excitotoxic المواد تحفيز الدماغ باعتبارها Microslices<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من السكتة الدماغية

Summary

قمنا بتطوير نموذج شريحة الدماغ والتي يمكن استخدامها لدراسة الآليات الجزيئية المشاركة في إصابات الدماغ بوساطة التحفيز الزائدة. هذا الأسلوب يولد أنسجة المخ ناضجة قابلة للحياة، ويقلل من أعداد الحيوانات المطلوبة لإجراء التجارب، في حين الحفاظ على الدوائر العصبية، والتفاعلات الخلوية، ومقصورات بعد المشبكي سليمة جزئيا.

Abstract

دراسة الآليات الجزيئية المشاركة في ظروف نيوروباثولوغيكال، مثل السكتة الدماغية، ويمكن أن يكون من الصعب عند استخدام أنظمة الحيوان كله. على هذا النحو، أو الأولية 'مثل العصبية' نظم زراعة الخلايا تستخدم عادة. في حين أن هذه النظم هي سهلة نسبيا للعمل مع، وتكون نموذجا مفيدا في نظم فيه مختلف النتائج الفنية (مثل موت الخلايا) يمكن أن يكون كميا بسهولة، ونتائج فحص والممرات في الخلايا العصبية غير ناضج مثقف (مثل مسارات موت الخلايا بوساطة التحفيز الزائدة) ليست بالضرورة هي نفس تلك التي لوحظت في الدماغ ناضجة، أو في أنسجة سليمة. وبالتالي، هناك حاجة لتطوير نماذج التي الآليات الخلوية في الأنسجة العصبية الناضجة يمكن فحصها. قمنا بتطوير تقنية في المختبر والتي يمكن استخدامها لتحقيق مجموعة متنوعة من المسارات الجزيئية في النسيج العصبي سليمة. تقنية الموضحة في هذه الوثيقة تستخدم الأنسجة القشرية الفئران، ولكن هذه التقنية يمكن تكييفها لاستخدام الأنسجةمن مجموعة متنوعة من الأنواع (مثل الماوس، الأرنب، خنزير غينيا، والدجاج) أو مناطق الدماغ (على سبيل المثال، الحصين، المخطط، الخ). بالإضافة إلى ذلك، مجموعة متنوعة من التحفيز / العلاجات يمكن استخدامها (على سبيل المثال، excitotoxic المواد، وإدارة مثبطات، الخ). في الختام، ونموذج شريحة الدماغ الموصوفة هنا يمكن استخدامها لدراسة مجموعة متنوعة من الآليات الجزيئية المشاركة في إصابات الدماغ بوساطة التحفيز الزائدة.

Introduction

الشكل الأكثر شيوعا من السكتة الدماغية هي السكتة الدماغية، والذي يحدث عندما تصبح الأوعية الدموية الدماغية المغطي. ونقص تروية الأنسجة التي تنتج عن توقف تدفق الدم يسبب الاستقطاب على نطاق واسع من الأغشية، والإفراج عن الناقلات العصبية مثير، والارتفاع المطرد من الكالسيوم داخل الخلايا، مما يؤدي إلى تفعيل مسارات موت الخلايا ^1. وقد أطلق على هذه العملية "التحفيز الزائدة '، وهو الطريق الشائع متورطة في قتل الخلايا العصبية التي تنتجها مجموعة متنوعة من الأمراض، بما في ذلك السكتة الدماغية ^2. تثبيط مسارات الإشارات المشاركة في التحفيز الزائدة وغيرها من أجهزة الطرد المركزي موت الخلايا العصبية هو نهج جذابة للحد من الأضرار العصبية التالية السكتة الدماغية.

يمكن تحديد الآليات الجزيئية الدقيقة التي تدخل في التحفيز الزائدة والسكتة الدماغية يكون من الصعب عند استخدام أنظمة الحيوان كله. على هذا النحو، الجنينية الأولية و'مثل العصبية' (على سبيل المثال neuroblastoأماه وغدية خطوط خلد) وغالبا ما تستخدم أنظمة خلية ثقافة. المزايا الرئيسية لهذه النماذج هي أنها سهلة للتلاعب، نسبيا فعالة من حيث التكلفة، وموت الخلايا يمكن قياسه بسهولة وquantitated. ومع ذلك، مسارات إشارات يمكن تغييرها بسبب الظروف زراعة المستخدمة ^3،4، والخلايا العصبية غير ناضجة وخلد يمكن التعبير عن مستقبلات خطوط مختلفة والجزيئات مما يشير إلى أن تنضج عند مقارنة الدماغ ^5-8. علاوة على ذلك، تسمح فقط الخلايا العصبية مثقف دراسة نوع خلية واحدة (أو اثنين، إذا تم استخدام نظام coculture)، في حين أن أنسجة المخ سليمة غير المتجانسة، التي تحتوي على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا التي تتفاعل مع بعضها البعض. كما تستخدم نظم عضوي النمط ثقافة شريحة (إإكسبلنتس رقيقة من أنسجة المخ)، وهذه النماذج تسمح دراسة السكان غير متجانسة من الخلايا كما وجدوا في الجسم الحي. ومع ذلك، فقط كمية محدودة من الأنسجة يمكن الحصول عليها من كل حيوان عند استخدام هذه التقنية، يمكن أن شرائحلا يمكن تربيتها لطالما خطوط الخلايا خلد، والمتوسطة لثقافة على المدى الطويل يمكن أن يؤدي إلى تغييرات في مسارات الإشارات والمستقبلات في شرائح. في حين الدماغ ناضجة يمكن استخدامها لتوليد شرائح عضوي النمط، وشرائح من الدماغ غير ناضجة هي أكثر استعدادا للثقافة، وتستخدم أكثر شيوعا. وبالتالي هناك حاجة لتطوير نماذج التي تحاكي أو تمثل الدماغ ناضجة سليمة، والتي هي سهلة الاستخدام، والتي مسارات الإشارات العصبية يمكن فحصها.

هنا، يوصف في المختبر تقنية تنطوي على الأنسجة العصبية سليمة والتي يمكن استخدامها لتوضيح الآليات الجزيئية المشاركة في موت الخلايا التالية إهانة excitotoxic المواد أو الدماغية. هذا الأسلوب يقلل من عدد الحيوانات اللازمة لإجراء التجربة، هو استنساخه، ويولد أنسجة قابلة للحياة أن يتصرف بطريقة مماثلة لعملية الأيض شرائح عضوي النمط أكبر. بالإضافة إلى ذلك، فإن الدوائر العصبية والتفاعلات الخلوية، وشارك بعد المشبكييبقى mpartment سليمة جزئيا. المخزن المؤقت الفسيولوجية تستخدم يسمح أغشية الخلايا إلى 'إعادة الختم "، وتمكن خلايا للتعافي الأصلية مقاومة الغشاء ^9. هذا النموذج شريحة الدماغ قادر على تقليد بأمانة الردود احظ التالية التحفيز الزائدة بوساطة إصابات الدماغ ^10، ويمكن استخدامها لدراسة الآليات الجزيئية المشاركة في السكتة الدماغية.

Protocol

يتم تنفيذ كافة الإجراءات بموافقة من جامعة نيوكاسل رعاية الحيوان وجنة الأخلاقيات، وكذلك وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة، بما في ذلك قانون نيو ساوث ويلز بحوث الحيوان، والحيوان اللائحة بحوث نيو ساوث ويلز، وقانون الأسترالي الممارسة ل رعاية واستخدام الحيوانات لأغراض علمية.

1. تشريح أنسجة المخ

1. التضحية الفئران الذكور اثني عشر الاسبوع القديمة عن طريق قطع الرأس. الفئران يمكن أن تكون إما من خلال التضحية مذهلة وقطع الرأس، أو يمكن تخدير الأولى مع isoflurane و(5٪ الاستقراء، صيانة 1.5-2٪) في 70٪ N ₂ و 30٪ O _2، ثم مقطوعة الرأس.
2. إزالة الدماغ من الجمجمة بأسرع وقت ممكن (من الناحية المثالية، ينبغي أن يؤديها في أقل من 2 دقيقة).
3. إزالة القشرة باليد خالية من تشريح. يجب أن يتم تنفيذ تشريح في الدنيا وقت ممكن، مع أقل قدر الضرر في الدماغ ممكن وذلك إلى maintain سلامة الشرائح.
4. من أجل إزالة أي الجلد المتبقية، والفراء، والدم، وما إلى ذلك، تزج الدماغ في كمية صغيرة (3-5 مل) من 37 درجة مئوية كريبس العازلة (118 ملي كلوريد الصوديوم، 4.7 ملي كلوريد البوتاسيوم وكلوريد الكالسيوم 1.3 ملي، 1.2 ملي البوتاسيوم هيدروجين فوسفات، 1.2 ملي كبريتات المغنيسيوم وكربونات الصوديوم 25 ملي الهيدروجين، 11.7 ملي الجلوكوز، 0.03 ملي الصوديوم حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA)، معايرتها مع 95٪ أكسجين / ثاني أكسيد الكربون 5٪ (كربوجين)، ودرجة الحموضة 7.4).

2. إعداد Microslices

1. وضع الدماغ على مرحلة من مراحل المروحية McIlwain التي وضعت شريحتين من ورق الترشيح ومبلل مع العازلة كريبس الدافئة. الحفاظ على الدماغ ورقة الترشيح مبلل مع العازلة كريبس الحارة، ولكن ليس الرطب حتى لا يكون هناك السائل الحرة على سطح الورق التي يمكن أن تسبب الدماغ إلى الشريحة حولها.
2. شريحة الدماغ إلى 250 ميكرومتر المقاطع الاكليلية. والمواد الغذائية والأكسجين، ومواد النفايات الفي يتم تبادلها عادة يتم تبادلها مع وصول الدم مع السائل الذي يحيط الأنسجة في الأنسجة العصبية معزولة، ينبغي أن حجم شرائح لا يكون أكثر من 400 ميكرون في سمك للسماح كافية الأوكسجين والمغذيات الصرف تحدث.
3. تحويل المرحلة McIlwain 90 درجة.
4. شريحة العقول إلى 250 ميكرومتر شرائح السهمي. هنا، هذه أقسام الدماغ (250 ميكرومتر X 250 ميكرون شرائح من طول متغير تبعا لسماكة الأنسجة) ويشار إليها باسم microslices.
5. وضع microslices في أنبوب أسفل مستديرة مع 10-15 مل 37 ° C العازلة كريبس (كمية العازلة كريبس استخدامها سوف يعتمد على كمية الأنسجة).

3. موازنة من Microslices

1. تستنهض الهمم بلطف حتى يتم تعليق microslices الفردية، ومن ثم تسمح لهم لتسوية في إطار الجاذبية.
2. إزالة بعناية طاف، والتي ستكون غائم مع وقف التنفيذ بسبب الحطام الخلية، وإضافة 10 مل الطازجة 37 ° Cكريبس العازلة للأنبوب.
3. كرر هذا الإجراء غسل أربع مرات، الأمر الذي سيؤدي في إزالة معظم الأنقاض.
4. وفي أعقاب ذلك، تتوازن microslices عند 37 درجة مئوية مع الهز لطيف / انقلاب وتغيير كريبس العازلة كل 15 دقيقة لمدة 1 ساعة في المجموع.
5. في هذا الوقت، إضافة 2 مل الطازجة العازلة 37 ° C كريبس، ونقل 15-20 microslices (150 ميكرولتر من تعليق microslice) لالبوليسترين مسطحة القاع 5 مل أنابيب باستخدام اضافية واسعة تحمل ماصة مع حواف ممهدة (والتي يمكن إنشاؤها من قبل قطع ~ 2 ملم من نهاية تلميح P1000). نشر microslices بالتساوي على قاعدة الأنبوب في طبقة واحدة، بحيث يكون لكل microslice ليس أبعد من بضعة ملليمترات من الغلاف الجوي الاوكسيجين.

4. تحفيز excitotoxic المواد

1. احتضان microslices عند 37 درجة مئوية، وتمرير باستمرار كربوجين على سطح تعليق 150 ميكرولتر microslice، وذلك باستخدام خط الغاز الذي هو موقفإد فقط فوق سطح التعليق microslice (لتجنب انقطاع الميكانيكية).
2. علاج microslices مع 150 ميكرولتر إما 5 ملي الغلوتامات + 100 ميكرومتر الجلايسين في المخزن كريبس (التحفيز excitotoxic المواد: تركيز النهائي 2.5 ملم الغلوتامات + 50 ميكرومتر الجلايسين) أو 150 ميكرولتر العازلة كريبس وحده (التحكم nonstimulated). مجموعة متنوعة من المحفزات يمكن استخدامها في هذه الخطوة (بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، أمبا، NMDA + الجلايسين، بوكل الاستقطاب، والحرمان الأوكسجين / الجلوكوز).
3. إزالة الحل الحضانة في أوقات مختلفة بعد التحفيز (0، 30، 60، 90، 120، و 300 ثانية)، واستبدالها 300 ميكرولتر من الجليد الباردة التجانس العازلة (30 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.4، 1 ملم جلايكول الإثيلين حمض tetraacetic، 4 ملي EDTA، و 100 ميكرومتر كربونات الأمونيوم، 5 ملي بيروفوسفات الصوديوم، 25 ملي فلوريد الصوديوم، 1 ملم orthovanadate الصوديوم، 1 ملم phenylmethanesulfonylfluoride، كاملة كوكتيل مثبط البروتياز).
4. التجانس microslices على الجليد، وذلك باستخدام الزجاج تفلون الخالط Dounce(20 السكتات الدماغية؛ 700 دورة في الدقيقة).
5. متجر الخليط في -80 درجة مئوية، ومختلف الجزيئات يشير الى جزيئات الموت، وما يمكن أن تقاس طخة غربية.

النتائج

Microslices إنشاؤها باستخدام هذا الإجراء هي قابلة للحياة، ومجموعة متنوعة من الأنواع (على سبيل المثال، الفئران، والماوس، والدجاج) يمكن استخدامها لإنتاج microslices. وقد تم استخدام ثلاثة تدابير مستقلة عن جدوى: معدل التنفس (الشكل 1)، ونسب الأدينين النوكليوتيدات (الش?...

Discussion

هنا، يوصف في المختبر تقنية لتوليد microslices التي يمكن استخدامها لدراسة الآليات الجزيئية المشاركة في التحفيز الزائدة وموت الخلايا بوساطة نقص التروية في أنسجة المخ سليمة ناضجة. هذه التقنية تنتج أنسجة قابلة للحياة (أرقام 1-3)، مشابهة لعملية الأيض شرائح عضوي ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Guillotine			Used to decapitate animal
Surgical equipment			Forceps, scissors, tweezers, etc., for brain removal and dissection
McIlwain chopper	McIlwain choppers are manufactured/distributed by a range of companies including Mickle Engineering, Harvard Apparatus, Campden Instruments and Ted Pella.		Used to generate 100-400 µm brain sections.
Round bottom plastic tubes	Greiner
Water bath			For keeping tissue at 37 °C
Humidifier/aerating apparatus			Used to keep microslices in a humidified, oxygenated environment
Flat bottomed polystyrene tubes	Nunc
Dounce Homogenizer