JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تحليل بروتيوم من الظهارة الحسية قوقعة يمكن أن يكون تحديا نظرا لصغر حجمها ولأن البروتينات الغشاء يصعب عزل والتعرف عليها. ويمكن تحديد كل من الغشاء وبروتينات قابلة للذوبان عن طريق الجمع بين أساليب وتقنيات متعددة إعدادي فصل جنبا إلى جنب مع عالية الدقة قياس الطيف الكتلي.

Abstract

البروتيوميات هو نهج شائعة الاستخدام التي يمكن أن توفر نظرة ثاقبة النظم البيولوجية المعقدة. الظهارة الحسية قوقعة يحتوي على المستقبلات التي تنبيغ الطاقة الميكانيكية الصوتية إلى طاقة الكهربائية والكيميائية التي تتم معالجتها بواسطة الجهاز العصبي المحيطي والمركزي. وقد تم تطوير العديد من التقنيات لدراسة البروتين في الأذن الداخلية القوقعة، مثل ثنائية الأبعاد الكهربائي الفرق هلام (2D-DIGE)، الأجسام المضادة ميكروأري، ومطياف الكتلة (MS). MS هو الأداة الأكثر شمولا وتنوعا في البروتينات وبالتزامن مع أساليب الانفصال يمكن أن توفر بروتيوم متعمق لعينات بيولوجية. طرق الفصل جنبا إلى جنب مع مرض التصلب العصبي المتعدد لديه القدرة على تخصيب عينات البروتين، والكشف عن منخفض الوزن الجزيئي والبروتينات مسعور، وتحديد البروتينات وفرة منخفضة من خلال تقليل النطاق الديناميكي بروتيوم. استراتيجيات الهضم مختلفة يمكن تطبيقها على المحللة كله أو مجزأ إلى البروتين المحللة لتعزيز الببتيد والبروتيناتتغطية التسلسل. يمكن تطبيق استخدام تقنيات الفصل المختلفة، بما في ذلك تبادل قوي الموجبة (SCX)، عكس المرحلة (RP)، ومزال هلام السائل الكهربائي جزء فخ (GELFrEE) للحد من تعقيد العينة قبل التحليل MS لتحديد البروتين.

Introduction

البروتينات هي دراسة النظم البيولوجية المعقدة من خلال تحليل التعبير البروتين، وظيفة، والتعديلات، والتفاعلات 1. وقد تم استخدام عدة طرق للتحليل بروتيوم في الأذن الداخلية، بما في ذلك الأجسام المضادة ميكروأري 2، ثنائي الأبعاد الكهربائي للهلام 3-5، وDIGE 6. ومع ذلك، فقد تم التعرف فقط على عدد محدود من البروتينات وتتميز 2،7-10، مقارنة مع أكثر من 10،000 الجينات والعلامات تسلسل أعرب (التكنولوجيات السليمة بيئيا) التي تم تحديدها في الأذن الداخلية 11،12، MS هو الأسلوب الأكثر شيوعا شاملة و في البروتيوميات لتوصيف البروتين. تحليل عينات البروتين المعقدة، مثل القوقعة، يمكن أن يكون تحديا. ومع ذلك، فإن الجمع بين تقنيات فصل متعددة مع MS تمكن من تحديد عدد أكبر من الببتيدات والبروتينات، ويرجع ذلك إلى زيادة تركيز مجموعة ديناميكية وقدرة الذروة 13. chromatogra متعددة الأبعادفيز البروتين يقلل من مخاليط معقدة للغاية من خلال السماح للاستخدام آليات امتصاص مختلفة. هناك نوعان من يشيع استخدام MS نهج تحليل بروتيوم، بندقية والبروتينات من أسفل إلى أعلى. في البروتيوميات بندقية، وهي مزيج من البروتينات سليمة يتم هضم إنزيمي وفصلها باستخدام اللوني المتعدد الأبعاد مع القوي الموجبة لتبادل اللوني (SCX)، يليه اللوني السائل عكس المرحلة (RPLC) 14،15. تخضع الببتيدات فصلها لبالترادف MS وقاعدة بيانات البحث 15. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أن الآلاف من البروتينات يمكن تحديدها في تحليل واحد والأسلوب هو أكثر ملاءمة للبروتينات الغشاء.

في نهج من أسفل إلى أعلى، ويتم فصل خليط من البروتين، وعادة عن طريق واحد أو الكهربائي ثنائي الأبعاد، والعصابات البروتين الفردية أو بقع قطع ويتفاعل مع انزيم مثل التربسين، مما أدى عادة في الببتيدات المتعددة. ومع ذلك، وآخر أكثر حداثةوضعت لاي نهج الكهربي، وتستخدم في تحليل البروتينات من أسفل إلى أعلى، هو GELFrEE. هذه التقنية fractionates عينات البروتين في السائل المرحلة ويجعلها أقل تعقيدا قبل التحليل. هذا الأسلوب هو استنساخه، ويوفر الانتعاش عالية من البروتين، ويقلل من توزيع البروتينات وفرة عالية في عينات البروتين المعقدة 16. الببتيدات الناتجة عن البروتينات فصل، يتم تحليلها من قبل MS، باستخدام الببتيد البصمات الشامل أو بالترادف MS (MS / MS)، لإنشاء علامات تسلسل لقاعدة البيانات بالبحث 17-19. بعض من أهم مزايا استخدام نهج من أسفل إلى أعلى هي القدرة على الحصول على فصل عالية الدقة والتغطية واسعة النطاق البروتين. البروتينات من أسفل إلى أعلى هو الأسلوب الأكثر استخداما على نطاق واسع في تحليل البروتينات 20، وبالتالي، تتوفر العديد من الأدوات المعلوماتية الحيوية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن فصل البروتينات في خليط معقد قبل الهضم، وحتى لا يكون هناك فرصة أكبر لتحديد الهوية.

واحدة من التحديات الرئيسيةفي استخدام الأذن الداخلية لتحليل البروتين هو صغر حجمها، وسهولة الوصول المقيدة، ونوع من الخلايا التنوع 21. بالإضافة إلى ذلك، البروتينات الرئيسية التي تميز وظائفه، مثل القنوات الأيونية، ونقل المستقبلات، هي بروتينات الغشاء، والتي يمكن أن يكون من الصعب عزل 22. وبالتالي، عينة إعداد بمساعدة فلتر (FASP) هو مفيد لتحليل البروتين من الأنسجة التي تقتصر لاستخراج البروتين والتي تتطلب المنظفات للذوبان الأغشية 23. هذه التصفية يسمح للتحليل MS من الغشاء والبروتينات القابلة للذوبان ونظرا لقدرته على عزل الببتيدات من الملوثات منخفضة الوزن الجزيئي 23،24.

يصف هذا البروتوكول النهج البروتين شائعة الاستخدام التي يتم الجمع بين وتعديلها لتحليل البروتينات على حد سواء للذوبان والغشاء وزيادة عدد معرفات البروتين من الظهارة الحسية قوقعة. سنقوم بشرح استخدام البروتينات بندقية مع FASP متعددة هضم-ايون، وتبادل اللوني أيون، وارتفاع القرار MS، وتحليل البيانات. بالإضافة إلى ذلك، فإننا سوف تصف البروتينات من أسفل إلى أعلى مع GELFrEE، FASP متعددة الهضم، وارتفاع القرار MS، وتحليل البيانات.

Protocol

بيان الأخلاق

تمت الموافقة على التجارب باستخدام الفئران الأنسجة من جامعة جنوب فلوريدا المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (بروتوكولات 3931R، 3482R) على النحو المبين في إطار المبادئ التوجيهية من المعاهد الوطنية للصحة.

1. استخراج البروتين

  1. عزل ظهارة الحسية قوقعة من 16 عاما لمدة 30 يوما (P30) الفئران CBA / J وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  2. في يوم من التجربة، وغسل الأنسجة مع 500 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة 1X (PBS). أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 1000 XG، وإزالة طاف. تكرار لما مجموعه ثلاثة يغسل.
  3. الأنسجة يصوتن لمدة 30 ثانية على الجليد في 100 ميكرولتر من تحلل العازلة التي تحتوي على 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 120 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 50 ملي ناف، 5 ملي EDTA، و 500 ميكروغرام / مل AEBSF، 10 ميكروغرام / مل leupeptin، و 100 ميكروغرام / مل pepstatin، 2 ميكروغرام / مل أبروتينين، و 0.5 ميكروغرام / مل microcystin باستخدام dismembrator الصوتية (نموذج 100؛ الحرارية فيشر). المحللة باردة على الجليدلمدة 1 دقيقة بين كل صوتنة. يصوتن ما مجموعه 3X.
  4. أجهزة الطرد المركزي في استخراج 750 XG في 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة وإزالة طاف لmicrotube جديدة. استخراج بيليه في 50 ميكرولتر من العازلة تحلل بواسطة sonicating لمدة 30 ثانية على الجليد. أجهزة الطرد المركزي في استخراج 750 XG في 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. الجمع بين كلا لست] والطرد المركزي في 28،600 XG في 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. إزالة طاف لmicrotube جديدة وإضافة 20 ميكرولتر تحلل العازلة التي تحتوي على 0.1٪ ASB-14 لبيليه. دوامة لمدة 1 دقيقة واحتضان لمدة 60 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  5. تسخين العينة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم تبرد في 4 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. متابعة مع الطرد المركزي في 16،000 XG في درجة حرارة 25 مئوية لمدة 10 دقيقة. جمع طاف ونقل إلى أنبوب جديد.
  6. الطرد المركزي تعليق على 16،000 XG في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق والاحتفاظ طاف لعملية الهضم.

2. ضعف الهضم البروتين زيتية من المحللة الجامعة عن طريق FASP

  1. إضافة 30 μل قسامة (≤ 400 ميكروغرام) من قوقعة استخراج البروتين وتحتوي على 4٪ من الصوديوم كبريتات دوديسيل (SDS)، و 100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.6 و 0.1 M dithiothreitol (DTT) مباشرة إلى تدور مرشح 30K وتخلط مع 200 ميكرولتر من 8 M اليوريا في تريس، حمض الهيدروكلوريك. أجهزة الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 15 دقيقة.
  2. تمييع التركيز مع 200 ميكرولتر من محلول اليوريا 8 م والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 15 دقيقة.
  3. إضافة 10 ميكرولتر من 10X iodoacetamide (IAA) في 8 حل M اليوريا إلى التركيز في تصفية ودوامة لمدة 1 دقيقة. احتضان مرشح تدور لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام تليها الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من محلول اليوريا 8 M إلى التركيز على وحدة التصفية والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 15 دقيقة. كرر هذه الخطوة 2X. إضافة 100 ميكرولتر من 50 ملي بيكربونات الأمونيوم (ABC) الحل إلى وحدة التصفية والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة 2X.
  5. إضافة 0.4 ميكروغرام / ميكرولتر من التربسين في 1:100 (ث / ث) انزيم لنسبة البروتين واحتضان بين عشية وضحاها (O / N) عند 37 درجة مئوية.
  6. بعد الحضانة، وإضافة 40 ميكرولتر من 50 ملي ABC حل لتصفية وحدة والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة 1X.
  7. إضافة 50 ميكرولتر من 0.5 M كلوريد الصوديوم حل للمرشح تدور أجهزة الطرد المركزي في و14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. نقل الراشح تحتوي على الببتيدات زيتية لmicrotube الطازجة وتحمض مع حمض الفورميك (FA) إلى 1.0٪ لوقف عملية الهضم.
  8. غسل وحدة التصفية مع 40 ميكرولتر من 8 M اليوريا، ثم يغسل 2X مع 40 ميكرولتر 18 MΩ المياه.
  9. غسل تصفية وحدة 3X مع 100 ميكرولتر من 50 ملي ABC الحل. بعد غسل النهائي إضافة 0.4 ميكروغرام / ميكرولتر من التربسين في 1:100 (ث / ث) نسبة انزيم إلى البروتين واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
  10. أزل الببتيدات زيتية من الثانية هضم بإضافة 40 ميكرولتر من حل 50 ملي ABC إلى وحدة التصفية والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة 1X.
  11. إضافة 50 ميكرولتر من 0.5 M كلوريد الصوديوم حل لوحدة التصفية والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. نقل الراشح تحتوي على الببتيدات زيتية لmicrotube الطازجة وتحمض مع FA إلى 1.0٪.
  12. عينات يمكن قياسها كميا باستخدام صفيحة ميكروسكوبية مقايسة اللونية باستخدام BSA كمعيار.

3. Endoproteinase LysC وزيتية هضم البروتين المحللة من الجامعة عن طريق FASP

  1. إضافة قسامة 30 ميكرولتر (≤ 400 ميكروغرام) من قوقعة استخراج البروتين يحتوي على 4٪ SDS، 100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.6 و 0.1 M DTT مباشرة تدور مرشح 30K وتخلط مع 200 ميكرولتر من 8 M اليوريا في تريس، حمض الهيدروكلوريك . أجهزة الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 15 دقيقة.
  2. تمييع التركيز مع 200 ميكرولتر من محلول اليوريا 8 م والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 15 دقيقة.
  3. إضافة 10 ميكرولتر من 10X IAA في 8 حل M اليوريا إلى التركيز في تصفية ودوامة لمدة 1 دقيقة. احتضان مرشح تدور لمدة 20 دقيقة في RT في الظلام ثم الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من 8 M اليوريا سولution إلى التركيز على وحدة التصفية والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 15 دقيقة. كرر هذه الخطوة 2X. إضافة 100 ميكرولتر من 100 ملي ABC الحل إلى وحدة التصفية والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة 2X.
  5. إضافة 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر من endoproteinase LysC في 1:50 (ث / ث) نسبة انزيم إلى البروتين واحتضان O / N عند 30 درجة مئوية.
  6. بعد الحضانة، وإضافة 40 ميكرولتر من 100 ملي ABC الحل إلى وحدة التصفية والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة 1X.
  7. إضافة 50 ميكرولتر من 0.5 M كلوريد الصوديوم حل للمرشح تدور أجهزة الطرد المركزي في و14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. نقل الراشح تحتوي على الببتيدات LysC إلى microtube الطازجة وتحمض مع FA إلى 1.0٪ لوقف عملية الهضم.
  8. غسل وحدة التصفية مع 40 ميكرولتر من 8 M اليوريا، ثم يغسل 2X مع 40 ميكرولتر 18 MΩ المياه.
  9. غسل تصفية وحدة 3X مع 100 ميكرولتر من 50 ملي ABC الحل. بعد غسل النهائي إضافة 0.4 ميكروغرام / ميكرولتر من التربسين في 1:100 انزيم إلى المواليةنسبة TEIN واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
  10. أزل الببتيدات زيتية بإضافة 40 ميكرولتر من حل 50 ملي ABC إلى وحدة التصفية والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة 1X.
  11. إضافة 50 ميكرولتر من 0.5 M كلوريد الصوديوم الحل إلى وحدة التصفية والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. نقل الراشح تحتوي على الببتيدات زيتية لmicrotube الطازجة وتحمض مع 1.0٪ FA.
  12. يمكن قياس العينة باستخدام صفيحة ميكروسكوبية مقايسة اللونية مع جيش صرب البوسنة كمعيار.

4. الببتيدات عن طريق تحلية أعمدة سبين

  1. تفعيل عمود MacroSpin C 18 عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من أسيتونتريل (ACN) وأجهزة الطرد المركزي في 1100 x ج لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال الطرد المركزي بعد.
  2. يوازن العمود مع 500 ميكرولتر من 0.1٪ FA وأجهزة الطرد المركزي في 1100 x ج لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال وكرر هذه الخطوة 1X.
  3. تضيف ما يصل الى 500 ميكرولتر من الببتيد هضم للعمودد الطرد المركزي في 1100 x ج لمدة 1 دقيقة. وإذا كان حجم العينة أكبر من 500 ميكرولتر ثم كرر هذه الخطوة.
  4. غسل العمود مع 500 ميكرولتر من 0.1٪ FA وأجهزة الطرد المركزي في 1100 x ج لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال. كرر هذه الخطوة 1X.
  5. إضافة 250 ميكرولتر من نسبة 90:10 ACN إلى المياه إلى العمود وأجهزة الطرد المركزي في 1100 x ج لمدة 1 دقيقة. جمع شاطف تحتوي على الببتيدات المحلاة ونقلها إلى microtube الطازجة. كرر هذه الخطوة 1X.
  6. تجفيف عينة الببتيد المحلاة في جهاز للطرد المركزي فراغ وتجنب السماح للعينة جافة تماما.

5. التبادل الأيوني اللوني

  1. حقن 50-100 ميكروغرام من البروتين المهضوم عينة الصعود إلى 200 × 2.1 مم، 5 ميكرون العمود SCX (Polysulfoethyl A) لفصل الببتيدات.
  2. استخدام التدرج من 2-40٪ B أكثر من 50 دقيقة مع معدل تدفق 250 ميكرولتر / دقيقة. المذيبات (أ) هو فورمات الأمونيوم 5 ملم، ودرجة الحموضة 3.0 في أسيتونتريل 25٪ و 75٪ [ده 2 O. المذيبات B فورمات الأمونيوم هو 500 ملم، ودرجة الحموضة6.0 في ACN 25٪ و 75٪ [ده 2 O.
  3. رصد الكسور الببتيد في 280 نانومتر وجمع الكسور في فترات 2 دقيقة باستخدام أحد هواة جمع الكسر.
  4. الكسور الجافة في فراغ المكثف وresuspend في 500 ميكرولتر من 50٪ أسيتونتريل في DDH 2 O تحتوي على 5٪ FA للمساعدة في إزالة الملح.
  5. الكسور Redry وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام لتحليل نانو LC-MS/MS.

6. الأسيتون الهطول

قبل الانفصال GELFrEE البروتين طاف قوقعة لابد المحلاة. الأسيتون هطول يمكن استخدامها لdesalt والتركيز البروتينات.

  1. إضافة ثلاثة مجلدات من الأسيتون الجليد البارد لطاف القوقعة. دوامة بلطف واحتضان عند -20 درجة CO / N.
  2. أجهزة الطرد المركزي الخليط في عينة 15،000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية، وإزالة طاف.
  3. غسل بيليه البروتين 3X مع الأسيتون المبردة وأجهزة الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 5 دقائق في 4° C.
  4. الهواء الجاف بيليه وتذوب في 112 ميكرولتر من 18 MΩ المياه.
  5. تحديد تركيز البروتين باستخدام صفيحة ميكروسكوبية مقايسة اللونية.

7. GELFrEE تجزئة من القوقعة الحسية الظهارة

  1. إضافة 30 ميكرولتر من 5X العازلة عينة (0.25 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8، 10٪ (ث / ت) SDS، الجلسرين 50٪، و 0.5٪ (ث / ت) برموفينول الأزرق) إلى البروتين المحلاة علقت في 112 ميكرولتر من 18 MΩ الماء.
  2. إضافة 8 ميكرولتر من 1M DTT والحرارة على 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للحد من السندات ثاني كبريتيد البروتين. بعد تسخين تسمح التبريد إلى درجة حرارة الغرفة.
  3. إضافة 8 مل من تشغيل المخزن المؤقت إلى الخزان الأنود، 150 ميكرولتر من العازلة على التوالي لأخذ عينات جمع غرفة، و 6 مل من تشغيل المخزن المؤقت إلى الخزان الكاثود.
  4. إزالة أي العازلة التي قد تدفقت إلى حجرة العينة التحميل باستخدام ماصة.
  5. تحميل 150 ميكرولتر (≤ 1 ملغ) من خليط من البروتين قوقعة، في حجرة العينة التحميل باستخدام آر 8٪هو خلات خرطوشة مع مجموعة كتلة من 3،5 حتي 150 كيلو دالتون.
  6. أقطاب الدنيا وثيقة غطاء أداة لبدء التشغيل.
  7. في المرة الأولى التي تم إيقافها مؤقتا على صك إضافة 2 مل من تشغيل المخزن المؤقت إلى الخزان الكاثود واستئناف التشغيل.
  8. عند كل فاصل مؤقتا على الصك، وجمع عينة من غرفة جمع العينات باستخدام ماصة وإضافة إلى microtube المسمى حديثا. غسل 2X غرفة جمع مع 150 ميكرولتر من العازلة على التوالي وتجاهل.
  9. إضافة 150 ميكرولتر من العازلة الطازجة التوالي إلى غرفة جمع العينات واستئناف التشغيل. جمع الكسور البروتين على مدى فترة زمنية من 2.6 ساعة في إجمالي حجم 150 ميكرولتر / الكسر.

8. 1D جل الكهربائي من GELFrEE الكسور

1D الكهربائي للهلام يمكن استخدامها لتصور النتائج من GELFrEE تجزئة قبل الهضم الأنزيمي وتحليل MS. يمكن فصل GELFrEE الكسور البروتين على 4-15٪ هلام تريس، حمض الهيدروكلوريك.

  1. مزيج قسامة 5 ميكرولتر من كل جزء GELFrEE مع 5 ميكرولتر من عينة تمييع العازلة (350 ملي DTT في المخزن عينة).
  2. تسخين العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
  3. عينات بارد لRT.
  4. تحميل 10 ميكرولتر من كل جزء GELFrEE في الممرات هلام الفردية وتحميل 5 ميكرولتر من الجزيئية القياسية الوزن في حارة غير المستخدمة الماضي.
  5. تشغيل هلام في 125 V 1.5 ساعة أو حتى تصل الجبهة صبغ الجزء السفلي من هلام.
  6. إزالة بعناية الجل وصمة عار وصمة عار مع فضة بلس لتصور فصل البروتين.

9. هضم البروتين من الكسور GELFrEE طريق FASP

ويستخدم الإجراء FASP تعديل لإزالة المنظفات والهضم من الكسور GELFrEE.

  1. إضافة كل جزء الفردية مباشرة إلى وحدة التصفية 30K؛ المزيج مع 200 ميكرولتر من 8 M اليوريا في تريس، حمض الهيدروكلوريك وأجهزة الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 25 دقيقة.
  2. تمييع التركيز مع 200 ميكرولتر من محلول اليورياوأجهزة الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 12 دقيقة. كرر هذه الخطوة 1X.
  3. إضافة 10 ميكرولتر من 10X IAA في محلول اليوريا إلى التركيز في كل وحدة التصفية، دوامة لمدة 1 دقيقة، واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من محلول اليوريا إلى التركيز على وحدات التصفية والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 15 دقيقة. كرر هذه الخطوة 2X. إضافة 100 ميكرولتر من 100 ملي ABC الحل إلى وحدات التصفية والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة 2X.
  5. إضافة 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر من LysC ل1:50 (ث / ث) نسبة انزيم إلى البروتين إلى وحدات التصفية واحتضان O / N عند 30 درجة مئوية.
  6. بعد الحضانة، وإضافة 40 ميكرولتر من 100 ملي ABC حل للمرشحات تدور أجهزة الطرد المركزي في و14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة 1X.
  7. إضافة 50 ميكرولتر من 0.5 M كلوريد الصوديوم حل للمرشحات تدور أجهزة الطرد المركزي في و14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. نقل الراشح تحتوي على الببتيدات LysC من كل مرشح تدور إلى microtube الطازجة وتحمض مع trifluoroacحمض ETIC (TFA).
  8. غسل الفلاتر تدور مع 40 ميكرولتر من 8 M اليوريا، ثم غسل 2X مع 40 ميكرولتر 18 MΩ المياه.
  9. غسل الفلاتر تدور 3x أخرى مع 100 ميكرولتر من 50 ملي ABC الحل. بعد غسل النهائي إضافة 0.4 ميكروغرام / ميكرولتر من التربسين في 1:100 (ث / ث) نسبة انزيم إلى البروتين واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
  10. أزل الببتيدات زيتية من كل وحدة التصفية من خلال إضافة 40 ميكرولتر من 50 ملي ABC الحل والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة 1X.
  11. إضافة 50 ميكرولتر من 0.5 M كلوريد الصوديوم الحل إلى وحدات التصفية والطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 10 دقيقة. نقل الراشح تحتوي على الببتيدات زيتية من كل وحدة تصفية على microtube الطازجة وتحمض مع TFA.
  12. تجف جميع الملخصات في فراغ المكثف.

10. إعداد نموذج لLC-MS/MS

  1. LysC إعادة المجففة والببتيد زيتية هضم الكسور في 20 ميكرولتر من 0.1٪ FA ودوامة.
  2. عينات الطرد المركزي في 20،000 x ج لمدة 10دقيقة وإزالة الجزء العلوي 95٪ من عينة لعينة قارورة جديدة.
  3. حقن 5 ميكرولتر من كل جزء الببتيد على مصيدة 100 ميكرون × 25 مم عينة لإزالة الأملاح والملوثات وتنفيذ الفصل الكروماتوغرافي على 75 ميكرومتر × 10 سم C 18 عمود.
  4. استخدام التدرج من 2-40٪ B أكثر من 100 دقيقة مع معدل تدفق 200 NL / دقيقة. المذيبات (أ) هو 95٪ و 5٪ ddH2O أسيتونتريل تحتوي على 0.1٪ FA. المذيبات B هو 80٪ و 20٪ ACN ddH2O تحتوي على 0.1٪ FA.
  5. جمع عشرة جنبا إلى جنب أطياف الشامل لكل MS مسح على مطياف الكتلة عالية الدقة. تم استخدام مطياف الكتلة LTQ Orbitrap في هذه التجربة.

11. تحديد البروتين

  1. تحديد البروتينات باستخدام قاعدة بيانات تحتوي على كل UniProt الماوس إلى الأمام وعكس تسلسل البروتين والملوثات المشتركة. يستخدم برنامج MaxQuant مع محرك البحث التميمة للبحث في قاعدة بيانات البروتين.
  2. وتشمل معلمات البحث التي يمكن استخدامها؛ modific الثابتةأوجه من carbamidomethyl من السيستين، والتعديلات متغير من أكسدة ميثيونين، البروتين N محطة أستلة، والحد الأقصى من 2 غاب الانقسام. الحد الأدنى لطول الببتيد للنظر في تحديد 6 الأحماض الأمينية. إدخال الشامل الخطأ تركيز الببتيد من ± 8 جزء في المليون والتسامح جزء من كتلة 1.2 دا (خطأ الشامل يعتمد على مطياف الكتلة المستخدمة).
  3. في البرنامج MaxQuant، واستخدام 1٪ معدل اكتشاف كاذبة (روزفلت) لالببتيد والبروتينات تحديد الهوية. يتم سرد تحديد البروتين مع عدد من الببتيدات المتطابقة، والتغطية تسلسل المئة من البروتين، وتسلسل الببتيد.

النتائج

للحصول على بروتيوم الأكثر شمولا من الظهارة الحسية قوقعة، مطلوب تشريح الأنسجة سريعة قبل استخراج البروتين وإعداد العينات. اثنين من التقنيات البروتين يمكن استخدامها، وبندقية من أسفل إلى أعلى البروتينات. لتحضير عينات للتحليل البروتينات طلقات نارية، تم استخدام الإجرا?...

Discussion

الخطوات الرئيسية لتحقيق أقصى قدر من تحديد البروتين من ظهارة حسية القوقعة هي: 1) استخدام endoproteinases متعددة لعملية الهضم، 2) استخدام تقنيات فصل متعددة، و 3) استخدام مطياف الكتلة عالية الدقة. تطبيق الانزيمات متعددة يزيد من عدد من الببتيدات ويحسن التغطية تسلسل البروتين، ?...

Disclosures

الكتاب تعلن أي تضارب مصالح.

Acknowledgements

المؤلفين أشكر الدكتور كينت سيلي، مدير مركز ديسكفري المخدرات والابتكار (CDDI) مرفق البروتيوميات الأساسية في جامعة جنوب فلوريدا لاستخدام هذا المرفق. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح / NIDCD R01 DC004295 إلى BHAS

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
8% Tris-acetate cartridge Protein Discovery42103
AcetoneSigma-Aldrich179124
AcetonitrileHoneywell015-1L
AEBSFCalbiochem101500
Ammonium formateFisher ScientificAC16861
AprotininCalbiochem616370
ASB-14 Calbiochem182750-5GM
Bovine serum albuminBioRad500-0112
C18 column New ObjectiveA2511275 μm x 10 cm 
DC Protein AssayBioRad500-0116Microplate Assay Protocol
EDTASigma-AldrichE9884
Endoproteinase Lys-CSigma-AldrichP3428
FASP Protein Digestion KitProtein Discovery44250
Formic acid Fluka94318
GELFrEE Fractionation SystemProtein Discovery42001GELFrEE 8100
LeupeptinCalbiochem108975
MacroSpin ColumnThe Nest GroupSMM SS18VSilica C18
MicrocystinCalbiochem475815
PepstatinSigma-AldrichP5318
Polysulfoethyl A ColumnThe Nest Group202SE0503
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma-AldrichL3771
Sonic Dismembrator Thermo Fisher15-338-53Model 100
TrypsinSigma-AldrichT6567Proteomics Grade

References

  1. Domon, B., Aebersold, R. Review - Mass spectrometry and protein analysis. Science. 312, 212-217 (2006).
  2. Jamesdaniel, S., Hu, B., Kermany, M. H., Jiang, H., Ding, D., Coling, D., Salvi, R. Noise induced changes in the expression of p38/MAPK signaling proteins in the sensory epithelium of the inner ear. J. Proteomics. 75, 410-424 (2011).
  3. Thalmann, I., Hughes, I., Tong, B. D., Ornitz, D. M., Thalmann, R. Microscale analysis of proteins in inner ear tissues and fluids with emphasis on endolymphatic sac, otoconia, and organ of Corti. Electrophoresis. 27, 1598-1608 (2006).
  4. Thalmann, I., Rosenthal, H. L., Moore, B. W., Thalmann, R. Organ of Corti-specific polypeptides: OCP-I and OCP-II. J. Acoust. Soc. Am. 67, (1980).
  5. Kathiresan, T., Harvey, M., Sokolowski, B. . The use of two-dimensional gels to identify novel protein-protein interactions in the cochlea. In Auditory and vestibular research : methods and protocols. , (2009).
  6. Zheng, Q. Y., Rozanas, C. R., Thalmann, I., Chance, M. R., Alagramam, K. N. Inner ear proteomics of mouse models for deafness, a discovery strategy. Brain Res. 1091, 113-121 (2006).
  7. Peng, H., Liu, M., Pecka, J., Beisel, K. W., Ding, S. J. Proteomic Analysis of the Organ of Corti Using Nanoscale Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry. Int. J. Mol. Sci. 13, 8171-8188 (2012).
  8. Elkan-Miller, T., Ulitsky, I., Hertzano, R., Rudnicki, A., Dror, A. A., Lenz, D. R., Elkon, R., Irmler, M., Beckers, J., Shamir, R., Avraham, K. B. Integration of Transcriptomics, Proteomics, and MicroRNA Analyses Reveals Novel MicroRNA Regulation of Targets in the Mammalian Inner Ear. Plos One. 6, (2011).
  9. Yang, Y., Dai, M., Wilson, T. M., Omelchenko, I., Klimek, J. E., Wilmarth, P. A., David, L. L., Nuttall, A. L., Gillespie, P. G., Shi, X. Na+/K+-ATPase α1Identified as an Abundant Protein in the Blood-Labyrinth Barrier That Plays an Essential Role in the Barrier Integrity. . Plos One. 6, (2011).
  10. Shin, J. B., Streijger, F., Beynon, A., Peters, T., Gadzala, L., McMillen, D., Bystrom, C., Vander Zee, C. E., Wallimann, T., Gillespie, P. G. Hair Bundles Are Specialized for ATP Delivery via Creatine Kinase. Neuron. 53, 371-386 (2007).
  11. Chen, Z. Y., Corey, D. P. An inner ear gene expression database. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 3, 140-148 (2002).
  12. Gabashvili, I. S., Sokolowski, B. H., Morton, C. C., Giersch, A. B. Ion channel gene expression in the inner ear. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 8, 305-328 (2007).
  13. Horvatovich, P., Hoekman, B., Govorukhina, N., Bischoff, R. Multidimensional chromatography coupled to mass spectrometry in analysing complex proteomics samples. J. Sep. Sci. 33, 1421-1437 (2010).
  14. Ye, M. L., Jiang, X. G., Feng, S., Tian, R. J., Zou, H. F. Advances in chromatographic techniques and methods in shotgun proteome analysis. Trends Anal. Chem. 26, 80-84 (2007).
  15. Wu, C. C., MacCoss, M. J. Shotgun proteomics: Tools for the analysis of complex biological systems. Curr. Opin. Mol. Ther. 4, 242-250 (2002).
  16. Bora, A., Anderson, C., Bachani, M., Nath, A., Cotter, R. J. Robust Two-Dimensional Separation of Intact Proteins for Bottom-Up Tandem Mass Spectrometry of the Human CSF Proteome. J. Proteome Res. 11, 3143-3149 (2012).
  17. Chait, B. T. Mass spectrometry: Bottom-up or top-down. Science. 314, 65-66 (2006).
  18. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
  19. Reid, G. E., McLuckey, S. A. Top down' protein characterization via tandem mass spectrometry. J. Mass. Spectrom. 37, 663-675 (2002).
  20. Han, X., Aslanian, A., Yates, J. R. Mass spectrometry for proteomics. Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 483-490 (2008).
  21. Thalmann, I. Inner ear proteomics: A fad or hear to stay. Brain Res. 1091, 103-112 (2006).
  22. Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, (2007).
  23. Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).
  24. Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method. Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).
  25. Darville, L. N., Sokolowski, B. H. In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry. J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).
  26. Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O'Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

85 LC MS MS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved