تصميم روبوت الحيوية استجابة من اوريغامي الحمض النووي

Summary

اوريغامي الحمض النووي هو وسيلة قوية لانتاج الأجسام النانوية دقيقة بواسطة برمجة التجميع الذاتي للجزيئات الحمض النووي. هنا، نحن تصف كيف يمكن استخدام اوريغامي الحمض النووي لتصميم الروبوت الآلي قادرة على استشعار العظة البيولوجية والاستجابة من قبل شكل التحول، نقلت بعد ذلك إلى التأثير المطلوب.

Abstract

الأحماض النووية وتنوعا بشكل مدهش. بالإضافة إلى دورها الطبيعي وسيلة تخزين للمعلومات البيولوجية ^1، فإنها يمكن أن تستخدم في الحوسبة المتوازية ^2،3 والتعرف عليها وربط الأهداف الجزيئية أو الخلوية ^{4،5، 6،7} تحفيز التفاعلات الكيميائية، وتوليد استجابات محسوب في البيولوجية نظام ^8،9. الأهم من ذلك، يمكن برمجتها الأحماض النووية للتجميع الذاتي في 2D و 3D هياكل ^10-12، وتمكن من إدماج كل هذه الميزات الرائعة في روبوت واحد يربط بين الاستشعار من العظة البيولوجية إلى استجابة محددة مسبقا من أجل ممارسة التأثير المطلوب.

خلق الأشكال من الأحماض النووية كان أول من اقترح من قبل سيمان ^13، ومنذ ذلك الحين أدركت العديد من الاختلافات حول هذا الموضوع باستخدام تقنيات مختلفة ^{11،12،14،15.} ومع ذلك، فإن الأكثر أهمية هو ربما الذي تقترحه Rothemund، ووصف scaffolded اوريغامي الحمض النووي16. في هذه التقنية، يتم توجيه قابلة للطي منذ فترة طويلة (> 7،000 قواعد) الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي واحد 'سقالة' إلى الشكل المطلوب من قبل مئات من فروع متكاملة قصيرة تسمى 'المواد الغذائية'. ويتم الطي بها درجة الحرارة الصلب المنحدر. وقد تجلى هذا الأسلوب بنجاح في إنشاء مجموعة متنوعة من الأشكال 2D بدقة رائعة ومتانة. مددت اوريغامي الحمض النووي في وقت لاحق إلى 3D بالإضافة ^17،18.

وستركز هذه الورقة على البرنامج 2.0 caDNAno ¹⁹ التي وضعتها دوغلاس والزملاء. caDNAno هي قوية وسهلة الاستخدام CAD أداة تمكين تصميم 2D و 3D DNA الأشكال اوريغامي مع ميزات متعددة الاستعمالات. تعتمد عملية التصميم على نظام التجريد المنهجي ودقيقة للهياكل الحمض النووي، مما يجعلها واضحة وفعالة نسبيا.

في هذه الورقة ونحن لشرح تصميم اوريغامي الحمض النووي NAnorobot التي تم وصفها مؤخرا ^20. هذا الروبوت هو "الروبوتية" بمعنى أنه يربط ما بين الاستشعار عن بعد ليشتغل، من أجل تنفيذ مهمة. نفسر كيف يمكن أن تكون متكاملة مخططات الاستشعار المختلفة في الهيكل، وكيف يمكن أن يتم ترحيل هذه إلى التأثير المطلوب. وأخيرا ونحن نستخدم كاندو ²¹ لمحاكاة الخصائص الميكانيكية للشكل تصميم. مفهوم نناقش يمكن تكييفها مع المهام وإعدادات متعددة.

Protocol

الروبوت سوف نقوم بتصميم في هذه الورقة يستجيب لP بروتين C من خلال جعل البضائع المتاحة للربط المستقبلات على سطح الخلية المستهدفة المختارة. يظهر الروبوت في الشكل 1 C قد يكون المخدرات مستقبلات حجب؛. عامل النمو الخ، وطريقة لربط كيميائيا إلى قليل النوكليوتيد الحمض النووي يجب أن تكون متاحة أن لا يدمر وظيفتها. الروبوت لديه دولتين. عندما يتم تهجين غير نشط، والبوابات DNA على اثنين من "الشفاه" الخارجية، والتأكد من يبقى الروبوت المغلقة، بحيث أي البضائع المحملة داخل وعزلها بشكل آمن. في وجود البروتين P، البوابات المفتوحة من قبل أي واحد من عدة آليات (التي تناقش أدناه) السماح للروبوت لفتح وفضح البضائع. عند تصميم الهيكل، والنظر في أن الروبوت يجب أن يكون مرنا بما فيه الكفاية ليغلق على نفسه في حالة مغلقة، والربيع إلى الدولة مفتوحا عند بوابات تمكينه من القيام بذلك. نمذجة سلوك الحمض النووي هيكل دمج الحرارية والمكونات الميكانيكية أمر صعب، والكائن الفعلي قد تتطلب بعض تكرارية التحسين. ومع ذلك، وهنا علينا أن نركز على عملية التصميم باستخدام نموذج العمل العامة، والتي يمكن البناء عليها.

لاحظ

من أجل فهم أشمل لعملية DNA تصميم اوريغامي وقابلة للطي، ونحن نوصي بشدة قراءة ورقة caDNAno الأصلي من قبل دوغلاس وزملاؤه ¹⁹ وهو ما يفسر التمثيل المجرد من الحمض النووي في تصميم واجهة ومدى ارتباطه إلى التركيب الجزيئي الفعلي لل شكل الحمض النووي 3D. ويرافق هذه الورقة من قبل اثنين من دروس الفيديو التي تصف التمثيل caDNAno واجهة بطريقة واضحة جدا. بالإضافة إلى ذلك، نوصي قراءة ورقة في الآونة الأخيرة من قبل ديتز وزملاؤه يصف العديد من الجوانب المهمة والبروتوكولات مفصل لعملية قابلة للطي، بما في ذلك أداة تحليل كاندو ^21.

TLE "> 1. تحميل وتثبيت caDNAno 2.0 و Autodesk مايا 2012

ملاحظة: برنامج أوتوديسك مجانا للطلاب واستخدام الأكاديمي. وتشمل التعليمات التالية إعداد حساب الأكاديمية في أوتوديسك.

1. إنشاء حساب الأكاديمية في http://students.autodesk.com/ . بعد استلام إعداد حساب البريد الإلكتروني، انقر فوق رابط التفعيل وملء خياراتك كما تريد.
2. تحميل نسخة مجانية من مايا 2012 من مركز التحميل.
3. تثبيت مايا عام 2012 على جهاز الكمبيوتر الخاص بك.
4. تشغيل مايا مرة واحدة قبل تثبيت caDNAno 2.0.
5. قم بتحميل وتثبيت أحدث إصدار من caDNAno 2.0 من http://cadnano.org/ .
6. تشغيل مايا 2012. ينبغي أن تظهر أيقونة caDNAno في أعلى الزاوية اليمنى من واجهة المستخدم الرسومية. انقر فوق رمز للذهاب الى caDNAno.

2. Outlالمعهد الوطني للإحصاء على الشكل المطلوب ومسار ستراند سقالة

1. واجهة تصميم caDNAno داخل مايا يشمل 3 لوحات (الشكل 2):
   1. اللوحة العلوية: مشاهدة شعرية، حيث تم تفصيلها الشكل في البداية. هذا الفريق تمكن تطبيقات مزدوج على مستوى الحلزون ويقدم وجهة نظر قسم من الشكل.
   2. لوحة أسفل: لوحة التحرير، وتمكين تطبيقات واحد على مستوى القاعدة.
   3. اللوحة اليمنى: أ مايا ولدت في الوقت الحقيقي نموذج 3D من شكل
2. انقر فوق "قرص العسل" رمز. التكبير في يوم والخروج من شعرية في لوحة أعلى ويمكن أن يتم عن طريق الماوس التمرير صعودا وهبوطا، على التوالي.
   caDNAno تمكن اثنين من المشابك تصميم ممكن، والعسل مربع، وفي هذه الورقة سوف نستخدم تخطيط العسل، على الرغم من أن شعرية مربع يمكن استخدامها بشكل عام وكذلك ^22.
3. تبدأ من خلال رسم مقطع من الشكل المطلوب على اللوحة اليسرى.
   كل دائرة يمثل حلزون الحمض النووي المزدوج. لCHoose واللوالب التي تبني الشكل، ببساطة انقر بزر الماوس الأيسر على مركزهم (الشكل 3). تواصل الحلزون الحلزون من قبل حتى يتم أوجز شكل كامل. بدلا من ذلك، يمكن استخلاص الشكل عن طريق الضغط على زر الماوس الأيسر ورسم الخطوط العريضة باستمرار الشكل. يمكن التراجع عن أي إجراء بالضغط القائمة تحرير، و "تراجع"، أو عن طريق لوحة المفاتيح الاختصار CTRL + Z (PC) أو CMD + Z (ماك).
   عند هذه النقطة، فإن اللوالب اختيارها تظهر الصفراء. وفي الوقت نفسه، فإن لوحة أسفل عرض وجهة نظر الجانب من الشكل، تتألف من هذه اللوالب. الحلزون الترقيم في اللوحة السفلية يتسق مع الترقيم في رأس واحد.
4. مراقبة لوحة أسفل. يتم تمثيل كل الحلزون بواسطة صفين من الساحات: الصفوف هما فروع من الحلزون المزدوج، مع كل مربع يمثل قاعدة (الشكل 4).
   يحدد شريط عمودي البرتقالي حيث اتخاذ إجراءات التحرير مكان على طول الحلزون. ويبدو أن موقف قاعدة على طول الشبكة كماعدد فوق شريط برتقالي. طول الافتراضي للإطار الحلزون هو 42 قواعد. ويمكن تمديد طول بالنقر فوق أحد من الرموز السهم الرمادية في أعلى الزاوية اليمنى من لوحة التحرير واختيار طول التمديد (في مضاعفات 21، والتي تتوافق مع لفتين كاملة من الحمض النووي الحلزون، الذي بدوره واحد يمتد 10.5 قواعد) (الشكل 4). الشبكة ستمتد إلى اتجاه السهم الذي تم اختياره.
5. لرسم مسار حبلا سقالة الفعلية في جميع أنحاء الشكل، اضغط على زر الماوس، تبدأ من الحلزون الأول والذهاب بشكل مستمر على مدى كل اللوالب على بعد بنفس الترتيب كانوا اختيارها في البداية في القسم 2.3. لاحظ أن:
   1. تحديد اللوالب هذا الوقت من تغيير لونه إلى اللون البرتقالي.
   2. في لوحة أسفل، وسيتم اختيار شظايا حبلا سقالة تلقائيا في اللوالب المحددة.
   3. سوف اللوحة اليمنى إظهار نموذج 3D من الشكل يجري بناؤه في الوقت الحقيقي. في نهاية هذاوسيتم اختيار عملية، مشروع مسار حبلا سقالة تلقائيا في لوحة أسفل (الشكل 5).
6. رسم مستطيل حول جميع حواف في أقصى اليسار من الطريق السقالة. لاحظ أن حواف اختيارها لذلك سوف تظهر حمراء (الشكل 6).
7. تمديد مسار سقالة بسحب الحواف المحددة كمجموعة إلى الجانب الأيسر من الشبكة. كرر هذه العملية لحواف اليمين حتى يتم توسيع مسار صحيح. لاحظ أن السقالة التمديد أيضا يمتد على شكل 3D في اللوحة اليمنى (الشكل 7).
8. تحديد موقع أجزاء مسار السقالة التي يتم عزلها عن بقية، وربطها. في شكل لدينا، على سبيل المثال، اللوالب 0-9 تشكل جزءا معزولة. الحلزون 9 يحتاج إلى وصله إلى الحلزون 12 (لاحظ أن اللوالب 9 و 10 ليست متجاورة في شكل [اللوحة العلوية] بحيث لا يمكن ان تكون مرتبطة).
9. التكبير في فروع أن تكون متصلا، وباستخدام أداة "تحديد" النقر على أي نقطة على واحدمن فروع. عند النقر على أي نقطة على طول سقالة جزء الأزرق، تظهر رموز 'الجسر' بين اللوالب، تدل على المواقف التي يسمح فيها عمليات الانتقال. في هذه المواقف، والقواعد في اللوالب المتاخمة مواجهة بعضها البعض مباشرة، مما يتيح للفروع للعبور من الحلزون إلى الحلزون دون تشويه أو التواء في الحمض النووي. عدد الظهور بجانب كل أيقونة جسر يشير إلى عدد من الحلزون وسوف كروس إلى (الشكل 8).
10. لإنشاء عمليات الانتقال، غادر انقر فوق رمز الجسر في الاختيار. سيتم إنشاء تقاطع السقالة، وهذا يعني السقالة يعبر في هذه المرحلة من الحلزون الحلزون إلى (الشكل 9). كرر هذه العملية حتى تقطع سقالة كل اللوالب ويخلق حلقة مغلقة يمتد شكل كامل، دون ترك أي المناطق التي يتم عزلها عن بقية الشكل.
    نلاحظ أنه في حين تظهر عمليات الانتقال تمتد على مسافة في البرنامج، في الواقع أنها لا تتضمن أي قاعدة الحمض النووي. جسديا، عبور"جسر" يحتوي على واحد فقط وحدة الفوسفات من العمود الفقري الذي يربط الحمض النووي قاعدتين من اللوالب المجاورة معا.
11. قبل الانتقال إلى الخطوة التالية، تأكد من أن السقالة كامل مستمر، ولا يوجد أي جزء منه معزول عن الآخرين.

3. تحديد آلية فتح محاور

يفتح الروبوت وصفها في رده على مدخلات البيولوجية المحددة للكشف عن حمولتها. افتتاح يقام بطريقة قذيفة تشبه، مع نصفين (اللوالب 0-29 يشكلون نصف واحد، اللوالب 30-61 يشكلون النصف الثاني) تدور حول محورين. يتم تشكيل محاور من قبل عمليات الانتقال بين اللوالب 29-30 و 61-0، والتي هي عبور فقط بين تلك نصفين ويتم وضعه فقط في أو بالقرب من الحافة اليسرى من الشبكة. سوف الحافة اليمنى تحتوي فروع بوابة (التي تناقش أدناه).

1. محو كروس القائم بين اللوالب 29-30. لمحو كروس، انقر فوق "ركبة" نقطة في أي حبلا.هذا يترك نيك في كل فروع حيث استخدمت كروس أن يكون. إلى التماس والنكات، اضغط SHIFT وانقر فوق كل نيك.
2. إنشاء كروس جديدة بين اللوالب 29-30 في أقرب وقت ممكن إلى الحافة اليسرى من الشبكة (الشكل 10).
3. إنشاء كروس جديدة بين اللوالب 61 و 0 في أقرب وقت ممكن إلى الحافة اليسرى من الشبكة.

4. تحديد مواقع مرفق الحمولة

بعد أن ننتهي من التآمر المسار حبلا سقالة، نحن بحاجة إلى تحديد مواقع المرفق الحمولة (تحميل). مواقع التحميل هي في الواقع فروع الأساسية التي تمتد من اللوالب على النحو احد فروع 'الذين تقطعت بهم السبل. ولذا فمن المهم أن يحدد بدقة جدا حيث طول الحلزون هذا المتفرعة يحدث، للتأكد من أنها تمتد إلى الاتجاه المطلوب. إذا نحدد ملحقات الأساسية بصورة تعسفية، قد تحدث مواقع التحميل على الجانب الخارجي للروبوت بدلا من الجانب الداخلي.

Tس تأكد من دعائم يمتد إلى اتجاه معين فقط، ونحن التآمر لشن الحلزون إضافية، والتي هي بمثابة أدلة لالمتفرعة التوجيهية للالأساسية من الجسم الرئيسي. بعد تمديد موقع التحميل المطلوب التيلة، تتم إزالة اللولب دليل.

1. دعونا نحدد 4 مواقع التحميل التي تواجه نحو الجانب الداخلي للروبوت. سوف التفرع مواقع التحميل من اللوالب 3، 27، 34، و 58. لكل موقع، في أعلى لوحة انقر فوق الحلزون متاخم لهذه اللوالب التي تواجه الجانب الداخلي (الشكل 11). وهذا إضافة إلى اللوالب الشبكة في لوحة أسفل. لا الثاني فوق هذه اللوالب حتى الآن.

5. إضافة وتحرير ستابلز

1. انقر على زر "AutoStaple". يقوم البرنامج تلقائيا بإضافة متواليات الأساسية في مختلف الألوان (الشكل 12). لاحظ أن المواد الغذائية التي تمت إضافتها إلى شكل 3D في اللوحة اليمنى. الألوان الأساسية هي متسقة لوحات أسفل واليمين. في additiعلى أن هناك مؤشرا على أسفل الزاوية اليسرى من واجهة، وهو ما يشير إلى التيلة.
   ملاحظة: المواد الغذائية لا يمكن أن تكون طويلة جدا، أو قصيرة جدا دائرية. معظم المواد الغذائية ولدت هنا لا تلبي هذه المعايير، ويجب أن تكون تحريرها. الخطوة الأولى في تحريرها هو تلقائي (راجع الخطوة التالية).
2. انقر على زر "AutoBreak". سيتم فتح مربع الحوار (الشكل 13)، يسأل عن المعلمات المعرفة من قبل المستخدم لهذا الإجراء:
   1. طول الهدف (BP): طول المتوقعة من التيلة إذا كان ذلك ممكنا
   2. طول العداد (BP): الحد الأدنى المسموح به للطول التيلة
   3. طول ماكس (BP): طول القصوى المسموح بها لمن دعائم
   4. مين حي لxover (BP): أقل عدد ممكن من أزواج قاعدة التيلة يمكن اجتياز بين حافته وكروس أو بين اثنين من عمليات الانتقال.
      استخدام المعلمات الافتراضية، انقر فوق موافق. يقوم البرنامج كسر المواد الغذائية وفقا لهذه المعايير لأفضل لقدرته (الشكل 14).
3. محو كل عمليات الانتقال التيلة بين اللوالب 29-30 و 61-0، لتمكين هذه اللوالب لفصل وتمكين روبوت لفتح. سوف محو عبور الأساسية تتطلب بعض التحرير اليدوي إلى المواد الغذائية الصحيحة التي تصبح قصيرة جدا أو غير منطقي نتيجة لهذا الإجراء. للقيام بذلك بشكل صحيح، اتبع الإرشادات في المقاطع التالية.
   تأكد من أن يترك للعبور السقالة التي تم إنشاؤها في أقسام 3.2 و 3.3 سليمة.
4. تنظر، على سبيل المثال، أول كروس الأساسية (السماوي والأسود المواد الغذائية) من الجهة اليسرى بين اللوالب 29 و 30 (الشكل 15). محو كل الجسور من هذا التقاطع من خلال النقر كل نقطة في الركبة أو الجسر بحيث يظهر أحمر، ثم ضرب حذف (الشكل 16).
5. التماس المواد الغذائية على اثنين الحلزون 29 طريق الضغط على SHIFT والنقر على نيك بينهما. وبالمثل، التماس المواد الغذائية الثلاثة على حبلا 30 إلى التيلة واحد (الشكل 17). الغذائية الأساسية يمكنيتم تمديد أو تقصير يدويا عن طريق النقر على الحافة وسحبه كما تريد. والحرص على عدم التعميم أي التيلة. ويبين الشكل 18 الفجوة بين اللوالب 29-30 بعد التحرير الكامل لعمليات الانتقال التيلة. كرر هذه العملية اللوالب 0 و 61، ويدويا تحرير كافة السلع الاساسية في كل الحلزون.
6. تحديد المواد الغذائية التي يتم رسمها خط سميك، وهذا يعني أنها تحتاج إلى مزيد من التحرير. فحص كل واحد وتصحيح عند الضرورة. على سبيل المثال، المواد الغذائية التي هي قصيرة جدا يمكن محوها (الشكل 19) أو تمديدها إذا كان ذلك ممكنا.

6. إنشاء مواقع التحميل وغيتس

1. الثانية مزدوجا فوق التحميل اللوالب موقع في لوحة أعلى، وتمديد سقالة الناتجة شظايا حبلا في لوحة أسفل بالضغط على الحافة وسحبه كما تريد (الشكل 20).
2. يدويا إضافة المواد الغذائية إلى هذه الشظايا السقالة عن طريق وضع شريط عمودي البرتقالي في الموضع المطلوب على طول رانه السقالة، والذهاب أكثر من اللوالب دليل على اللوحة اليسرى، وعقد SHIFT والنقر. هذا سيضيف تمهيدا الأساسية في كل الحلزوني (الشكل 21).
3. تمديد السلائف الأساسية لكامل طول وكذلك عن طريق النقر والسحب.
4. تحديد الرموز الجسر الأحمر، تدل مواقف كروس المسموح به بين حبلا دليل (على سبيل المثال، الحلزون 62) والهيكل (على سبيل المثال، الحلزون 3).
5. اختيار المكان الأكثر ملاءمة لإدخال كروس وانقر على أيقونة الجسر (الشكل 22). موقع مناسب يتطلب الحد الأدنى من تحرير المواد الغذائية الأساسية الموجودة في هيكل السيارة.
6. في الحلزون دليل (اللولب 62)، حذف جزء الأساسية التي ليست جزءا من موقع التحميل، وتقصير الجزء المشاركة إلى الطول المطلوب. يجب على الطول المطلوب توفير كل خصوصية لتحميل أنواع مختلفة من البضائع، والقوة الملزمة. عادة، يجب أن يكون الذيل 18 مير غرامة. تأكد تبقى التيلة DRAسفل من خط رقيق، وإلا تحريره حتى هو.
7. في هيكل السيارة، وتحرير المواد الغذائية تغيرت حسب الضرورة.
8. محو دليل (اللولب 62) ولم يتبق سوى تمديد التيلة.
9. كرر الخطوات من 6،4-6،8 لجميع مواقع التحميل (الشكل 23).

7. تصميم بوابة السواحل

فروع البوابة هي فروع فقط، باستثناء محاور، وربط اللوالب 29-30 و 61-0. وعلى النقيض من المحاور وفروع البوابة ليست عمليات الانتقال. بدلا من ذلك، أنها هجن لتشكيل شريحة مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل، التي تعد بمثابة جهاز استشعار للمدخلات البيولوجية في الاختيار. مرة واحدة والمشردين دوبلكسات بوابة، يمكن للروبوت بأكملها تدور حول محاور entropically ومفتوحة.

1. تحديد المواقف المناسبة لفروع البوابة. وسوف تكون هذه المواد الغذائية على اللوالب 29، 30، 61، و 0.
2. على سبيل المثال، دراسة منطقة البوابة 29-30. هناك خيوط التيلة مريحة المرافقة اللوالب 29 و 30 علىالجانب الأيمن من الشبكة، والتي يمكن أن تستخدم خيوط البوابة. ملاحظة أنهم يواجهون اتجاهين متعاكسين.
3. انقر فوق حافة واحدة من فروع بوابة المحتملة لتمديده خارج الشكل. إذا حافة تقع على تقاطع السقالة، يمكن تبسيط اختيارها عن طريق التأكد فقط "STAP" (LES) يتم اختيارها، بالضغط قبالة "المجلس العسكري" (أضعاف) في "اختيار" شريط الأدوات على الجانب الأيمن العلوي من الواجهة .
4. تمديد كل من المواد الغذائية لتشكيل فروع البوابة. تعديل المواد الغذائية إذا كان هذا التمديد يتطلب ذلك (الشكل 24). كرر هذا للفروع بوابة اللوالب 0 و 61.
   لاحظ أنه في الوقت الراهن، وطول الفعلية لا يهم، لأن الحمض النووي الاستشعار (مثل aptamer) سيحل محل تسلسل حبلا بوابة في خطوة إتمام التسلسل.

8. اختيار سقالة تسلسل

1. انقر على "تسلسل" أداة. ضع المؤشر في أي مكان على حبلا السقالة وانقر. سوف يظهر مربع الحوار فتح تطلب منا أناختيار مصدر الحمض النووي سقالة (الشكل 25).
2. اختيار DNA مصدر يعتمد إلى حد كبير على حجم الروبوت. على سبيل المثال، M13mp18 ssDNA (p7249)، ومشتقات الموسعة والخمسين (p7308 الخ) التي كانت عموما خيار لكبير DNA الأشكال اوريغامي، ويصلح عندما حبلا سقالة هو ~ 7 KB طويلة. إذا السقالة من شكل تصميم أقصر بكثير من مصدر المختارة، فإن حبلا سقالة الزائدة التي لم يتم تهجينها إلى أي التيلة خلق حلقة من ssDNA جاحظ من شكل مطوية. في حين أن هذا عادة ما يشكل مشكلة صغيرة بالنسبة لحلقات قصيرة نسبيا، يمكن أن الحلقات طويل متعدد KB تتداخل بشكل كبير مع للطي وظيفة للروبوت. ولذلك فمن المهم لتناسب مصدر اختار لطول سقالة الشكل.

على سبيل المثال، إذا كان حبلا سقالة حاجة إلى أضعاف هو شكل صغير طويل ~ 1،600 القواعد، التي هي أقصر بكثير من مصادر محددة مسبقا في مربع الحوار، يمكن للتسلسل مخصصأن تستخدم السقالة. ويمكن اعتبار عدة مصادر. على سبيل المثال، يمكن هضمها في M13mp18 مع انزيم التقييد المحددة التي تنتج جزء من الطول المطلوب. تصميم مثل هذا المصدر يمكن القيام به في NebCutter ( http://tools.neb.com/NEBcutter2/ ) عن طريق لصق تسلسل M13mp18 في إطار الإدخال NebCutter، والمواقع تقييد رسم الخرائط. وثمة خيار آخر هو استخدام ما قبل هضمها ssDNA، مثل phiX174 الفيريون ssDNA HaeIII هضم، متوفرة من Biolabs نيو انغلاند.

3. في مربع الحوار، انقر فوق "M13mp18". لاحظ أن تسلسل الحمض النووي المختار قد أضيفت إلى منصة الاعدام وفروع الأساسية في لوحة أسفل.

9. المعرضRT تسلسل التيلة كجدول بيانات

1. انقر فوق "تصدير" على شريط الأدوات العلوي، واختيار اسم ملف الوجهة للقائمة الأساسية. انقر على زر "حفظ".
2. تحديد الوجهة. ملف CSV وفتحه.
3. ويبين جدول القائمة الأساسية، والتي يمكن إرسالها كما هي إلى شركة توليف الحمض النووي. أول عمودين عرض بداية ونهاية إحداثيات، مع عدد خارج الأقواس تدل على عدد الحلزون وعدد داخل أقواس تدل على موقف القاعدة.

10. تعيين بوابة وجار متواليات

1. في القائمة الأساسية، ستلاحظ أن بعض متواليات تبدأ أو تنتهي مع سلسلة من علامات الاستفهام "؟؟؟؟؟". هذه علامات استفهام دلالة على أنه منذ لا حبلا سقالة يهجن مع هذه المناطق الأساسية محددة، فإنها يمكن أن لا يتم تعيين تسلسل التكميلية. وهذه هي في الواقع ملحقات قمنا بتصميم لفروع بوابة ومواقع التحميل، وبالتالي هذه تحتاج إلى تعيين يدويا الآن.
2. بوابة:
   1. بوابات تحديد طبيعة المدخلات البيولوجية التي تقوم عليها روبوت ستتحول من غير نشط إلى حالة نشطة وفضح حمولتها. كل بوابة dsDNA واحد يمكن ترميز استجابة لإدخال البيولوجية واحد (أو أكثر)، لذلك يمكن تعريف ملف تعريف المدخلات اللازمة لتفعيل الروبوت.
      لنفترض على سبيل المثال هذا أن جديلة البيولوجية اثار تفعيل الروبوت هو انزيم التقييد، والتي يمكن أن تشير إلى وجود البكتيريا المعدية.
   2. النظر أولا أن فروع ssDNA بوابة لا هجن فورا بعد تتفرع من اللوالب الخاصة بهم. تصميم البوابة وإلا قد تعيق التهجين خلال للطي. ولذلك، يجب على كل فرع تبدأ سلسلة فاصل. نحن عادة استخدام بولي-T كسلاسل التبادل، لأن هذا تسلسل يوفر المرونة.
   3. ونحن نفترض أيضا أن طول المنطقة التهجين البوابة هو 20 قواعد، التي تحتوي على الاعتصام تقييد الهدفه في منتصفه.
   4. ولذلك قد تبدو البوابة مثل هذا:
      [اللولب 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTxxxxxxGCTAGAG-3 '
      [اللولب 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAxxxxxxCGATCTC-5 '
      في "....." للدلالة على المنطقة الأساسية التي يهجن مع حبلا السقالة، وبالتالي فإنه لديه تسلسل بالفعل، وينبغي ألا يتغير.
      على الوجهين عشوائية "GTGAGTT" ومكملا لها يضمن موقع التقييد هو غير مفتوح جزئيا، ويقدم بعض قواعد اضافية لضمان الهضم فعالة الانزيم.
      "س" تدل على موقع التقييد.
      على الوجهين عشوائية "GCTAGAG" ومكملا لها تقديم بعض قواعد اضافية لإنزيم للعمل بكفاءة، ولكن أيضا يجعل من حبلا بوابة طويلة بما فيه الكفاية لضمان إغلاق الروبوت جيدة.
      قبل اختيار موقع تقييد كهدف، تأكد من أن هيكل الروبوت كامل، لا يتم هضمها مواقع التحميل والجزء الآخر من البوابة نفسها من قبلانزيم في الاختيار. في هذا الفحص، وNEBCutter قائمة 0 القاطع (الإنزيمات التي لا قطع تسلسل كامل) ذو أهمية خاصة EagI، معزولة عن الأمعائية المكتلة Pantoea، كما انزيم المحتملة التي يمكن أن تشير إلى وجود المعدية enterobacterial.
   5. البوابة تبدو الآن مثل هذا (الأصفر علامات موقع تقييد EagI):
      [اللولب 29]-5'-..... TTTTTTTGTGAGTTCGGCCGGCTAGAG-3 '
      [اللولب 30]-3'-..... TTTTTTTCACTCAAGCCGGCCGATCTC-5 '
      علما أن هذا التصميم يفترض أنه بعد الهضم، وتسلسل "GTGAGTTCGG" (T _م = 32 ° C) ليست طويلة بما فيه الكفاية أو مستقرة الديناميكا الحرارية لعقد أغلقت الروبوت بعد الآن. على الأرجح بحاجة إلى هذا الافتراض ليتم التحقق منها تجريبيا.
   6. البوابة الثانية يمكن أن تكون هي نفسها في هذه الحالة فإن الروبوت تستجيب فقط لإنزيم واحد، أو يمكن تصميم مع موقع مختلف، وزيادة خصوصية الروبوت. يمكن إضافة المزيد من المواقع قيود على نفس الساحل، في التجعيد لتعقيد وخصوصية للروبوت.
3. مواقع التحميل:
   1. موقع التحميل يمكن أن يكون تسلسل عالمي. بدلا من ذلك، يمكن أن تستند مواقع التحميل على تسلسل فريدة من نوعها، والتي سوف تقلل نمطية ولكن تحسين الرقابة على التوجه البضائع والنسب (لأنواع مختلفة من البضائع).
   2. وأخيرا، ينبغي أن تشمل التحميل [أليغنوكليوتيد موقع مجموعة كيميائية وظيفية تمكنهم من تصريف مع أي الحمولة: البروتين، وجسيمات متناهية الصغر، وما إلى ذلك تأكد هي التي شنت المجموعة الكيميائية على الطرف الصحيح (5 'أو 3')، وفقا لاتجاه التيلة .

11. محاكاة النتائج في كاندو

1. بعد حفظ العمل كملف جسون، فإنه يمكن تحميلها على كاندو للتحليل. كاندو هو محاكاة مقرها محدود، عنصر من عناصر بنية الحمض النووي التي يمكن تقدير صلابة واستقراره في حل ^21.
2. الذهاب إلىami.org / "الهدف =" _blank "> http://cando-dna-origami.org/
3. انقر على زر "إرسال ملف caDNAno للتحليل" وملء كافة المعلومات الضرورية.
4. تحليل في كاندو عادة يستغرق فترة تصل إلى 15-20 دقيقة. في النهاية، رسالة البريد الإلكتروني يتيح لنا أن نعرف تحليل كاملة، وتوفير رابط لتحميل نتائج المحاكاة (الشكل 26).

12. DNA النظام واضعاف روبوت

مرة واحدة في عملية تصميم كاملة ويظهر تحليل كاندو التنبؤ مرضية للمنتج، وقائمة حبلا التيلة ولدت في أقسام 9-10 يمكن أن يؤمر. عادة، خيوط التيلة لا تتطلب تنقية خاصة، ومع ذلك، فمن المستحسن أن خيوط لأغراض خاصة مثل بوابات أو مواقع التحميل يتم تنقيته بواسطة HPLC.

الخطوات التالية النظام DNA، وهي قابلة للطي، وتنقية وتقييم المنتج، بما في ذلك تصور لهيكل مطوية إما عن طريق القوة الذريةالمجهري (AFM) أو نقل الإلكترون المجهري (TEM) هي خارج نطاق هذه الورقة، ويمكن العثور عليها في تقارير سابقة ^{17،18،20،21.} يتم جلب صورة TEM للروبوت صمم هنا كمثال (الشكل 27). تم تنفيذ إعداد العينات وتلطيخ خارج تماما كما هو موضح في مكان آخر ^21.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

الأرقام 1-25 لقطات من واجهة caDNAno 2.0 تظهر عملية التصميم خطوة بخطوة. وقد ورد المقطع العرضي من الشكل الأول (الشكل 3)، تليها بالإضافة التلقائي من شظايا حبلا السقالة والانتهاء من مسار سقالة كامل (الشكل 7). تضاف فروع الأساسية تلقائيا (الشكل 12)،...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

اوريغامي الحمض النووي تمكننا من تصنيع كائنات محددة بدقة مع ميزات التعسفي في المقياس النانوي. سيكون خطوة هامة تالية يكون التكامل من وظيفة في هذه التصاميم. بينما العديد من التطبيقات والتحديات يمكن معالجتها مع هذه التكنولوجيا، وهناك اهتمام خاص في افتعال الروبوتات الع?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autodesk Maya 2012	Autodesk		A student/academic account needs to be created first (see platform-specific instructions in http://cadnano.org)
caDNAno 2.0 (software)	(Open source)		Software for the design of DNA origami structures http://cadnano.org
Cando (webpage)	(Open source)		Webpage running a simulator of DNA origami shapes http://cando-dna-origami.org