في قياس الرحم من معدل ضربات القلب في الماوس بواسطة موسع M-وضع ضربات القلب

Summary

الموجات فوق الصوتية فائقة التردد هو أداة قوية التصوير الحي لدراسة تشوهات قلبية في الحيوانات الصغيرة. noninvasiveness ويسمح حفاظ على حالة الفسيولوجية للأجنة. هنا، نقدم لك مجموعة من استخدام M-وضع الموجات فوق الصوتية لقياس معدل ضربات القلب من الأجنة في E18.5 في الرحم.

Abstract

أمراض القلب الخلقية (CHD) هو السبب غير المعدية الأكثر شيوعا للوفاة عند الولادة. حدوث أمراض الشرايين التاجية بين 4 إلى 50/1، 000 من المواليد (الأمراض والإصابات التقديرات الإقليمية، ومنظمة الصحة العالمية، 2004). ويلزم الجراحات التي غالبا ما تؤثر سلبا على جودة الحياة لتصحيح عيوب القلب، يذكرنا بأهمية إيجاد أسباب أمراض الشرايين التاجية. أصبحت نماذج الماوس متحولة وتكنولوجيا التصوير الحية الأدوات الأساسية لدراسة مسببات هذا المرض. على الرغم من أن أساليب متقدمة تسمح التصوير الحي القلوب غير طبيعي في الأجنة، وغالبا ما يثير الشبهة الدول الفسيولوجية والدورة الدموية لهذه الأخيرة بسبب العمليات الجراحية و / أو مطولة. التصوير بالموجات فوق الصوتية موسع، ومع ذلك، يمكن أن تستخدم من دون تعريض الأجنة جراحيا، وبالتالي الحفاظ على علم وظائف الأعضاء الخاصة بهم. هنا، ونحن نستخدم بسيطة M-وضع الموجات فوق الصوتية لتقييم معدل ضربات القلب من الأجنة في E18.5 في الرحم. الكشف عن معدل ضربات القلب غير طبيعية هو في الواقع جيدة إنديكاتور من ضعف في القلب، وبالتالي يشكل الخطوة الأولى في تحديد العيوب التنموية التي قد تؤدي إلى فشل القلب.

Introduction

أمراض الشرايين التاجية هي السبب غير المعدية الأكثر شيوعا للوفاة عند الولادة ^1. وغالبا ما يحتاج جراحات متعددة لتصحيح العيوب الهيكلية في المواضيع التي قد تبقى الشبهة ¹ نوعية الحياة. الأطفال الذين يعانون من أمراض الشرايين التاجية بشكل متكرر تطوير الاضطرابات العصبية حتى إن لم تكن قد خضعت لعملية جراحية، مشيرا الى أهمية في عواقب الرحم على ^2،3 التنمية. كل من العوامل الوراثية والبيئية، مثل التعرض للفيروسات أو مواد كيميائية (الكحول) خلال فترة الحمل، والسبب CHD. دراسة المساهمة الجينية لا يزال في مرحلته المبكرة، ولكنه ينمو بسرعة. لتحديد هذه المساهمة وفهم دورها في التنمية القلب، phenotyping فئرانا معدلة وراثيا مع أداة بسيطة وقوية وسوف يكون مفيدا للغاية.

الماوس هو في الواقع نموذج حيواني من خيار لدراسة أمراض الشرايين التاجية، ومعظم الحالات البشرية يمكن استنساخها في الفئران ^4،5. بالتالي، أصبح الماوس الجنين phenotyping القلب المؤتمر الوطني العراقيالمهم reasingly للتحقيق في مسببات أمراض الشرايين التاجية الإنسان ويتطلب أدوات كافية. على الرغم من أن الدراسات النسيجية على العينات ثابتة لا تقدر بثمن، في الوقت الحقيقي التصوير الحيوانات الحية هو أمر حاسم لفهم علم وظائف الأعضاء من القلب. المجهر الفيديو يقدم التصوير الحي. ومع ذلك، فإنه يتطلب فتح البطن لفضح الأجنة، وبالتالي المساس دولتهم الفسيولوجية والدورة الدموية. في الآونة الأخيرة، أصبح تخطيط صدى القلب تقنية التصوير القياسية لتقييم القلب في العيادة وكذلك في الفئران.

ويجري الماوس ضربات القلب الجنين باستخدام الموجات فوق الصوتية أنظمة السريرية القياسية وكذلك أنظمة الموجات فوق الصوتية تردد عالية جدا. توفر هذه الأخيرة 30 ميغاهيرتز أو محولات التردد العالي التي تولد الصور ثنائية الأبعاد والسماح للتقييم المراحل الجنينية المبكرة. هذه محولات لديها عمق الاختراق فقيرة نسبيا (~ 13 ملم)، والذي هو، ومع ذلك، ما يكفي للحصول على طائرات التصوير الكافية وتحديد السلطة الفلسطينية القلب الأساسيةrameters، مثل معدل ضربات القلب، اليسار واليمين القطر الداخلي البطين في انبساط وانقباض والحاجز وسمك الجدار، بدون تنفيذ البطن.

في دراستنا، وقد استخدمنا نظام الموجات فوق الصوتية تردد فائقة لتقييم معدل ضربات القلب من أجنة الفئران الجنينية E18.5 في اليوم. اخترنا محول 30 ميغاهيرتز أن يقدم وجهة نظر مجال 20 مم × 20 مم، والذي يعتبر مثاليا نظرا لحجم الأجنة، مع طول بؤري من 12.7 ملم. ومع ذلك، قد يتم اختيار محول التردد العالي في تحليل المراحل التنموية السابقة. المحدد M-وضع يسمح التصور من الأنسجة في الحركة بفضل القرار الزماني عالية من 1،000 لقطة / ثانية. الإجراء الكامل هو بسيطة ويجب أن يتم تنفيذ في أسرع وقت ممكن لتجنب أي اضطراب في الدول الفسيولوجية والدورة الدموية للجنين. تحليل حوالي 8 أجنة يتطلب حوالي 1 ساعة.

Protocol

وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات المبينة في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية الحيوان IRCM.

1. نظام الموجات فوق الصوتية وإعداد محطة

1. بدء نظام التصوير بالموجات فوق الصوتية وتوصيل scanhead فضلا عن وحدة تحكم علم وظائف الأعضاء وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (الشكل 1). اختيار برنامج قياس القلب وscanhead الذي يتوافق مع 30 ميغاهيرتز محول.
2. ملء الأنفية من scanhead مع الماء منزوع الأيونات. تجنب فقاعات الهواء لأنها تتداخل مع التصوير القرار. وضع scanhead مع الجانب مقبض حتى على حاملها بالقرب من منصة التصوير (الشكل 1A).
3. تطهير منصة التصوير ومجال العمل.
4. ملء تماما زجاجة من هلام الموجات فوق الصوتية لتجنب تشكيل فقاعات ووضعه رأسا على عقب في مجموعة الحاويات prewarming إلى 37 درجة مئوية (الشكل 1B).
5. تحقق من مستويات أوكسيالجنرال وisoflurane وونظام أنابيب للتخدير. أن تجربة واحدة مع ~ 8 أجنة استخدام حوالي 15-20 L الأوكسجين.
6. وضع زجاجات مرهم العيون، كريم مزيل الشعر وهلام الكهربائي بالقرب من منصة التصوير (الشكل 1B).
7. تحقق من أن الأشعة تحت الحمراء وظائف مصباح الحرارة. خلال التدريب، وتعيين مستوى الحرارة، موقف مصباح والمسافة من المصباح على الفئران من أجل الحفاظ على درجة حرارة الجسم ثابتة ومعدل ضربات القلب.
   ملاحظة: إعداد السليم للنظام والمادية أمر بالغ الأهمية. قد تؤثر الإجراءات المطولة الخصائص الفسيولوجية والدورة الدموية من الأجنة كما التخدير طويلة يخفض وظيفة القلب عن طريق خفض معدل ضربات القلب وضغط الدم ومستوى الأوكسجين في الدم. الوقت اللازم للتجهيز ل~ 8 الأجنة (متوسط ​​حجم القمامة في C57BL / 6) يجب أن يكون حوالي 1 ساعة. قد توفر سلالات الفئران الأخرى ارتفاع عدد الأجنة ويحتمل مع حجم أكبر من الإناث. التدريب ضروري لتحسين اللازمالوقت نانوغرام.

2. إعداد الماوس

1. تخدير الأنثى الحامل في غرفة مع امدادات مستمرة من 2٪ isoflurane والأكسجين في (200 مل / دقيقة) حتى يصبح متجاوب.
2. ضع الماوس على منصة التصوير في موقف ضعيف، وضبط أنابيب للاستنشاق المتواصل من 1.5٪ isoflurane والأكسجين في (200 مل / دقيقة)، وإصلاح أنبوب استنشاق مع الشريط (الشكل 2A). وينبغي تأكيد التخدير كافية أثناء الإجراء من قبل الموقف خففت من الفأرة وعدم وجود أي رد على الذيل وأخمص القدمين القرصات.
3. هلام المكان الكهربائي فقط على الجزء العلوي الأيمن والأيسر منصات القطب السفلي (يمين الصدارة الساق والساق الخلفية اليسرى، وتسمى أيضا الموقف الثاني الرصاص) لتخطيط القلب الكهربائي. يؤدي الموقف الثاني يوفر أفضل تعريف تستقيم إيجابية ف موجة QRS ومعقدة لتحديد معدل ضربات القلب. تأمين الكفوف أربعة إلى كل لوحة باستخدام الشريط (الشكل 2A). لمنع جفاف العينين، وتطبيق 1 قطرة منمرهم للعين في كل عين.
4. حلق البطن من الصدر إلى المثانة مع قص الشعر. ثم تطبيق كريم مزيل الشعر لمدة 2 دقيقة ومحوها من بشاش و / أو مسحة القطن لإزالة الشعر بعناية أي المتبقية. يجب الحرص على عدم قطع الحلمات.
5. إدراج مقياس الحرارة prelubricated مع هلام الكهربائي في المستقيم الأنثى لمراقبة درجة حرارة الجسم (ينبغي الحفاظ على 37 ± 0.5 درجة مئوية عن طريق ضبط مصباح حرارة الأشعة تحت الحمراء وضعت فوق منصة). وينبغي أن يكون معدل ضربات القلب 450 ± 50 نبضة / دقيقة (نبضة في الدقيقة). يتم عرض كل من درجة الحرارة ومعدل ضربات القلب في وحدة تحكم علم وظائف الأعضاء (الشكل 1B).
   ملاحظة: التخدير طويل، وفقدان الشعر، وهلام بالموجات فوق الصوتية (على الرغم من prewarmed) يمكن أن تؤدي إلى انخفاض حرارة الجسم، والتي يمكن أن تؤثر على معدل ضربات القلب الأنثى. في حالة انخفاض درجة حرارة الجسم أقل من 36.5 درجة مئوية، ووقف الإجراءات وتعديل موقف مصباح التدفئة لضبط درجة الحرارة ومعدل ضربات القلب. الانتظار بضع دقائق فرنكاخام تسير مرة أخرى.

3. تحديد الجنين

1. اضغط بلطف إلى أسفل على البطن عارية لتحديد الأجنة. ببطء وبرفق تنتشر بها لدينا أكثر من الأجنة في طبقة واحدة تحت سطح البطن. في كل قرن الرحم، وترتبط الحويصلات خطيا لبعضها البعض. محاولة لاحترام هذا النظام عندما نشر.
2. علامة كل جنين على البطن عارية من الإناث مع علامة دائمة مع هم الأمامي / الخلفي وظهري / بطني الاتجاهات. سوف معرفة التوجه تسهيل تحديد مكان وجود القلب مع التحقيق. عدد الأجنة في اليمين واليسار قرون بدءا من عنق الرحم (1، 2، 3 ... و1 '، 2'، 3 '... على التوالي؛ الشكل 2B).
   ملاحظة: (ط) تجنب نشر أجنة باستخدام القوة المفرطة. رسم مواقعها على قطعة من الورق لتتبع لهم (الشكل 2C). (ب) C57BL / 6 الاناث ~ 8 الأجنة في القمامة. ومع ذلك، 0-2 أجنة في كل القمامة هي لأوكاتيد تحت الآخرين، مما يجعل من التصوير أمرا مستحيلا. استبعاد هذه الأجنة من تحليل وتقييم أكثر الفضلات إذا لزم الأمر.

4. قياس معدل ضربات القلب

1. وضع كمية صغيرة من هلام الموجات فوق الصوتية على البطن prewarmed عارية وانتشاره بالتساوي. تجنب تشكيل فقاعة. إضافة كمية أكبر من هلام (~ 5 مل) على منطقة معينة لصورة.
2. تعقد لجنة التحقيق في اتصال مع طبقة سميكة هلام (10 ملم) والانتقال تدريجيا نحو التحقيق الجلد في حين يبحث عن القلب النابض. بمجرد تصور القلب النابض على الشاشة، وضبط زاوية من التحقيق أن يكون كل من البطينين في أكبر حجمها في الطائرة التصوير (الشكل 2D).
3. ستبدأ بالحصول على الصورة. مع الساعد يستريح على المحطة، ووضع محول على هلام الموجات فوق الصوتية للحصول على الصورة الحية على شاشة عرض (الشكل 2D). الحفاظ على التلال من محول على رأس والنقر على التوجه scanheadن علامة (في الركن العلوي الأيسر من الصورة) تسمح للتنسيق حركة اليد وتصور المنطقة على الشاشة.
4. بدءا من عنق الرحم، نقل إلى أقرب الجنين ملحوظ (1 أو 1 'في اليمين أو اليسار الرحم قرن، على التوالي) لتصور قلب ينبض على الشاشة. لأن الثابت عمق التنسيق، تحرك بلطف التحقيق لأعلى / أسفل وعلى الجانبين دون أن تفقد الاتصال مع هلام الحصول على طائرة الصورة المطلوبة.
5. وضع القلب النابض في وسط الشاشة داخل المنطقة المشار إليها بواسطة خط متقطع أصفر تمثل منطقة محورية للحصول على البيانات بشكل أفضل.
6. اكتساب تسجيلا حيا. الحصول على صورة الكشفية واستئناف تسجيل (الشكل 3A). مرة واحدة يتم الحصول على الحد الأدنى من 10 ثانية من تسجيل مستقرة، ووقف تسجيل وحفظ.
7. انتقل إلى الجنين القادم.
8. مرة واحدة ويتم تحليل جميع الأجنة، اضغط على "استعراض" على لوحة المفاتيح لعرض قائمة التسجيلات. لعب كل سجلت M-وضع تريسينانوغرام وأداء قياسات متعددة (5 في البحث عن المفقودين على الأقل) من التباعد بين القمم المجاورة (دورة الوقت / تدفق) للحصول على متوسط ​​معدل ضربات القلب (الشكل 3B).
   ملاحظة: تشير بعض البروتوكولات باستخدام موقفا ثابتا لscanhead لتجنب اهتزاز. ومع ذلك، فإنه يقيد زاوية التحليل، مما يجعل مراقبة الأجنة الجانبية الصعبة. أيضا يبطئ التحليل، وموقف لابد من تعديلها لكل جنين. عقد scanhead حين تسوية الساعد على محطة يقلل كفاءة تهتز. ينصح التدريب مع 5-10 إناث الحوامل لتحسين النتيجة.

5. التنميط الجيني

1. باستخدام مقص وملقط جراحي نظيفة، شق طولي من الجلد وطبقة العضلات من البطن. تحديد موقع الحويصلات في كل قرن الرحم وتطابق الأرقام. خفض فتح الكيس المحي لفضح الجنين في الترتيب المستخدمة أعلاه. إن لم يكن في ترتيب خطي، رسم المواقف الجنين على قطعةمن الورق سيكون من الضروري مرة واحدة علامات على الجلد لم تعد مرئية.
2. قطع فقط ~ 4 ملم من الذيل لالتنميط الجيني كما يتم استخراج الحمض النووي الجيني بكفاءة عالية من ذيول الجنينية.
   ملاحظة: (ط) قد يكون إجراء العمليات الجراحية التي يتعين القيام بها في مكان منفصل عن غرفة التصوير. ومع ذلك، فمن المهم عدم تحريك الماوس ويكون إجراء العمليات الجراحية على منصة التصوير من اجل الحفاظ على المسار من الأجنة معدودة. التشاور مع مدير مرفق الحيوان لتحسين العملية الجراحية. (ب) والإناث الحوامل يموت بسرعة بسبب فقدان الدم كما يتم إزالة الأجنة لالتنميط الجيني بعد التصوير. بعد قطع الذيل، ويتم وضع الأجنة 3 دقائق على الجليد للتخدير عن طريق انخفاض حرارة الجسم ومن ثم مقطوعة الرأس مع مقص، على النحو الموصى به من قبل لجنتنا رعاية الحيوان.

النتائج

كان يستخدم الأسلوب أعلاه لتقييم تأثير وجود أو عدم وجود فورين سيرين البروتيني في الخلايا البطانية على معدل ضربات القلب من أجنة الفئران في E18.5 في الرحم. فورين ينتمي إلى عائلة من convertases طليعة البروتين (أجهزة الكمبيوتر) التي السلائف بروتين يلتصق بعد مخلفات الأساسية. ...

Discussion

M-وضع تخطيط صدى القلب هو وسيلة فعالة وبسيطة لقياس معدل ضربات القلب في الرحم من أجنة الفئران. توفير محولات الطاقة المتاحة تجاريا القرار كافية لتصور قلوب الضرب الصغيرة. وبالتالي، فإنها تسمح لدرجة عالية من الدقة قياس معدل ضربات القلب، مقارنة مع أساليب أخرى مثل قياس...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.	CP0406v2	1-chloro-2,2,2-trifluoroethyl difluoromethyl ether
Ultrasound gel	Parker Laboratories Inc.	Aquasonic Clear
Electrode gel	Parker Laboratories Inc.	Spectra 360
Ophthalmic gel	Novartis	Tear-Gel
Depilatory cream	Church Dwight Co., Inc.	Nair
Hair clipper
Gauze/cotton swap	Q-tips
Permanent marker
High-Resolution In vivo Ultrasound Imaging System	Visual Sonics	Vevo770
30 MHz Transducer	Visual Sonics	RMV707B
Imaging platform and physiology controller unit	Visual Sonics
Anesthetic System	Cyprane North America Inc.	312462
Infrared heating lamp