Cryosectioning المجتمعات الخميرة لفحص أنماط الإسفار

Babak Momeni; Wenying Shou

doi:10.3791/50101

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

نقدم بروتوكول للتجميد وcryosectioning المجتمعات الخميرة لمراقبة أنماط من الخلايا الداخلية الفلورسنت. وتعتمد الطريقة على التلاعب في نتائج الميثانول وOCT-تضمين الحفاظ على التوزيع المكاني للخلايا دون تعطيل البروتينات الفلورية داخل مجتمع ما.

Abstract

الميكروبات تعيش عادة في المجتمعات المحلية. ويعتقد أن التنظيم المكاني للخلايا داخل المجتمع للتأثير على بقاء وظيفة من وظائف المجتمع ^1. وقد أثبتت التقنيات البصرية تقطيع، بما في ذلك الفحص المجهري متحد البؤر واثنين من الفوتون، مفيدة لمراقبة التنظيم المكاني للمجتمعات البكتيرية وarchaeal ^2،3. وقد كشفت مجموعة من مبائر التصوير وباجتزاء المادية للمستعمرات الخميرة التنظيم الداخلي للخلايا ^4. ومع ذلك، فقد كان باجتزاء البصرية باستخدام المجهر متحد البؤر مباشرة أو اثنين الفوتون-فقط قادرة على الوصول إلى طبقات الخلايا قليلة في عمق المستعمرات الخميرة. هذا القيد هو المرجح بسبب تشتت الضوء القوي من خلايا الخميرة ^4.

هنا، نقدم طريقة يعتمد على تحديد وcryosectioning للحصول على التوزيع المكاني للخلايا الفلورسنت داخل المجتمعات خميرة الخباز. نستخدم الميثانول وكيلا مثبتللحفاظ على التوزيع المكاني للخلايا. تنقل خلالها المجتمعات الثابتة مع مجمع OCT، المجمدة، وcryosectioned في ناظم البرد. التصوير مضان من الأقسام يكشف عن التنظيم الداخلي للخلايا الفلورسنت داخل المجتمع.

أمثلة من المجتمعات تتكون من سلالات الخميرة التعبير عن البروتينات الفلورية الخضراء والحمراء تظهر إمكانات الأسلوب cryosectioning للكشف عن التوزيع المكاني للخلايا الفلورسنت وكذلك في التعبير الجيني داخل مستعمرات الخميرة ^2،3. على الرغم من تركيزنا كان على المجتمعات خميرة الخباز، ويمكن يحتمل نفس الأسلوب يمكن تطبيقها على دراسة المجتمعات الميكروبية الأخرى.

Protocol

1. تصحيح المجتمعات الخميرة

تنمية المجتمعات المحلية على الخميرة من غشاء (مثل ميليبور MF غشاء التصفية؛ 2A الشكل). هذا البروتوكول يتوافق مع المجتمع نموذجية من أقل من ⁸ خلايا 2X10 على فلتر غشاء 6 ملم القطر.
استخدام قطعة من الورق 541 WHATMAN مرشح لتغطية الجزء السفلي من وقطره 1 سم جيدا (الشكل 2B). وسوف تستخدم هذه الورقة WHATMAN باعتبارها الناقل لنقل المجتمع في مراحل لاحقة. إضافة 1 مل الميثانول بنسبة 100٪ إلى البئر، وترك البئر في -20 درجة مئوية لدرجة الحرارة للتوازن.
وضع السائل N ₂ في ديوار. تجميد المجتمع في النيتروجين السائل عن طريق غمس المجتمع لما لا يقل عن 15 ثانية في السائل N ₂ باستخدام منتاش (الشكل 2C).
نقل المجتمع المجمدة إلى البئر من الميثانول ° -20 درجة (الشكل 2D). ضمان أن يتم الاحتفاظ المجتمع الأفقي عندما غمر في الميثانول.انتظر 20 دقيقة. غشاء MF تصفية يبدأ في التفكك في الميثانول.
نقل المجتمع باستخدام الناقل WHATMAN 541 ورق الترشيح من الميثانول إلى جانب طبق بيتري الباردة أبقى في -20 درجة مئوية لمدة تبخر الميثانول (2E الشكل). عند نقل، والحفاظ على المجتمع على رأس الناقل WHATMAN تصفية واستخلاص قطرات بعيدا إضافية من الميثانول باستخدام قطعة أخرى من الورق السميك WHATMAN قبل وضع في طبق بتري الباردة. وسوف يضمن هذا الوقت من التبخر يتسق عينة لعينة.
الانتظار 4-6 ساعة حتى لتبخر الناقل WHATMAN مرشح تبدو جافة. تبخر الميثانول المتبقية غير كافية يترك التي تتعارض مع تقطيع. الإفراط في تجفيف أسباب الشقوق وتشوه في المجتمعات المحلية.
تأخذ عينة من الفريزر -20 درجة مئوية. قطع بعيدا WHATMAN 541 رقة الترشيح التي لا تغطيها المجتمع.
جعل مستطيل مكعب الألومنيوم احباط الحاويات التي هي كبيرة بما يكفي بحيث العينة على الأقل ~ هامش مم 2 منكل جانب (الشكل 2F). وضع المجتمع على السطح السفلي من الألومنيوم احباط الحاويات؛ تغطية مباشرة مع عينة أكتوبر إلى 3 ~ 4 مم فوق ارتفاع المجتمع. إذا هامة، ويمكن تعديل اتجاه العينة في هذه الخطوة فيما يتعلق الجانبين من الحاوية. انتظر 10 دقيقة.
ضع عينة OCT-جزءا لا يتجزأ من على لوحة معدنية على الثلج الجاف لتجميد. تخزين المجتمعات المجمدة في -20 -80 ° C أو C ° الثلاجة.

2. باجتزاء المجتمعات مجمدة لتصوير الإسفار

تعيين درجة حرارة الغرفة لC ° cryosection -25 و ترك العينات في غرفة درجة الحرارة حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة.
تحميل عينة الصعود إلى جبل البرد بعد تطبيق قطرة من أكتوبر على الجبل. انتشرت بشكل موحد أكتوبر على جانب عينة مع تعرض رقة الترشيح WHATMAN (قاع الإناء) بحيث أكتوبر سمك 2-3 مم. اسمحوا أكتوبر تجميد داخل غرفة ناظم البرد قبل SEctioning. ضمان هامش أكتوبر من 2-3 مم من كل جانب من العينة يساعد على الحفاظ على سلامة أقسام.
ويمكن استخدام الجانبين من كتلة عينة أكتوبر لمحاذاة العينة. إذا لم يتم محاذاة العينة فيما يتعلق شفرة، سوف تبدأ تقطيع من ركلة ركنية أو الجانب من العينة. ضبط جبل لضمان أن نصل يقطع رأسي تماما (أو الأفقي) مواجهة كتلة العينة.
أقسام نموذجية للمجتمعات الخميرة هي ~ 14 ميكرون سميكة. بعد قطع مقطع، استخدام شريحة المجهر الاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة لجمع هذا الباب، من خلال تناوله ببطء الشريحة إلى قسم قطع. سوف تذوب القسم ونقل إلى الشريحة المجهر. يمكن نقل ما يصل إلى 18 أقسام على شريحة واحدة.
تخزين الشرائح في درجات الحرارة الباردة، ويفضل -20 ° C، قبل التصوير. فقدان الإشارة هو الحد الأدنى عند الاحتفاظ بها لمدة أسبوع واحد في C. ° 4 للإشارة مضان أقصى، ويتم ذلك يفضل التصوير على الفور بعد تقطيع.