Method Article
الفورمالين الأرشيفية ثابتة وجزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) العينات السريرية هي مادة قيمة للتحقيق من الأمراض. نحن هنا يبرهن على وجود إعداد سير العمل عينة مما يتيح تحليل متعمق البروتين من الأنسجة FFPE microdissected.
المواد السريرية الحفاظ هو مصدرا فريدا للتحقيق البروتين من اضطرابات الإنسان. نحن هنا وصف بروتوكول الأمثل مما يسمح التحليل الكمي على نطاق واسع من الفورمالين الثابتة وجزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE) الأنسجة. ويتألف الإجراء أربع خطوات متميزة. أول واحد هو إعداد الأبواب من المواد FFPE وتسليخ مجهري للخلايا الفائدة. في الخطوة الثانية هي هي lysed الخلايا المعزولة ومعالجتها باستخدام 'تصفية بمساعدة عينة إعداد' (FASP) التقنية. في هذه الخطوة، ونضبت البروتينات من الكواشف المستخدمة للتحلل العينة ويتم هضمها في يومين الخطوات باستخدام endoproteinase LysC والتربسين.
بعد كل عملية الهضم، يتم جمع الببتيدات في كسور منفصلة ويتم تحديد محتواها باستخدام قياس مضان حساسة للغاية. أخيرا، ومجزأة الببتيدات على microcolumns 'ماصة طرف'. يتم فصل LysC-الببتيدات إلى 4 كسور في حين أن المؤسسة العامة زيتيةيتم فصل ptides في 2 الكسور. بهذه الطريقة عينات أعدت تسمح تحليل proteomes من كميات ضئيلة من المواد إلى عمق 10،000 البروتينات. وبالتالي، فإن سير العمل وصفها هي تقنية قوية لدراسة الأمراض في نطاق المنظومة الموضة فضلا عن تحديد المؤشرات الحيوية المحتملة والأهداف المخدرات.
تحديد مع امتصاص العرق وتضمينها في البارافين (FFPE) هو الأسلوب القياسي لحفظ والتحقيق pathomorphologic المواد الأنسجة السريرية. المجهري للأنسجة المحفوظة يسمح تحديد المرض المرتبطة تغيرات شكلية، وكشف وسجل وقوع المرض مستضدات ذات الصلة. منذ يستخدم عادة سوى جزء صغير من العينة FFPE في هذه التحليلات، لا تزال كميات كبيرة من المواد السريرية أرشفة ويمكن استغلالها في أنواع أخرى من الدراسات.
خلال العقد الأخير تم تعزيز البحوث في علوم الحياة عن طريق التكنولوجيا البروتين قوية. يسمح هذا تقنية التعرف على الهوية والكميات الآلاف من البروتينات في مخاليط معقدة البروتين. سمة هامة من التكنولوجيا هو أن هناك حاجة إلى كميات ضئيلة فقط من المواد ليحلل نطاق واسع. أظهرت دراسات حديثة أن البروتينات البروتين يمكن دراستها على مقياس من شركات تقريباوليته proteomes 1، 2. هذا النوع من التحقيقات تمكن نظام رؤى واسعة في تكوين الخلايا وتحديد مجموعات من البروتينات التي تحدث في مستويات الشاذة في الأمراض. في حين أن هذه الدراسات من القدرات اللازمة الطيفي كتلة كبيرة، وقد أثبتت أعمال حديثة أن مدى مماثلة لتحديد الهوية لا يمكن أن يتحقق في غضون يوم واحد من قياس 3.
متطلبات منخفضة نسبيا كمية العينة، ومدى توافر واسعة من العينات السريرية الحفاظ إغراء لنا وللآخرين لتطوير أساليب تمكين استكشاف البروتين من المواد FFPE (لاستعراض رؤية 4). الاستفادة من عكس اتجاه التثبيت الفورمالين تحت المعالجة الحرارية وضعنا بروتوكولا يسمح استخراج كمية من البروتينات من الأنسجة الثابتة 5. لقد أظهرنا أن الإجراء تثبيت يحفظ البروتينات فحسب، ولكن أيضا على الأقل بعض التعديلات ما بعد النقل. Phosphorylation وN-ارتباط بالغليكوزيل يمكن دراستها باستخدام عينات FFPE 5، ومع ذلك شرطا أساسيا لأنها تسيطر تماما جمع الأنسجة وتخزين وتثبيت الأوضاع. المقبل، ونحن قد اشتركا في تطوير طريقة لالتقاط الليزر تسليخ مجهري للأنسجة الثابتة وللمفاعل على أساس عينة البروتين تجهيز 6، 7. دراسة على نطاق واسع على سرطان القولون والمستقيم يسمح التحليل الكمي من 7،500 البروتينات من microdissected من المواد السريرية 8. أخيرا، فقد قمنا بتحسين طريق استكشاف المواد microdissected من خلال تطبيق مرتين متتاليتين البروتين خطوة الهضم بروتوكول 9. في مقارنة لاستراتيجيات مشتركة باستخدام انزيم الهضم واحد، وهذا الإجراء يمكن توليد المزيد من الببتيدات تسلسل فريدة من نوعها، وبالتالي يؤدي إلى عمق أكبر من تحديد البروتين. تحليل microdissected غدي القولون الإنسان يسمح تحليل البروتين إلى عمق 9،500 البروتينات في عينة 3. في هذا عشيقذ نحن تعيينها 55،000 الببتيدات لكل عينة مما يتيح تحديد 88-89٪ بروتينات مع لا يقل عن 2 الببتيدات. هنا نقدم بروتوكول الأمثل لإعداد عينات من المواد لتحليلها FFPE LC-MS/MS. ويتألف هذا البروتوكول إعداد شرائح الأنسجة لتسليخ مجهري، تحلل الخلايا المعزولة، وتجهيز العينات في شكل مفاعل (FASP) 6. ثم نحن تصف تقرير spectrofluorometric من غلة الببتيد؛ مهمة ذات أهمية عالية لتحديد الببتيد الأمثل من قبل مطياف الكتلة. أخيرا، علينا أن نظهر مبادل أنيون قوية (ساكس) القائمة على تقنية فصل للتجزئة الببتيد. في هذه الطريقة يتم تنفيذ كل من الفصل الببتيد وتنظيف النهائي خارج باستخدام microcolumns ماصة طرف 10 و 11. هذه الخطوة اختيارية ولكن ينصح في الدراسات التي أكثر من عدد قليل ميكروجرام الببتيدات يمكن الحصول عليها من عينة واحدة. وSAX-تجزئة يمكن زيادة كبيرة في عدد ومجموعة ديناميكية من الايدنتifications وتوسيع نطاق تغطية تسلسل البروتين 3، 10.
1. الأجهزة المطلوبة
2. حلول
3. تلميح ماصة وأعمدة "StageTip '
4. إعداد شرائح الأنسجة لتسليخ مجهري وتحلل عينة
5. تجهيز العينة
6. الكميات من الببتيدات
7. تجزئة من ليز-C والببتيدات زيتية
تحليل البروتين من المواد FFPE يتطلب أساليب قوية وقابلة للتكرار لإعداد العينة. في هذا المنشور علينا أن نبرهن على بروتوكول يسمح العزلة فعالة من السكان الخلية من المواد الثابتة والمعالجة الكيميائية مما يؤدي إلى كسور عالية النقاء الببتيد التي يمكن استخدامها مباشرة لتحليل LC-MS/MS. تتكون الإجراء من أربعة أجزاء منفصلة: (1) إعداد المقاطع من العينات FFPE وتسليخ مجهري لها، (2) تحلل العينة وتجهيز البروتينات باستخدام نهج MED FASP، و (3) تحديد الكميات و (4) من تجزئة الببتيدات (الشكل 1).
في الخطوة الأولى من الإجراء يتم مقطوع العينات FFPE مع مشراح والتي شنت على غشاء تغطية الشرائح. لزيادة التصاق بين أقسام الأنسجة وسطح الغشاء الشريحة من الضروري أن أشرق على سطح الشريحة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية. لهذا الغرض نستخدم ضوء مصباح الأشعة فوق البنفسجيةمتكاملة في لمقعد ثقافة الخلية. بعد هذه الخطوة التي يتعرض لها الشرائح ليغسل السماح إزالة البارافين والإماهة من العينات. اتسخت المواد ممهى مع hematoxilin لفترة قصيرة. هذه النتائج في تلطيخ ضعيفة من العينة ولكن يكفي لتصور من مناطق العينة لتسليخ مجهري. عملية تلطيخ لابد من توقف بسرعة قبل الشطف الشرائح مع وجود فائض من المياه. وتلطيخ لفترات طويلة من نتائج العينة في غلة الببتيد الفقراء.
في الخطوة التالية التي يتعرض لها أقسام المجففة لتسليخ مجهري. اختيار المناطق الأنسجة من الخلايا الفردية يعتمد على نوع من التحقيق ويتطلب دائما معرفة محددة في الأنسجة أو المورفولوجيا المرضية. يتم جمع المواد صدر الليزر على الأسطح لاصقة للأنابيب جمع العينات. منذ القدرات ملزم من المواد اللاصقة يقتصر فمن الضروري لنقل المواد microdissected من غطاء لروقال انه بعد تشريح أنبوب من كل 3-5 مم 2 العينة. وهذا يمكن أن يتم بسهولة من قبل pipetting بضع ميكرولتر من العازلة تحلل الأنسجة (LTB) على الغطاء والغزل قصيرة من الأنبوب في جهاز للطرد المركزي. بعد جمع العينة في الجزء السفلي من الأنبوب، ويمكن أن تستمر لتسليخ مجهري وجمع العينات على الغطاء. مرة واحدة ويتم جمع العينة كلها الأنابيب يجب أن تكون مقفول بالإضافة إلى ذلك مع parafilm وحضنت في حمام مائي عند حوالي 99 درجة مئوية مع الإثارة مستمرة لمدة 1 ساعة. منذ خلال المياه الحضانة يتكثف على الغطاء، كل 15 دقيقة الأنابيب يجب أن طرد قريبا لجمع الظهر الماء في أنبوب مخروط.
للحصول على الببتيدات تتم معالجة الأنسجة لست] باستخدام نهج MED-FASP. في هذا الأسلوب يتم استنفاد البروتينات هي lysed من المنظفات وغيرها من المواد منخفضة الوزن الجزيئي، carboamidomethylated في بقايا cysteinyl، ومن ثم هضمها على التوالي مع اثنين من الانزيمات المتنوعةfering في خصوصيات تفككها: endoproteinase LysC والتربسين. بعد كل خطوة الهضم يتم جمع الببتيدات إلى كسور منفصلة. في هذا الجزء من إعداد العينات من المهم أن تواصل كل خطوة من الخطوات الطرد المركزي حتى أكثر من 95٪ من الحل تحميلها في البداية إلى وحدة الترشيح مرت الغشاء. تحليل الأنسجة وسرطان القولون لاحظنا أن هذا الإجراء غلة 3-6 ميكروغرام من الببتيد في 100 NL (100 ميكروغرام الأنسجة أو 10 مم 2 من المادة 10 ميكرون) من المادة microdissected (الجدول 1). منذ البروتين الكلي استخراجها من أنسجة حوالي 10٪ من وزن النسيج إجراءات استخراج والهضم تؤدي معا في العائد 30-60٪ في يتعلق الأنسجة الطازجة الأصلي. هذه القيم تعكس الخسائر من البروتين خلال الجفاف وتلطيخ، تسليخ مجهري، والإبقاء على جزء من العينة غير مهضوم في وحدات الترشيح الفائق. لأن الاستخراج ومعالجة أيأسفرت الأنسجة FFPE ن microdissected في العائد البروتين إلى الببتيد تحويل 75٪ 5 فمن المرجح أن تحدث خسائر الحرجة عينة خلال الخطوات قبل MED-FASP. سمة مهمة من الخلائط الببتيد التي حصل عليها هذا الإجراء هو النقاء العالية مما يسهل مزيد من تجزئة الببتيد عملية تجزئة وتحديد الطيف الكتلي. وقد تم مؤخرا أظهرت ذلك من خلال تحليل عينات من الورم الحميد القولون والمستقيم 3. في تلك الدراسة بقيادة حوالي 40٪ من الأحداث MS / MS لتحديد الببتيدات من الأنسجة FFPE وأسفرت عن تعيين ما يصل إلى 17،000 الببتيدات في واحدة المدى LC-MS/MS. وقد تم تحقيق معدلات أعلى تحديد فقط في تحليل المجمدة في المختبر الخلايا المستزرعة 3.
في اثنين من الأجزاء الأخيرة من الإجراء بأكمله وكميا الببتيدات المعزولة ومجزأة على microcolumns ماصة طرف. منذ كميات من الببتيد معزولة عن الأنسجة microdissected هي أن يكونانخفاض 10 ميكروغرام أنها لا يمكن قياسها كميا باستخدام استخداما قائم على الأصباغ المقايسات البروتين. أيضا القياسات الطيفية للأشعة فوق البنفسجية A 280 في هذه التركيزات ليست مفيدة نظرا لتأثير تشتت الضوء. في المقابل، قياسات مضان من بقايا التربتوفان توفر وسيلة يمكن الاعتماد عليها لتحديد محتوى الببتيد.
في الآونة الأخيرة أظهرت لنا أن ما يصل إلى 5،000 البروتينات من الخلايا المستزرعة يمكن تحديدها في "طلقة واحدة" 4 تحليل ساعة LC-MS/MS 7. ولكن هذا النوع من التحليل تطبق على أنسجة الأم نادرا ما يسمح بتحديد أكثر من 3،000 آلاف البروتينات. لزيادة عمق تحليل الببتيدات ولدت في MED FASP يجب أن تكون مجزأة مسبقا قبل LC-MS/MS. في عمود فصل الجزئي ساكس تستند هي طريقة بسيطة وفعالة تجزئة 10. وقد تم بالفعل تطبيقه في العديد من الدراسات البروتين بما في ذلك تحليل الأنسجة الثابتة 5 و 8 و 9. للساكس "ماصة طرف 'microcoluMNS، وC 18 - الأعمدة تحلية 'StageTip' 9 هي سهلة التحضير. ويتم تجميع الأعمدة بواسطة التراص من المقابس، وقطع من SAX أو C 18 الأغشية، في 200 ميكرولتر ماصة 11. وترد أمثلة لتحليل العينات FFPE-مجزأة ساكس في الجدول 1.
الشكل 1. نظرة عامة الإجراء. تتكون الإجراء من أربعة أجزاء منفصلة: (1) إعداد المقاطع من العينات FFPE وتسليخ مجهري لها، (2) تحلل العينة وتجهيز البروتينات باستخدام نهج MED FASP، و (3) تحديد الكميات و (4) من تجزئة الببتيدات.
عينة | عينة ما قبل تجزئة / الهضم | استخدام مطياف الكتلة | العائد الببتيد نانوغرام / عينة NL (± SD) | تعريفات البروتين فريدة من نوعها لكل عينة واحدة | مرجع |
• Adenonocarcinoma • الغشاء المخاطي للقولون عادي | SAX / انزيم واحد | Orbitrap-VELOS | 36 ± 11 (ن = 8) 30 ± 8 (ن = 8) | 5،985 ± 54 5،868 ± 110 | 8 |
• الورم الحميد القولون | SAX / اثنين من الانزيمات | س Exactive | 56 ± 6.1 (ن = 3) | 9،501 ± 28 | 3 |
الجدول 1. نتائج الممثل التحليلات البروتين في الأنسجة microdissected FFPE.
القدرة على دراسة المواد FFPE من البروتين التكنولوجيا إلى عمق مقارنة مع تسلسل الحمض النووي وتقنيات ميكروأري يفتح آفاقا جديدة في العلامات البيولوجية واكتشاف الهدف المخدرات. بروتوكول صفها تمكن توصيف وتحديد الكميات من proteomes السكان من الخلايا microdissected على مقياس من 10،000 البروتينات. عند استخدام أقل للمواد microdissected يمكن إنشاء قواعد البيانات أصغر، ولكن ربما في كثير من الحالات يمكن أيضا أن توفر تلك البيانات السريرية قيمة. وبالتالي، إما العينات يمكن تحليلها مباشرة بعد العملية MED-FASP أو يمكن فصلها في أقل الكسور. منذ الإجراء FASP متوافق مع أي نوع من الأنزيم البروتيني، والانزيمات الأخرى أو الجمع بينهما يمكن استخدامها من الهضم من البروتين 6.
نوعية المواد FFPE يبدو أن المسألة الأكثر أهمية من التحليل. وقد عانينا من أن الأنسجة الثابتة من نفس الأصل ولكن يأتي من تختلفكان عيادات الأنف والحنجرة خصائص متميزة. استخدام الأنسجة من مصدر واحد وكنا قادرين على توليد عوائد عالية في الببتيدات، في حين كانت مواد مماثلة من عيادة أخرى عديمة الفائدة تقريبا. فمن المحتمل أن تثبيت تطبيق وإجراءات تضمين فضلا عن ظروف التخزين هي العوامل الرئيسية التي تؤثر على خواص المادة 12 السريرية. وبالتالي فإنه من المستحسن لاختبار خصائص بعض العينات قبل البدء في مشروع أكبر.
وذكرت العديد من المنشورات استخدام المواد FFPE في الماضي. ومع ذلك، فإن عدد من البروتينات التي تم تحديدها في هذه الدراسات لا تتعدى أكثر من 1،000-2،000 البروتينات 4. النظر في حجم proteomes محددة الخلية البشرية تضم أكثر من 10،000 والبروتينات، وكانت فقط قادرة على تقديم صورة سطحية للغاية، وتقتصر تقريبا على البروتينات وفيرة للغاية المشاركة في مهام التدبير المنزلي مثل هذه الدراسات. بروتوكول لدينا تمكن العزلة الفعالة من المواد البيولوجية أو السريرية ومدمج الحفاظ على الأنسجة ويتم تحسينه لتحلل، وتجهيز البروتين والببتيد prefractionation. ونتيجة لذلك لدينا عينة إعداد سير العمل، عندما يقترن إلى مطياف الكتلة الراقية، ويتيح نظرة ثاقبة على proteomes كاملة تقريبا. ملحوظة، وهذا ممكن في متطلبات كمية عينة دقيقة.
والميزة الرئيسية لاستخدام الأنسجة المحفوظة هو توافرها واسعة نسبيا. عينات FFPE أرشفة لسنوات وعقود عديدة، وتعتبر في بعض الأحيان غير مجدية كما، والآن، وذلك بفضل التكنولوجيا البروتين، كما تظهر المواد ذات قيمة عالية للبحوث السريرية. في حين أن العديد من الأمراض يمكن دراستها باستخدام التحقيق المواد الطازجة أو المجمدة من المواد FFPE يبدو أن تكون ذات أهمية خاصة لدراسة الأمراض النادرة 12، وجمع مجموعة تمثيلية من العينة عادة ما يستغرق وقتا طويلا.
المؤلف ليس لديه ما يكشف.
المؤلف بفضل الدكتور ماتياس مان للدعم المستمر والسيدة كاتارينا من Zettl لبيان الأسلوب.
وأيد هذا العمل من قبل جمعية ماكس بلانك لتقدم العلوم.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
MembraneSlide 1.0 PEN | Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany | 415190-9041-000 | |
Adhesive Cap 200 opaque | Carl-Zeiss Microscopy GmBH, Goettingen, Germany | 415190-9181-000 | |
Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich St. Louis, MO | MHS32 | |
Forensic 30k | Merck Millipore Darmstadt, Germany | MRCF0R030 | (Previously sold as Microcon YM-30) |
Empore Anion | Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN | 2252 | |
Empore C18 | Bioanalytical technologies 3M Company ST. Paul, MN | 2215 | |
Trypsin | Promega | 2014-06-27 | |
Endoproteinase Lys-C | Wako | 129-02541 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved