحيدة الخلية إلى ¹ ICP-MS. وبدلا من fluorophores، تقترن البوليمرات التي تحتوي على نظائر المعادن مخلبية عالي التخصيب إلى الأجسام المضادة أو تحقيقات أخرى محددة. ^2-5 بسبب نقاء المعدن والقرار الجماعي للعداد الكريات الشامل، وليس هناك "تداخل الأطياف" من النظائر المجاورة، وبالتالي لا حاجة للمصفوفات التعويض. بالإضافة إلى ذلك، ونظرا لاستخدام المعادن اللانثينيدات، وليس هناك خلفية البيولوجية وبالتالي لا يعادل تألق ذاتي. مع نافذة تمتد الشامل الكتلة الذرية 103-203، نظريا يمكن تمييز ما يصل الى 100 في وقت واحد التسميات. حاليا، أكثر من 35 قنوات متاحة باستخدام الكواشف مخلبية المتاحة من العلوم DVS، مما يسمح للتشريح لم يسبق لها مثيل من الملف المناعية من العينات. ^6-7

عيوب لكتلة الخلوي تتضمن شرط صارمة لنظائر المعادن منفصلة في التحقيق (لا يعادل مبعثر إلى الأمام أو الجانب)، وحقيقة أنها هي تقنية المدمرة (أي إمكانية لاستعادة الفرز). التكوين الحالي للعداد الكريات الشامل لديها أيضا معدل نقل خلية من خلايا فقط ~ 25٪، مما يتطلب إدخال عدد أكبر من الخلايا.

الأداء اليومي الأمثل للعداد الكريات الشامل يتطلب العديد من الخطوات. الهدف الأساسي من التحسين هو تعظيم قوة إشارة المقاسة من نظائر المعادن المطلوب (M) مع التقليل من تشكيل أكاسيد (M +16) التي من شأنها أن تقلل من شدة إشارة M وتتداخل مع أي إشارة المرجوة في M +16. الخطوة الأولى هي عملية الاحماء الجهاز بحيث ساخنة، وأنا مستقرةوقد أنشئت CP البلازما. الثانية، يجب أن يكون الأمثل للإعدادات الحالية والمكياج معدل تدفق الغاز على أساس يومي. خلال جمع العينات، ويقتصر هذا الحدث من قبل خلية الحد الأقصى لمعدل الكفاءة للكشف عن وسرعة المعالجة إلى 1000 خلية / ثانية. ومع ذلك، وهذا يتوقف على نوعية العينة، حدث تباطؤ معدل الخلية (300-500 خلية / ثانية) وعادة ما يكون من المرغوب فيه السماح أفضل قرار بين الأحداث الخلايا، وبالتالي تحقيق أقصى قدر من singlets سليمة أكثر من الحلل والحطام. وأخيرا، وتنظيف كافية للآلة في نهاية اليوم يساعد على التقليل من إشارة الخلفية بسبب معدنية مجانية.

Protocol

يجب أن تكون ثابتة جميع العينات الخلية لCyTOF وpermeabilized. وهذا يتيح قدر أكبر من دخول intercalator DNA التي تحتوي على الإيريديوم، ويمنع أيضا تحلل الخلايا خلال غسل الماء MilliQ والخطوات إعادة تعليق على الفور من قبل عن طريق الحقن في عداد الكريات الشامل.

1. بدء قداس للعداد الكريات

1. فتح برنامج حاسوبي CyTOF. حدد إعداد الصك. على علامة التبويب بطاقة كيج، انتقل إلى الزاوية اليمنى السفلى وفوق سخان "ON" الزر. تشغيل المدفأة على الأقل 15 دقيقة قبل الوقت المطلوب لإتاحة الوقت الكافي للعباءة غرفة الرش لتصل إلى 200 ° C.
2. استبدال الأبيض القواعد والمعايير Ject حقنة مل 3 في مضخة الحقنة مع حقنة جديدة مملوءة بالماء MilliQ.
3. تنظيف البخاخات. Backflush والبخاخات باستخدام حقنة وأنابيب لسحب 5٪ citranox 2-3 مرات خلال كل من ميناء مقدمة أصغر السائل وإدخال الغاز أكبر الموانئ. تكرار backflushing مع MilliQ المياه رس إزالة citranox المتبقية.
4. تحقق للتأكد من أن تضاء الأضواء على اللوحة الأمامية للCyTOF كما في الشكل (1).

الرقم وحة CyTOF 1. أضواء قبل بدء التشغيل.

5. فتح صمام خزان الغاز الأرجون. وهذا ينبغي أن يؤدي إلى "ARGON" الضوء على الجبهة لتشغيل.
6. إرفاق البخاخات لالمكياج مدخل الغاز. فك المكياج الغاز موصل الأنابيب وإزالة المطاط الأسود يا الدائري وقطعة من البلاستيك الأبيض المخروطية. ملاحظة الأوسع نطاقا "برجمة" على المنفذ الجذعية الغاز مقدمة من البخاخات. وضع موصل على منفذ إدخال الغاز. وضع الأسود يا الدائري على نهاية ميناء الغاز، وفرض يا الدائري الماضي على نطاق أوسع جزء من جذع الميناء. ضع قطعة من البلاستيك الأبيض على رأس مخروطي مع نهاية الضيقة اشار الى ان والمسمار أنابيب الغاز على الماكياج.
7. إرفاق البخاخات لأنابيب إدخال السائل. إدراج بعناية أنابيب صغيرة داخل فتحة في نهاية البخاخات. سيكون هناك توقف اثنين، مماثلة في ليشعر يتوقف على micropipettor. أولا، اضغط حتى يتم تلبية المقاومة الخفيفة؛ نهاية الأنبوب الصغير يجب أن يكون في نهاية المقطع مباشرة من الزجاج. الثانية، اضغط أصعب لإجبار نهاية الجزء المستقيم من الزجاج الى مزيد من المناسب، وتشديد المسمار المناسب لاغلاق. إدراج نهاية رذاذة في افتتاح الأبيض في عباءة التدفئة.
8. في علامة التبويب تحكم RFG من الصك إطار الإعداد، اضغط على "ابدأ البلازما". منذ يتم إدراج بالفعل البخاخات، اضغط على "OK". يقوم البرنامج بتشغيل المبرد، وبدء تدفق الغاز، وإشعال البلازما. والجهد للكشف عن تكثيف. سيكون هناك نافذة منبثقة قائلا "البلازما بدء تسلسل انتهت بنجاح" عند الانتهاء؛ اضغط على "OK". يجب أن تكون أضواء جديدة على اللوحة الأمامية في (الشكل 2 >).

الشكل 2. أضواء لوحة CyTOF بعد البلازما وأشعلت بدء بنجاح.

9. تشغيل مضخة الحقنة. في الزاوية العلوية اليمنى، اضغط على الأخضر "مسرحية" زر لبدء ضخ حقنة ويبدأ تدفق السائل من خلال أنابيب والرش من البخاخات. الإعدادات الافتراضية هي حقنة لمدة 3 مل من الماء. من أجل العينة أن تتدفق من خلال حلقة العينة، يجب ضخ حقنة تغيرت بشكل دوري عندما نفدت المياه. في الجزء العلوي من الشاشة، هناك عداد يشير إلى مدى السائل قد تدفقت من مضخة الحقنة. فإن مضخة محقنة تتوقف عند هذا العداد إلى "3،000" أو المكبس ويضرب نهاية الحقنة. عند إعادة تعبئة الحقنة، يجب ضرب "توقف" بدلا من الأزرق "وقفة" زر لإعادة تعيين العداد.

ه "2>. معايرة عداد الكريات اليومية لقداس

1. سوف تحتاج ما يقرب من عداد الكريات الشامل 20 دقيقة لتحقيق الساخنة، والبلازما مستقرة قبل المعايرة. الغرض من الخطوات لتحقيق أقصى قدر من ضبط إشارة المرجوة من Tm169 أو Tb159 مع الحفاظ على "Gd155" (أكسيد؛ La139 + Ø16) إشارة أقل من 3٪ من قيمة أعلى. انقر فوق الزر إعدادات اقتناء لفتح نافذة إعدادات اقتناء البيانات. في علامة التبويب Analytes، انقر فوق الجدول الدوري لفتح لوحة اختيار النظير. تحديد النظائر في ضبط DVS حل العلوم المدرجة في الدليل، انقر فوق "حفظ".
2. انقر فوق نظائر لكل قراءة الزر لفتح القداس (ES) لكل إطار القراءة. حدد "البقول عدد"، وإعادة مقياس ذ محور عن طريق إدخال رقم جديد والضغط على "دخول".
3. ملء الأخضر 1 مل القواعد والمعايير Ject المحاقن مع حل ضبط. تحويل ميناء محدد لعينة "تحميل"، وضخ 450 ميكرولتر من حل ضبط، ثم قم بتشغيل محدد إلى "حقن". في القداس علامة التبويب معايرة البيانات Acquisit أيون إعدادات النافذة، اضغط على "تشغيل" لمراقبة الجماهير التي تتدفق من قبل. الجانب الأيسر من النافذة أقل الشامل، في حين أن الجانب الأيمن أعلى الشامل. ملاحظة: سيكون هناك بالفعل إشارات في المنطقة 9400-9800 TOF، وذلك بسبب نظائر الزينون في غاز الارجون (الشكل 3). الانتظار حتى حل ضبط النظائر تبدأ في الظهور كما الشرائط في هذا العرض (الشكل 4).

الرقم معايرة الكتلة 3. نافذة علامة التبويب، يظهر أن مستويات الخلفية للنظائر المختلفة بعد حل غسل وشطف المياه. المنطقة المحيطة TOF 9400-9800 نظائر الزينون يتوافق مع غاز الارجون في، ويجب أن تكون دائما موجودة. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

4 "SRC =" / files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg "/>
الشكل 4. نافذة علامة التبويب كتلة المعايرة، والتي تبين الشرائط العمودية لمختلف النظائر في حل ضبط DVS. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

4. العودة إلى القداس (ES) لكل القراءة النافذة واضغط على الاخضر "اللعب" زر في الزاوية اليسرى العليا. يتم تمثيل كل النظائر بتحديده في الخطوة 2.1 في خط بلون مختلف. الافتراضي هو محور س "تايم"، في ثوانى. رصد مستويات من النظائر المختلفة حتى أنها ثابتة.
5. ضبط التيار. في علامة التبويب معلمة من النافذة إعدادات اقتناء البيانات، حدد "التيار" من القائمة المنسدلة. دعونا نبدأ = 0، والانتهاء = 10 قيمة الخطوة، = 0.5، الساعة تسوية = 200، ثم اضغط على "حفظ". انقر مرة أخرى على الكتلة (ES) لكل إطار القراءة واللعب تضررا. المحور س الآن "التيار". ملاحظة الإشارات من حيث ذروة النظائر (الشكل 5)، وص ecord. تحت علامة التبويب إعداد DAC القنوات الصك إطار الإعداد، انتقل لأسفل إلى "التيار" وأدخل هذه القيمة الجديدة. اضغط على "تعيين القيمة الحالية الفعلية"، ثم "حفظ".

الشكل 5. الوضع الحالى ضبط.

6. ضبط للغاز الماكياج. تغيير القائمة المنسدلة ل"الغاز الماكياج." دعونا نبدأ = 0.55 في نهاية = 0.95 قيمة الخطوة، = 0.05، والوقت تسوية = 200. اضغط على حفظ. العودة إلى القداس (ES) لكل إطار القراءة واللعب تضررا. المحور س الآن "الماكياج الغاز" معدل التدفق. تسجيل حيث الإشارات من ذروة النظائر. مراقبة الزيادة السريعة للإشارة "Gd155" قرب نهاية (الشكل 6). العودة إلى علامة التبويب إعداد القنوات DAC، انتقل لأسفل إلى "الماكياج الغاز"، وأدخل هذه القيمة الجديدة. اضغط على "تعيين القيمة الحالية الفعلية"، ثم "حفظ".

igure 6 "SRC =" / files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg "/>
الشكل 6. المكياج الشخصي ضبط الغاز.

7. نسبة تسجيل المطلوب نظير مقابل أكسيد. جعل ثانية حقن 450 ميكرولتر من حل ضبط. في علامة التبويب معلمة، حدد "تايم" من القائمة المنسدلة، دعونا نبدأ = 0، نهاية = 10، قيمة الخطوة = 1، وتسوية الوقت = 200. اضغط على "حفظ". ضرب "مسرحية" في قداس (ES) لكل قراءة النافذة. بعد خطوط استقرت (الشكل 7)، استخدم المؤشر إلى قراءة قيمة في صناديق اليسرى العليا لTm169 أو Tb159 (أعلى قيمة)، وكذلك "Gd155" القيمة (<3٪ من أعلى قيمة). ويمكن أيضا أن يتم حفظ هذه القيم في ملف ضبط للرجوع إليها مستقبلا.

الشكل 7. قياس شدة ضبط إشارة الحل الأمثل بعد الغاز الحالية ومستحضرات التجميل.

8. تنظيف سامPLE حلقة. حقن 3 مل من الماء MilliQ خلال الحلقة العينة، تليها 500 ميكرولتر من محلول غسيل DVS. رصد التقدم المحرز في تنظيف بالضغط على "تشغيل" في القداس علامة التبويب المعايرة. يغسل حتى شدة الشرائط (الشكل 4) تبدأ في التناقص، ثم اتبع بنسبة 3 مل من الماء ورصد MilliQ حتى إلى مستويات الخلفية (الشكل 3).

3. تشغيل العينات

1. فتح إطار اقتناء. الإعدادات الافتراضية: هل تحليل = على ذبابة و، إشارة إلى تحليل = المزدوج، معايرة عدد مزدوج = البيانات. يتم تحديد الحد من الضوضاء. قد يتم تغيير أي من هذه الرغبة. أدخل اسم الملف. يجب حفظ جميع الملفات إلى :/ E / محرك الأقراص.
2. وضع تأخير الشراء. وسوف يكون هناك تأخير طفيف في تسجيل الأحداث خلية من حوالي 30 ثانية بسبب طول الأنبوب بين العينة وحلقة البخاخات و. ولذلك، فإن مجموع "تأخير اقتناء" والحادي والعشرين الكاشف "تأخير القدرة ينبغي "ان تكون على الاقل 30 ثانية. للكشف عن تأخير الاستقرار يجب أن تكون على الأقل 20 ثانية.
3. وضع البيانات في الوقت جمع. "اقتناء الوقت" هو عدد الثواني التي تريد تشغيل عينتك. وشغل كامل 450 حلقة عينة ميكرولتر تتطلب 600 ثانية لإكمال. يقترح أن تضاف 50-100 ثانية إلى نهاية وقت التشغيل لتقليل عينة المرحل.
4. إعادة تعليق من العينة. لتقليل تراكم الأملاح في الجهاز، يقترح أن يتم اثنين على الأقل يغسل في الماء MilliQ في نهاية تلطيخ الخلايا، تليها إعادة تعليق النهائية في الماء MilliQ. استخدام حجم المياه MilliQ ل resuspend بيليه الخلية سوف تختلف اعتمادا على عدد من الخلايا التي بدأت مع وانتعاش الخلايا بعد العملية تلطيخ بأكمله. مكان انطلاق جيدة هو 10 ⁶ (البداية) خلية / مل. بعد إعادة تعليق، تصفية من خلال مصفاة الخلية لإزالة الركام.
5. عينة بدء تشغيل. إدخال اسم ملف جديد للعينة الحالي. تبديل صمام حلقة لعينة "تحميل"، وضخ العينة، والتحول إلى "حقن"، ثم ضرب "تشغيل" في إطار اقتناء.
6. تسجيل الأحداث الخلية. وسيمثل الخلايا في إطار مجموعات لقطة والأفقي للعلامات في كل قناة النظائر / علامة العمودي (الشكل 8). في حين أن عداد الكريات الشامل يمكن تسجيل 1000 خلية / ثانية، وعادة ما يتم الحصول على دقة أفضل بين الأحداث الخلية 300-500 في خلية / ثانية. هذا يتوافق مع ما متوسطه تحديث ~ خلية / شاشة 1. قد يستغرق الأمر ما يصل إلى 30 ثانية قبل العداد الحدث الخلية يبدأ في الصعود. هذا ومن المقرر أن "على ذبابة" معالجة البيانات؛ يتم فقدان أي معلومات الحدث الخلية.

الشكل 8. نافذة اقتناء خلال عينة قيد التشغيل، تظهر صفوف أفقية من البقع المقابلة لعناصر مرتبطة ثلاثة أحداث منفصلة الخلية.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم.

7. نوعية الأحداث الخلية. تلاحظ أي خلفية streaking في كل قناة النظير، وكذلك معدل الحدث الخلية. ويعترف عداد الكريات الشامل "حدث الخلية"، كما بعض الزيادة في إشارة أعلى من الخلفية، لذلك إشارة الخلفية من المعدن أو غير منضم مجانا الأجسام المضادة يمكن أن تغير "الحدث خلية" العد. بالإضافة إلى ذلك، قد تشغيل الخلايا في تركيز عالية جدا وتسبب عددا متزايدا من الأحداث صدرة. يمكن تضاءلت الخلفية بواسطة يغسل إضافية أو مزيد من التخفيف الخلية. يمكن التقليل من الحلل التخفيف قدر أكبر من الخلايا، على حساب زيادة وقت التشغيل.
8. الانتهاء من الحصول على البيانات عينة. عندما تم الوصول إلى الوقت اقتناء، فإن جمع البيانات النهاية. وسوف يكون هناك قليلا من التأخير أمام نافذة منبثقة مع زر "موافق" يظهر، مرة أخرى، هذا ومن المقرر أن "على ذبابة على" معالجة البيانات. ويمكن أيضا الحصول على عينة يمكن وقفها بريماurely من خلال ضرب "إيقاف" الزر. في هذه الحالة، سيتم فرز جميع الأحداث مسجل من قبل الخلية ومعالجتها في الملفات الإخراج.
9. حقن لا يقل عن 500 ميكرولتر من المياه MilliQ بين كل عينة يساعد أيضا تقليل المرحل العينة.

4. تنظيف الجهاز بعد الاستخدام

1. غسل الحل. بعد تشغيل العينة النهائية وحلقة عينة مسح بالماء، وضخ 450 ميكرولتر من محلول الغسيل في حلقة العينة. رصد الإفراج عن المعادن مجانا في القداس علامة التبويب معايرة نافذة إعدادات اقتناء البيانات كما في الخطوة 2.8 (الشكل 9). عندما تكون إشارة معدنية مجانية تبدأ في التناقص، مع 3 بمسح مل من الماء ورصد MilliQ حتى تتحقق المستويات الخلفية.

الرقم معايرة الكتلة 9. نافذة علامة التبويب، خلال آخر تديره التنظيف بمحلول غسيل DVS. الشرائط العمودية في المنطقة TOF 9800-11000 هي الأجسام المضادة التسمية النظائر يجري تنظيفها من الجهاز. الشرائط العمودية حول TOF 11500 تتوافق مع النظيرين intercalator عير. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

5. إغلاق الجهاز

1. في علامة التبويب تحكم RFG من الصك إطار الإعداد، حدد "إيقاف البلازما". عندما اكتمال العملية، سيكون هناك نافذة منبثقة تطلب منك لإزالة غموض. اضغط على "OK". في علامة التبويب بطاقة كيج، إيقاف سخان. إغلاق صمام على توريد الأرجون.
2. إزالة غموض. إزالة غموض من غرفة الرش عن طريق سحب بعناية إلى الوراء. فك مقدمة عينة أنابيب من 1.6 الخطوة ووضع جانبا. فك إدخال الغاز المكياج اتصال لتخفيف قليلا، ثم سحب قبالة البخاخات. وترك ثمل المناسب معا تقلل من فرص Losing المطاط يا الدائري الأسود والأبيض قطعة من البلاستيك مخروطي.
3. تنظيف البخاخات. Backflush كل من موانئ البخاخات مع citranox 5٪ باستخدام حقنة وأنابيب كما في الخطوة 1.3. متجر، يغطي، في citranox 5٪ حتى استخدام المقبل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وينبغي بعد بروتوكول أعلاه إنجاز أربعة أمور. أولا، سوف يسمح كافية الاحماء الوقت للعداد الكريات الشامل إنتاج الساخنة، والبلازما المستقرة اللازمة لإشارة الأمثل والحد الأدنى من تشكيل أكسيد. والثانية، وغسل كافية من المياه مع عداد الكريات الشامل MilliQ وDVS الحل اغسل (ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

على مدى العقود القليلة الماضية، كان التدفق الخلوي مضان طريقة العمود الفقري لتحليل الخلايا واحدة، سواء من حيث التعبير والسطح في المقايسات الفنية. ومع ذلك فقد حد لقضايا التداخل الطيفي لصبغات الفلورسنت عدد علامات في وقت واحد. في حين تم الإبلاغ عن التجارب باستخدام أكثر ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
CyTOF TM الشامل عداد الكريات	DVS العلوم
غسل الحل	DVS العلوم	201071	الهيدروفلوريك حمض 0.05٪ في الماء
ضبط الحل	DVS العلوم	201072	0.5 جزء في المليون لا، خدمات العملاء، السل، TM، الأشعة تحت الحمراء، تتبع حامض النيتريك
الخرز البوليسترين الاتحاد الأوروبي التي تحتوي على	DVS العلوم	201073	يحتوي الطبيعية وفرة النظائر الاتحاد الأوروبي؛ الخرز المقدمة في حوالي 1 مليون / مل
متعددة اللانثينيدات التي تحتوي على (لا / العلاقات العامة / السل / تيم / لو) - الخرز البوليسترين	DVS العلوم	لم المتاحة تجاريا	يحتوي الطبيعية وفرة النظائر من اللانثينيدات المدرجة
حمض النيتريك (مركزة)	فيشر العلمية	A467-500	أوبتيما تتبع معدن نقي ICP-MS الصف
البوليسترين جولة القاع أنبوب مع الخلية مصفاة متوسطة 5mL	BD	352235	تستخدم لتصفية عينات الخلايا قبل الحقن
وضع القواعد وJect tuberkulin حقنة-1ML	هينكه ساس وولف	4010-200V0	خالية من السيليكون، واللثي خالية
وضع القواعد وJect حقنة-3 مل	هينكه ساس وولف	4010.000V0	خالية من السيليكون، واللثي خالية
MilliQ المياه			18 MΩ المياه النقية، ويجب ألا تكون مخزنة في الزجاج أو زجاجات من البلاستيك التي تم غسلها بالمنظفات التجارية (بسبب مستويات عالية من الباريوم الحاضر).
الذكرranox	سيغما الدريخ	Z273236	حمض المنظفات
غاز الأرجون	PRAXAIR	AR-T 5.0UH	99.999٪ فائق النقاء