حل غاية intravital المجهري مخطط في الإضاءة مراكز جرمينال

Summary

ويتحقق عالية الدقة حيوي داخلي التصوير مع تعزيز النقيض تصل إلى 120 ميكرومتر في عمق الغدد الليمفاوية من الفئران الكبار عن طريق تحوير مكانيا نمط الإثارة من متعدد التنسيق المجهر ثنائي الفوتون. في عمق 100 ميكرون قمنا بقياس قرارات من 487 نانومتر (الأفقي) و 551 نانومتر (المحوري)، وبالتالي الالتفاف على تشتت وحيود حدود.

Abstract

رصد الاتصالات الخلوية من قبل حيوي داخلي الأنسجة العميقة متعددة الفوتون المجهري هو المفتاح لفهم مصير الخلايا المناعية داخل عينات من الأنسجة سميكة والأجهزة في الصحة والمرض. من خلال التحكم في نمط المسح في متعدد الفوتون المجهري وتطبيق الخوارزميات العددية المناسبة، قمنا بتطوير نهج مخطط في الإضاءة، والتي مكنتنا من تحقيق 3 أضعاف أفضل قرار محوري وتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء، أي النقيض من ذلك، في أكثر من 100 عمق الأنسجة ميكرون داخل نثر غاية أنسجة الأجهزة اللمفاوية بالمقارنة مع معيار متعدد الفوتون المجهري. سرعة اكتساب وكذلك photobleaching من photodamage والآثار كانت مشابهة لتقنية تستند الصور مضاعف القياسية، في حين كان عمق التصوير أقل قليلا نظرا لاستخدام أجهزة الكشف الميداني. باستخدام نهج مخطط في الإضاءة، ونحن قادرون على مراقبة ديناميات الودائع مجمع المناعي على الخلايا الجذعية الجريبي الثانوية ̵1؛ على مستوى عدد قليل من جزيئات البروتين في مراكز جرثومي.

Introduction

ثنائي الفوتون الليزر المجهر (TPLSM)، مع مزاياها للتصوير الأنسجة العميقة المتصلة الأشعة تحت الحمراء فائقة قصيرة الإثارة نابض ^1، وقد رأينا ثورة على العمليات الحيوية على مستوى الخلية واحد من خلال الكشف عن الحركة والتفاعل أنماط مختلفة مجموعات فرعية الخلايا في الحيوانات التي تعيش ^2-5. ومع ذلك، التكنولوجيا الحالية لا تزال غير كافية لتوضيح آليات وظيفة الجهاز وضعف كشرط أساسي لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة، لأنه يجعل سوى معلومات قليلة حول الأساس الجزيئي للاستجابة الخلوية داخل أنسجة في الصحة والمرض. التكنولوجيا الحالية تتيح سوى نافذة المكاني لبضع مئات من ميكرون بسبب تناثر وموجة آثار تشويه الجبهة على القرار المكانية ونسبة الإشارة إلى الضوضاء ^6، والتي هي واضحة وخاصة في الأنسجة المدمجة للغاية من الحيوانات البالغة. هذه نثر وآثار موجة تشويه الجبهة هي نتيجة لوغير متجانسة للغايةتوزيع متباين الخواص د معامل الانكسار في الأنسجة، مما يؤدي في خطوة أولى إلى تدهور تعتمد عمق القرار المكانية 3D وأخيرا إلى فقدان تام للإشارة القادمة من الفوتونات الإثارة الباليستية، أي فقدان نسبة الإشارة إلى الضوضاء. من حيث bioscientific والطبية الحيوية التطبيقات الأنسجة العميقة، وهذا يعني أن التكنولوجيا الحالية غير قادرة على الكشف لا لبس فيه الاتصالات الخلوية بسبب ضعف القرار من شأنه أن يؤدي إلى تفاعلات إيجابية زورا حين أن انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء من شأنه أن يتسبب في النظام نغفل بعض التفاعلات بين الهياكل قاتمة.

من أجل الكشف عن التفاعلات الخلوية بشكل لا لبس فيه بطريقة ديناميكية، هناك حاجة إلى تحسين درجة عالية القرار المكانية عميقة داخل الأنسجة. تقنيات nanoscopy قوية أدخلت حاليا على أساس خوارزميات عددية خاصة، مثل النهج بنية الإضاءة، على استنفاد أول دولة متحمس، على سبيل المثال STED، RESOLFT، أو على توطين جزيء، مثل dSTORM، النخيل، وقد وجدت العديد من التطبيقات في خلايا ثابتة وكذلك في مزارع الخلايا الحية ^7. ومع ذلك، من أجل توسيع نطاق هذه التطبيقات إلى أقسام الأنسجة، والأنسجة الحية والكائنات الحية ما زلنا بحاجة للتغلب على الصعوبات التقنية الشديدة. اثنين من الفوتون الإثارة STED مع أطوال موجية مختلفة وكذلك مع طول موجة واحدة (sw2PE-STED) عن الإثارة وحفز تم تطبيق القرار لتحسين الانبعاثات الجانبية في شرائح الدماغ ⁸ أو في مصفوفات اصطناعية مع خلايا جزءا لا يتجزأ من ^9، على التوالي، في نفس القرار المحوري كما TPLSM القياسية. باستخدام فوتون واحد STED، يمكن تصوير ديناميات العمود الفقري شجيري على سطح القشرة الدماغية (تصل إلى 10-15 ميكرومتر العمق) في لقمة العيش Thy1 EGFP الماوس في قرار من 67 نانومتر ^10. يتم توفير أداة مرنة للالبيولوجيا التطورية من متعدد البؤر المجهري منظم في الإضاءة، الذي يوفر تحسين شقين 2Dالقرار. ومع ذلك، هذه التقنية يمكن استخدامها فقط في الكائنات الحية مع الميل منخفضة من تشتت الضوء مثل أجنة سمك الزرد ^11. لا يزال، فإن أيا من هذه التقنيات يمكن تطبيقها في الأنسجة نثر عالية من الحيوانات البالغة في عدة مئات من ميكرومتر، والتي هي نماذج حاسمة للبحوث الطبية الحيوية والسريرية للأمراض، مع ظهور بعد الولادة.

مستقلة عن التقريب المستخدمة لحساب موجة شكل الجبهة محدودة الحيود، أي وظيفة انتشار نقطة (قوات الأمن الفلسطينية)، وبعد التركيز من خلال العدسة، والعرض من قوات الأمن الفلسطينية على طول المحور البصري (القرار المحوري) هو على الأقل ثلاث مرات أكبر من عرض PSF عمودي على المحور البصري (القرار الوحشي) ^12. موجة التشوهات أمام أوامر مختلفة كميا بواسطة معامل Zernike في تعديل كبير على شكل موجة من الموجات الكهرومغناطيسية الجبهة تركيزا في مجال التصوير الأنسجة العميقة مما يؤدي إلى أكبر من ذلك بكثير PSFS، وخصوصا على طول البصريةمحور آل ^13-15. وبالتالي، فإن القوانين حيود وآثار موجة التشويه أمامية على حد سواء تشير إلى قرار على طول المحور البصري كما العامل المحدد في التصوير الأنسجة العميقة. في حين أن التركيز على تقنيات nanoscopy مواجهة حدود الحيود فقط، هناك حاجة إلى التكنولوجيا مما يحسن القرار المحوري والتباين من خلال مواجهة كل من حيود والموجة الأمامية آثار التشويه عالية الدقة intravital التصوير. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون هذا الأسلوب أيضا سريع بما يكفي للسماح رصد ديناميات الخلوية.

التصحيح في الوقت الحقيقي من الانحرافات قوات الأمن الفلسطينية وفقدان التباين باستخدام البصريات التكيفية في TPLSM وقد درس على نطاق واسع وتحسينها في العقد الماضي ^{13،14،16-18} وبالتالي فإنه هو أفضل الخيارات المتاحة حاليا مما يؤدي إلى إدارة أفضل للالإثارة الباليستية فوتونات الضوء ^14. لا يزال، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن معظم موجة التصحيح الأمامي النهج المستخدمة في البصريات التكيفية هي تكرارية وأنهم هكتارلقد لتكرارها لمناطق صغيرة (10 × 10 بضعة ميكرومتر ²⁾ نظرا لعدم تجانس عالية من معامل الانكسار في الأنسجة، وسرعة اكتساب هو أقل بكثير مما هو ضروري لحركية الخلية التصوير والاتصالات. وعلاوة على ذلك، وتحسين الحد المادية في البصريات التكيفية-TPLSM لا يزال يحدده حيود.

التشكيل المكاني للإضاءة (SPIN) والتشكيل الزماني على الجانب الكشف (SPADE) وقد اقترحت نظريا ليتم تطبيقها على الليزر المجهر لتحسين القرار. التطبيق العملي في intravital التصوير ما زال يتعين تظاهر ^19.

أخذت معا، وهناك طلب كبير على تطوير التكنولوجيات، التي من شأنها تحسين القرار لتصوير الأنسجة العميقة في الحيوانات الحية الكبار. في هذا العمل، ونحن تحقيق التشكيل المكاني للنمط الإثارة عن طريق التحكم في عملية المسح متعددة الحزم في مخطط في الإضاءة متعدد الفوتون الليزر لياليتعليب المجهري (MB-SI-MPLSM) ^20. خلافا للنهج منظم الإضاءة، حيث يتم التضمين قسم الإثارة شعاع عبر مكانيا، ونحن نستخدم فقط عملية المسح لتحقيق التشكيل المكاني للإثارة. من خلال توسيع الإثارة إلى الطول الموجي الأطول، ونحن قادرون على تحسين كل من القرار المكانية ونسبة الإشارة إلى الضوضاء في عمق الأنسجة من نثر للغاية الأنسجة (مثل العقدة الليمفاوية، نثر حرة مسار 47 ميكرومتر ^6)، بصرف النظر عن بصري إشارة غير الخطية اكتشفنا، على سبيل المثال مضان، الجيل الثاني التوافقي أو تردد أخرى خلط الظاهرة. باستخدام هذا النهج في موجات الإثارة تصل إلى 900 نانومتر ونحن قادرون على حيوي صورة هياكل البروتين الخلوي على مقياس من جزيئات قليلة في مراكز جرثومي من الغدد الليمفاوية الماوس. وبالتالي، يمكننا تصور أفضل التفاعل بين وحدات المستضد تحمل على سطح الخلايا الجذعية الجريبي والخلايا B في عملية سبر المضادةجنرال خلال الاستجابة المناعية في الأجهزة اللمفاوية الثانوية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

الإعداد متعدد شعاع للمخطط في الإضاءة TPLSM

الإعداد المستخدمة هنا هي وكالة متخصصة متعددة الحزم اثنين من الفوتون ليزر المسح المجهر، كما هو موضح سابقا ^6،20. ويتضح النظام في الشكل 1. يمكن تطبيق هذا النهج إلى غيرها من اثنين من الفوتون المجاهر الليزر المسح الضوئي، والتي هي قادرة على مزامنة اقتناء الكاميرا مع حركة المرايا galvoscanner، حتى لو كانت قادرة فقط على أداء واحد العارضة المسح الضوئي . في هذه الحالة، سوف يكون العيب سرعة أقل الاستحواذ، ولكن مماثلة لسرعة اكتساب القياسية في TPLSM مقرها PMT. من أجل تحقيق الجودة المثلى حتى الآن بوصفه القرار والتباين هي المعنية، وعند أدنى photobleaching من وphotodamage وأسرع الاستحواذ، ومن المفضل أن تنظر في الخطوات التالية من التكيف الإعداد:

1. تحقق قوة الليزر ليزر تيزا: تحقق في 100٪، مقارنة مع القيم المصنع الأصلي وprevioتملك لنا قراءات واستخدامه كما هو إذا كان الطول الموجي الإثارة في نطاق 700-1،000 نانومتر هو ضروري.
2. اختبار مؤشر التحكم عن بعد لتي: سا شعاع الخائن، أي تحقق 0٪ و 100٪ الإعدادات. إذا هناك المتبقية تيزا شعاع عند 100٪، ثم تحقق وإعادة الموقف فارغة محرك خطوة. وتي: يتكون شعاع سا الخائن من ذات الترتيب المنخفض λ / 2 لوحة والمستقطب، والذي يقسم أشعة الليزر الاستقطاب عموديا على مسارات شعاع عمودي: واحدة موجهة إلى مجهر لإثارة، ويستخدم الآخر لضخ حدودي البصرية مذبذب (OPO). من خلال تناوب تلقائيا لوحة λ / 2، والتكيف المستمر للتي: سا والسلطة OPO، على التوالي، ويتحقق.
3. ضبط OPO إلى الطول الموجي المطلوب وقياس انتاج الطاقة. إذا كانت قوة منخفضة جدا (مع وجود 4 W تي: سا الليزر على 800 نانومتر، ينبغي للمرء أن يكون قادرا على الحصول على 0،8-1 W من OPO شعاع عند حوالي 1،050-1،100 نانومتر) تحسين ضخ الطول الموجي والتحقق من إعدادات المرآة الإلكترونية وانتشر من الكريستال. اختيار القيم الموصى بها المثلى، وهي متاحة في كثير من الأحيان كما الخرائط أو الرسوم البيانية، ثم صقل لهم حتى صدى OPO في الإخراج الطول الموجي المطلوب وزيادة الطاقة.
   1. إذا كانت السلطة لا تزال منخفضة، وضبط اثنين من المرايا الوصول إليها من OPO مع المقابض ضبط أربعة مرآة الوصول إليها. القيام بهذه الخطوة ببطء شديد وحركات صغيرة جدا في، بالتناوب بين الجبهة ونهاية المرايا.
4. تأكد من أن تي: ضرب سا و / أو OPO الحزم المرايا دخول في، مكانة مركزية المناسبة.
   1. استخدام قطعة من الورق الأبيض (غير لامعة جدا أو يعكس!) وعارض الأشعة تحت الحمراء لرصد شعاع OPO والطول الموجي أعلى تي: الحزم سا.
      1. ارتداء نظارات واقية عند العمل مع قوائم الجرد الوطنية تي: الحزم سا (عادة ما يصل الى 720-750 نانومتر مرئيا بالنسبة للشخص العادي).
   2. تعيين قوة الليزر (ق) عند أدنى مستوى ممكن لإجراء المحاذاة وذلك لميnimize الأضرار التي تصيب العين المحتملة.
   3. دائما إبقاء الأضواء المحيطة في الغرفة على، بحيث يتم مقيدة تلميذ العين.
   4. نضع في اعتبارنا أن قوة الليزر هي مخففات تتكون من لوحة والمستقطبات λ / 2، والتي ليست في الواقع حتى الآن عندما تسيطر تي غرامة: سا شعاع يدخل إلى مسح الرأس!
5. تأكد من أن يتم ضرب الحجاب الحاجز نقطة دخول في منتصف من قبل منظمة الشفافية الدولية: سا و / أو OPO شعاع؛ إن لم يكن، وضبط المرايا الماضيين قبل أن يدخل شعاع الليزر على مسح الرأس.
   1. استخدام الأشعة تحت الحمراء المشاهد وقطعة صغيرة من ورقة بيضاء (ولكن ليس لامعة / عاكسة!)
   2. إغلاق دائما الحجاب الحاجز في دخول المجهر، بحيث موقف شعاع الليزر يمكن الحكم بدقة أكبر. المهم: لا ننسى أن إعادة فتح الحجاب الحاجز قبل الانتقال إلى الخطوة 6!
6. ضبط الليزر مسار شعاع ضوء ينعكس في المجهر وفقا لذلك. القيام بذلك على قطاعات صغيرة ومتكررة أداء شعاع واlking.
   1. التحقق من مسار الضوء بالكامل إذا خرج الضوء من العدسة الشيئية غير كافية.
   2. دائما التحقق من مسار الضوء عند استخدام النظام للمرة الأولى بعد فترة طويلة الخمول، إصلاح كبرى، أي استبدال العناصر البصرية، أو إذا اشتبه مشاكل في الوجود مع الإخراج.
7. تأكد من أن جميع الأسطح البصرية النشطة نظيفة، خاصة أنها خالية من الغبار! إذا تتم تغطية الأسطح بطبقة من الغبار، ويتم تشويه جبهة الموجة حتى قبل دخول عدسة الهدف وسوف ينتج شعاع الليزر أبدا تقديم صورة حادة من العينة!
   1. إذا لزم الأمر، وتنظيف المرايا مع قطعة مطوية من الورق عدسة، مبلل مع الايثانول أو الأيزوبروبانول.
8. تأكد من أن شعاع يصل الى المرآة التي تقع مباشرة فوق المرآة الدخول في نهاية القائمة على منظور نبض ضاغط، بعد أن يتم تعيين مسار الضوء. من هنا، وينعكس شعاع طn لمعدد شعاع (BM).
9. معرفة ما اذا كان شعاع الليزر يضرب الحجاب الحاجز الذي يقع في مدخل متعدد شعاع، مباشرة أمام لوحة λ / 2، وتغيير الاستقطاب من شعاع الليزر لتناسب متطلبات لواسعة النطاق لنقل 50٪ و 50٪ انعكاسا ضمن BM.
   1. الأولى، إغلاق الحجاب الحاجز بحيث موقف شعاع يمكن الحكم بدقة أكبر وأداء شعاع المشي بين اثنين من أغشية، أي واحد على دخول المجهر والآخر عند مدخل BM. لغيرها من المجاهر واحد العارضة المسح يجب أن يكون موجودا الحجاب الحاجز في دخول س ص الماسح الضوئي.
   2. إذا لا شعاع ضرب وسط الفتحة مغلقة إلى أسفل، وضبط المرآة المذكورة أعلاه، وضعت مباشرة قبل دخول الحجاب الحاجز BM. المهم: لا ننسى أن إعادة فتح الحجاب الحاجز قبل الانتقال إلى الخطوة 10.
10. مع فتح الحجاب الحاجز، معرفة ما اذا كان شعاع الليزر يضرب المرايا BM فيهذه نقطة الوسط. استخدام شريط ضيق من الورق حتى لا لمنع جزء آخر من التعقيد في ضوء مسارات BM المفضل
11. معرفة ما اذا كان شعاع يضرب وسط المرايا الخروج: مرآة لأعلى الاستقطاب الموازي "P"، مرآة للأسفل عمودي الاستقطاب "S". إن لم يكن، وضبط المرآة الدخول قبل BM.
12. معرفة ما اذا كان "S" و "P" شعاع الاستقطاب تسمح بإدخال مجموعات المكعب المستقطب وتتداخل بشكل مناسب في دخول س ص الماسح الضوئي. تخطي هذه الخطوات في حال تم استخدام المجهر الضوئي واحد العارضة.
13. معرفة ما اذا كان ضوء الليزر يمر مركزي الفحص والعدسات أنبوب ويحصل خلال منتصف العدسة الهدف 'البؤري الخلفي. المهم: هذه الخطوة لابد من القيام به مع شعاع الليزر في موقف وسط، وليس في موقف سيارات!
    1. استبدال عدسة الهدف مع أداة تهدف ("عين الثور") ومعرفة ما اذا كان شعاع الليزر يضرب الهدف في الوسط، وعما إذا كانتإضاءة حتى هو.
    2. إذا كان هذا يبدو أن هذا هو الحال، وإغلاق الفتحة قبل BM ومعرفة ما اذا كان يظهر نمط التداخل دائرية، مع دائرة سوداء في الوسط (الحد الأدنى تدخل).
       1. ضبط المرآة الدخول إذا كان هناك تحول كبير بالنسبة لمركز عين الثور.
14. الآن استبدال عين الثور مع عدسة الهدف، على سبيل المثال مع عدسة مياه الغمر 20X.
    1. تحقق من الضوء حقل الانتاج مع قطعة من الورق الأبيض. وهذا ينبغي أن يكون مشرقا وموحدة ووضع مركزيا.
    2. قياس انتاج الطاقة: 100٪ OPO مع 100٪ ضخ تي: سا (4 W)، ينبغي للمرء أن يحصل تقريبا. 100-150 ميغاواط بعد عدسة عند 1،100 نانومتر (في المجهر المستخدمة هنا). سوف القوى الليزر أقل لا تكفي لأداء متعددة الحزم SI-TPLSM. لواحد العارضة المسح SI-TPLSM، 5-10 ميغاواط تكفي. يجب أن يظل شعاع الليزر في موقف وسط من دون أن scanneد!
15. إذا كان أداء MB-SI-TPLSM، محاذاة المرايا في BM على النحو التالي:
    1. وضع عينة الاستشعاع متجانس، مثل شريحة مضان أحمر، على المسرح وتركيز شعاع الليزر داخل العينة ولكن بالقرب من السطح العلوي (أي على مقربة من عدسة 'أمام الهدف).
    2. تعيين المجهر لوضع متعددة الحزم واختيار عدد من الحزم، في البداية، ويفضل شعاع واحد فقط، والاستقطاب، على سبيل المثال "P".
       1. العثور على شعاع الليزر من خلال التصوير الشريحة الفلورسنت: تعيين "P" مصراع فتح وتشغيل الكاميرا CCD بشكل مستمر في حين تركز شعاع.
       2. تأكد من أن الشعاع هو في موقف وسط، وأن الماسح الضوئي هو خارج. تأكد من عدم تفحص شعاع!
       3. العثور على شعاع من خلال البحث عن نقطة مضيئة بالقرب من مركز للرقاقة الكاميرا.
       4. تركيز شعاع حتى بقعة هو ألمع وأكبر، أي الطائرة صورة المجهر يتوافق مع موقف رقاقة الكاميرا؛ تقليل قوة الليزر بحيث لا يتم المشبعة الفور. مع نظام تتماشى جيدا وهذا يعني أن قوة الليزر يجب أن يكون بالقرب من الحد الأدنى عند العمل في وضع شعاع واحد (حوالي 0.6 ميغاواط طاقة الليزر يجب أن تعمل).
       5. إذا كانت البقعة بشكل ملحوظ قبالة مركز، نقله أقرب إلى مركز عن طريق ضبط المرآة في الجبهة BM (أو من الماسح الضوئي لاحد العارضة المسح).
       6. عند محاذاة أيضا الاستقطاب الأخرى، أي "S" شعاع، والتبديل إلى الوضع الآن 2 شعاع، افتح "S" مصراع والتحقق من موقف شعاع (شعاع واحد فقط يمكن أن ينظر إليه إلا إذا كان "S" مصراع مفتوح ).
       7. عندما تنتهي من ذلك، قم بالتبديل إلى وضع 4 الحزم واستخدام "P" واسطة الاستقطاب ("P" فتح مصراع). الآن سوف تظهر اثنين beamlets.
       8. ترتيب beamlets اثنين لتكون موازية تماما إلى الحافة السفلى من وجهة نظر الكاميرا، ومجموعة منهم ليكون 2.8 ميكرومتر إربا.
          >
          1. إذا لم يتم محاذاة بشكل صحيح، وضبط المرآة الأولى من BM.
          2. أبدا محاذاة المسمار في الوسط، بدلا من استخدام المسمارين الطرفية لتحريك المرآة حتى شعاعين هي 2.8 أم، وبصرف النظر تماما رتبت أفقيا.
       9. الآن التبديل إلى وضع 8 شعاع في "P" الاستقطاب، وضبط المرآة BM الثاني (أيضا دون نقطة حمراء) حتى 4 beamlets هي على مسافة واحدة عند 2.8 ميكرون، ويتم ترتيب بالتوازي مع الحافة السفلية من الصورة.
       10. تكرار في 16 - 32 ووضع شعاع، وضبط 3rd و 4th المرايا BS، على التوالي. فمن المهم للbeamlets أن تكون على مسافة واحدة بسبب SI-الخوارزميات، وأبسط كونها خوارزمية دقيقة ماكس (حلو)، وبناء على هذا الافتراض.
16. استبدال نموذج موحد الفلورسنت بأخرى منظم heterogeneously، مثل جذور زنبق الوادي عبر الملون.
    1. انتقل إلى موقف للسيارات من شعاع الإثارة، ثوعادة ما يتم وضع hich في القيم كبيرة من الإحداثيات الماسح الضوئي، على سبيل المثال (10،000؛ 10،000).
    2. مسح (متعددة الحزم) صورة مع كاميرا CCD. تأكد من أن الصورة تظهر حادة، وموحدة، وعلى التوالي.
    3. ضبط الكاميرا في حالة ظهور الصورة استدارة: تحريف جسم الكاميرا محوريا حول محور عمودي من جهة (أن يكون لطيف!) حتى يتم تقويمها الصورة.
17. بدء س ص الماسح الضوئي من أجل التحكم في عملية المسح الضوئي لتوليد نمط الإثارة، وصورة أي مخطط.
    1. في حالة متعددة الحزم المسح، حرك المرآة ص الماسح الضوئي، مثال. عمودي على خط beamlet، في مثل هذه الطريقة لتوليد صورة مخطط من الدرجة الثانية.
    2. إذا كان مجال الرؤية ولدت كما هو موضح في الخطوة 17.1. صغير جدا، وتوسيع نطاق الروتين المسح عن طريق تحريك المرآة س الماسح الضوئي إلى موضع ضمان تضاعف خط شعاع دعونا وbeamlets هي على مسافة واحدة على طول الخط كله. كرر الحركة بالضبطالمرآة ص الماسح الضوئي بعد أن يتم نقل المرآة س الماسح الضوئي لتوليد صورة مخطط أكبر.
    3. في حالة واحدة شعاع المسح، بالتناوب حركة المرآة ص الماسح الضوئي مع حركة مرآة X-الماسح الضوئي مرارا وتكرارا في مواقف على مسافة واحدة - التي حددها العلماء - لتوليد صورة مخطط المطلوب.
    4. تأكد من استخدام لحركة المرآة ص الماسح الضوئي لأمر بسرعة ثابتة (خفض التسارع / التباطؤ) وللمرآة واحدة X-الماسح الضوئي في أقصى سرعة (أقصى تسارع / تباطؤ).
18. يكتسب تلقائيا وحفظ الصورة مقلم مع الكاميرا (حقل كاشف). وبالتالي، مزامنة الكاميرا مع الماسح الضوئي واستخدام الماسح الضوئي كما الزناد الرئيسي.
19. تكرار الحصول على صور مخطط (بروتوكول المسح هو موضح في البروتوكول 17) عن طريق تحريك المرآة س الماسح الضوئي في مواقع مختلفة على النحو التالي:
    1. اختيار الخطوات التكرار بما فيه الكفاية وطول الخطوة المناسبة بينصورتين مخطط لاحقة لتغطية مسافة بين اثنين من beamlets متتالية (في هذه الحالة 2.8 ميكرون وخطوة واحدة من المرايا الماسح الضوئي يساوي 25 نانومتر)؛ قد يكون من المستحسن السماح القليل من التداخل، أي مبلغ إضافي 0.3-0.4 ميكرومتر.
    2. تعيين التحول x إلى قيمة يطابق قرار الحد الجانبي في الطول الموجي معين. على سبيل المثال، باستخدام 10 خطوات للمرآة X-الماسح الضوئي في التحول و 12 أو 13 التحولات تؤدي إلى أفضل النتائج كل من محوري والقرار الوحشي في هذا النظام. تحقق مع شريحة مهيكلة مثل زنبق الوادي جذور الشريحة، أرقام التي تعمل بشكل أفضل في النظام المستخدمة.
    3. تحسين هذه القيمتين حتى تصبح الصورة أشد زنبق الوادي: استخدام الأداة خط صورة على الصور SI المحسوب ومقارنة عرض ملامح خط (والذي هو إشارة مضان من جدران الخلايا زنبق الوادي).
    4. الحصول على كل صورة مخطط متزامنة مع حركة الماسح الضوئي وحفظها على حدة، على سبيل المثال كما شجار أو الملفات الثنائية.
20. فتح مجموعة كاملة من الصور مخطط كما المصفوفات، أي مصفوفة 3D، في روتين التقييم واستخدام إما خوارزمية دقيقة كحد أقصى أو خوارزمية تحويل فورييه، لتوليد مصفوفة 2D من ذات الدقة العالية SI-الصورة. والخوارزميات التي سبق وصفها بالتفصيل ^20.

الفئران التحصين والتحضير لتصوير حيوي داخلي

تمت الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل اللجان الولائية المناسبة لرعاية الحيوان (LAGeSo، Landesamt FÜR Gesundheit اوند Soziales، برلين) وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح (حيوان التجربة G0153/08 الترخيص) الحالي.

21. تم إجراء تحريض استجابة مركز جرثومي في العقدة الليمفاوية المأبضية وإعداد مجال التصوير كما هو موضح قبل ^4. تنقية الخلايا B immunomagnetically من الطحال من B1-8 ^{+ / +} Jκ ^{- / -}والخلايا B من B1-8 ^{+ / +} Jκ ^{- / -} GFP ⁺ الفئران.
22. حقن عن طريق الوريد 3 × 10 ⁶ خلايا NP-B محددة بدرجة نقاء> 95٪ باستخدام ⅛ B1-8 ^{+ / +} Jκ ^{- / -} GFP ⁺ و⅞ nonfluorescent B1-8 ^{+ / +} Jκ ^{- / -} في C57BL / 6 المتلقين .
23. يوم واحد بعد نقل الخلايا تحصين المستلمين مع 10 ميكروغرام من NP-CGG (nitrophenyl الدجاج ɣ الجلوبيولين) مستحلب في مساند فرويند الكامل (CFA) في حق الخلفيتين وسادة الغذاء.
24. شظايا فاب تسمية الأضداد anti-CD21/CD35 مع ATTO590-succinimidyl استر.
    1. لتسليط الضوء على شبكة من الخلايا الجذعية الجريبي (FDC) في مركز جرثومي في الجسم الحي، وضخ 10 ميكروغرام من المسمى تألقي شظايا فاب في قاطع الطريق الخلفيتين الأيمن من ساعة الفئران 12-24 قبل أن يتم إجراء تحليل حيوي داخلي.

وينبغي أن تكون الخطوات التالية consideالأحمر لإعداد العقدة الليمفاوية المأبضية لintravital التصوير (8-10 يوم بعد التحصين):

25. تخدير الماوس عن طريق الحقن الملكية الفكرية من الكيتامين / زيلازين، وكمية اعتمادا على وزنهم.
26. اختبار ردود الافعال لرصد عمق التخدير خلال فترة التصوير كلها.
27. يحلق الساق والظهر والجهة اليمنى من الماوس صارمة واستخدام كريم لإزالة الشعر السماط المتبقية تماما.
28. إصلاح المدور حق رئيسية: تحديد موقع رقاقة عظمية مع الأصابع، تعيين شق الجلد مع مقص صغير حتى يظهر على شكل المثلث الأبيض لفافة صغيرة.
29. المشبك رقاقة عظمية تحت هذه اللفافة مع ملاقط وأشار من كابح.
30. إصلاح العمود الفقري في المنطقة القطنية باستخدام الملقط مسننة.
31. إصلاح الساق الخلفية اليمنى على كابح وتشديد المسمار.
32. ذيل الشريط للحفاظ على الساق في المكان المناسب.
33. في الجانب الذيلية من الفخذ، وخلق شق في الجلد، في المنطقة التي البارز المأبضية الوريد ENTEالتمرير الأنسجة، فصل الجلد عن الأنسجة الكامنة مع ملاقط حادة واتبع الوريد المأبضية من الأقرب إلى القاصي.
34. فضح العقدة الليمفاوية باستخدام الملقط حادة، في محاولة لتجنب قطع من أجل حماية الأوعية اللمفاوية غرامة (نضع العقدة الليمفاوية في برنامج تلفزيوني خلال تعريض).
35. إنشاء دائرة الشحوم فراغ حول العقدة الليمفاوية، وملء هذا عجن مع برنامج تلفزيوني.
36. وضع غطاء زلة في موقفها ووضع مقياس الحرارة مسبار (الحفاظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية، وإلا فإن سرعة الخلية سوف تختلف بشكل كبير).
37. على طول الحافة العلوية من انزلاق الغطاء إضافة دائرة من الشحوم فراغ.
38. وضع لفائف التدفئة في موقفها من الشحوم فراغ، إنشاء ختم بطريقة مماثلة كما كان من قبل، وإضافة الماء / برنامج تلفزيوني على زلة غطاء زجاجي لتراجع موضوعي في.
39. بعد التصوير، ويتم الاحتفاظ الماوس في التخدير، مع زيادة جرعة من الكيتامين / زيلازين لجرعة قاتلة، تليها خلع عنق الرحم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

القرار المكانية في الغدد الليمفاوية

أبعاد فعالية وظيفة انتشار نقطة (EPSF) تتوافق مع القرار المكاني للمجهر ^12. قمنا بقياس هذه الوظيفة ثلاثية الأبعاد من خلال الحصول على إشارة الجيل الثاني من التوافقيات ألياف الكولاجين في الغدد ا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الهدف من التصوير الضوئي حيوي داخلي هو حيوي وظيفيا تصور الحركة الخلوية والتفاعلات من أجل فهم الأنسجة وظيفة الجهاز في الصحة والمرض ^5. التكنولوجيا الأقوى لتحقيق ذلك، متعدد الفوتون الليزر المجهر، لا تزال لديه للتغلب على القيود المتعلقة موجة التشوهات الجبهة، نثر، ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ATTO590 – NSH for coupling	ATTO Tec, Germany	AD-590-35
CD21/35 – Fab fragment – ATTO590	DRFZ, Berlin		The coupling reaction was performed in the central lab of our institution.
B1-8 Jk-/- EGFP+	Prof. Anne Habermann, Yale Univ., CA, US		Can be also found at Jackson Laboratories (JAX).
EasySep Negative Selection Mouse B Cell Enrichment	StemmCell Technologies, Germany	19854
Polystyren beads (605), 0.2 µm	Life Technologies, Germany	F8803
Equipment
TriMScope I	LaVision Biotec, Bielefeld, Germany
OPO (manual version)	APE, Berlin, Germany
Ti:Sa Laser Chameleon Ultra II	Coherent, Duisburg, Germany
Water-immersion objective lens, 20X, NA 0.95, IR, WD 2 mm	Olympus Germany, Hamburg, Germany