ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; يسببها الليزر اصابات الحبل الشوكي نموذج لتقييم آليات محور عصبي تنكس في الوقت الحقيقي

Summary

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Abstract

فشلت محاور CNS المصابين إلى تجديد وغالبا ما تتراجع بعيدا عن موقع الإصابة. محاور تنج من الإصابة الأولية قد يخضع لاحقا انحطاط محواري الثانوي. عدم تشكيل مخروط النمو، والتجديد، وفقدان التوقعات محور عصبي مياليني إضافية داخل الحبل الشوكي يحد بشكل كبير الانتعاش العصبية التالية الإصابة. لتقييم مدى أهمية myelinated محاور عصبية من الحبل الشوكي تستجيب للإصابة، وضعنا على فيفو السابقين الذين يعيشون نموذج الحبل الشوكي باستخدام الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتين أصفر فلوري في المحاور والوصل واستنساخه للغاية إصابات الحبل الشوكي التي يسببها الليزر لتوثيق مصير محاور والمايلين (محبة للدهون صبغة الفلورسنت النيل الأحمر) مع مرور الوقت باستخدام اثنين من الفوتون الإثارة الوقت الفاصل بين المجهري. العمليات الديناميكية مثل الإصابة الحادة محور عصبي، تراجع محور عصبي، وانحطاط المايلين هي أفضل درس في الوقت الحقيقي. ومع ذلك، فإن الطبيعة غير المحورية لإصابات القائم على كدمة والتحف واجهت الحركةخلال المجراة الشوكي جعل التصوير الحبل التفريق الردود إصابة محور عصبي الابتدائية والثانوية باستخدام عالية الدقة المجهر تحديا. وفيفو السابقين نموذج الحبل الشوكي هو موضح هنا يحاكي جوانب عديدة من كدمة / التي يسببها ضغط الأمراض محور عصبي ذات الصلة سريريا بما في ذلك تورم محور عصبي، وتشكيل كروي، transection محور عصبي، وشبه محواري تورم تقديم نموذجا مفيدا لدراسة هذه العمليات الدينامية في الوقت الحقيقي. المزايا الرئيسية لهذا النموذج هي قرار الزماني المكاني الممتاز الذي يسمح التمايز بين إهانة الأولية أن يجرح مباشرة محاور وآليات الإصابة الثانوية؛ ضخ تسيطر عليها من الكواشف مباشرة إلى الاستحمام سائل الإرواء الحبل. التعديلات دقيقة من الوسط البيئي (على سبيل المثال، والكالسيوم، أيونات الصوديوم، والمساهمين المعروف أن الإصابة محور عصبي، ولكن بالقرب من المستحيل التلاعب في الجسم الحي)؛ ونماذج الفئران كما تقدم ميزة لأنها توفر فرصة لتصور والتلاعب السكان الخلية التي تم تحديدها وراثيا والهياكل التحت خلوية. هنا، نحن تصف كيفية عزل وصورة الحبل الشوكي الحية من الفئران لالتقاط ديناميات إصابة محور عصبي حاد.

Introduction

انحطاط المحاور هو سبب بارز للمراضة والتي تمتد عدة شروط العصبية بما في ذلك رضح عصبي والسكتة الدماغية وأمراض المناعة الذاتية، والأمراض العصبية. وخلافا للنظام العصبي المحيطي (السندات الإذنية)، والجهاز العصبي المركزي (CNS) محاور لديها قدرة محدودة على التجدد أصيب مرة واحدة على حد سواء بسبب الحواجز الجوهرية وخارجي (أي الجزيئات المثبطة لنمو محور عصبي أنتجت خلال تشكيل ندبة وحررت خلال انحطاط المايلين) ^{1 -7.} على الرغم من أن العديد من هذه الحواجز قد تم استكشافها على نطاق واسع، والتدخلات العلاجية التي تهدف لمنع CNS انحطاط محور عصبي، وتعزيز تجدد المحاور قوي، واستعادة connectively وظيفية، تظل محدودة.

محاور مرة واحدة وفصلها عن سوما على الخضوع لعملية النمطية للانحطاط المعروفة باسم ولري انحطاط التي تتميز تورم محور عصبي، وتشكيل كروي والتفتت في نهاية المطاف (استعراضها في ^8). فيالنقيض من ذلك، الجدعة الداني أن يبقى في الاستمرارية مع سوما من محور عصبي محيطي مقطوع، يشكل تورم في نهايته، يموت العودة إلى أقرب عقدة رانفييه، ومن ثم يمكن بدء تشكيل مخروط النمو، وهو شرط أساسي حيوي ضروري لتجدد المحاور لاحق ^9-11. في المقابل، فإن النهايات محور عصبي القريبة من العديد من المحاور المركزية تشكل "endbulbs" سمة أو المصابيح التراجع، تفشل في تشكيل مخاريط النمو، وبدلا من التراجع بعيدا عن موقع الإصابة حيث تبقى لأشهر بعد الإصابة ^12-15. بالإضافة إلى إصابة محور عصبي الأولية، قد تحدث إضافية محور عصبي الضرر / الخسارة أيضا إلى المحاور التي نجت إلى حد كبير من الإصابة الأولية. ويشار إلى هذا تأخر فقدان محور عصبي من المحاور يدخر في البداية إلى انحطاط محور عصبي الثانوي. هذا الرد المتأصلة من المحاور CNS إلى إصابة يجعل تجدد المحاور وظيفية هدفا أكثر صعوبة لتحقيق في الدماغ والحبل الشوكي.

وعلى الرغم من هكتارllmarks الإصابة محور عصبي (على سبيل المثال، وتشكيل كروي، والمصابيح تراجع) اتسمت جيدا من الأنسجة بعد الوفاة ونماذج تجريبية من انحطاط محور عصبي، وقد تم تقييد توضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه العمليات الديناميكية. تعتمد معظم هذه الدراسات على الملاحظات نقطة النهاية الثابتة التي فشلت بطبيعتها لالتقاط الردود محور عصبي الفردية مع مرور الوقت. على الرغم من تطبيقها خارجيا كانت استشفاف محور عصبي مفيد لتوضيح الردود محواري من أقسام ثابتة وخلال التصوير الحي، وتوافر علامات محور عصبي المشفرة وراثيا قد تحسنت كثيرا قدرتنا على تصور محاور في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر مضان. في الواقع، قدمت تقريرا المنوي من Kerschensteiner وزملاؤه أول دليل مباشر على انحطاط محور عصبي والتجديد في الجسم الحي باستخدام Thy1 -GFP-S الفئران التي تكود البروتين الفلوري الأخضر في مجموعات فرعية من الخلايا العصبية التي ترسل توقعاتهم في الأعمدة الظهرية من العمود الفقريالحبل ^16. تصوير حي النهج باستخدام اثنين من الفوتون المجهري المسح الضوئي ليزر (TPLSM) ويستمر الجيني وضع العلامات بروتين فلوري الخلايا التي تهم تقديم أدلة مباشرة والبصيرة الميكانيكية في العديد من العمليات الحيوية المختلفة مثل التنكس محور عصبي، كاليفورنيا ²⁺ الإشارات، تجدد المحاور، نجمية علم وظائف الأعضاء، علم وظائف الأعضاء دبقية، واستجابة لإصابات ^17-25.

وعلى النقيض من محاور عصبية، لا يعرف إلا القليل جدا من الردود المايلين الاصابة في الوقت الحقيقي. المايلين هو مكون أساسي من مكونات المادة البيضاء المنتجة والتي تحتفظ بها قليلة التغصن في خلايا الجهاز العصبي المركزي والجهاز العصبي المحيطي شوان في. المايلين يعزل 99٪ من سطح محاور وبذلك يوفر عالية المقاومة ومنخفضة السعة أغطية واقية التي تدعم نشر دفعة قفزي السريع والفعال، استعرض مؤخرا من قبل Buttermore وآخرون. ^26. للقبض على الاستجابة الديناميكية المايلين إلى إصابة نستخدم solvatochromic، محبة للدهونصبغة الفلورسنت النيل الأحمر ^27. خصائص solvatochromic هذا وصمة عار الحيوية تسمح التحولات الطيفية من الطيف الانبعاثات التي تعتمد على البيئة الفيزيائية والكيميائية ^28،29. هذه الخصائص هي مفيدة لاكتساب نظرة ثاقبة آليات الإصابة axomyelinic ويمكن تصور استخدام dichroics اختيار مناسب والمرشحات الانبعاثات أو حلها باستخدام المجهر الطيفي ^27. على سبيل المثال، النيل الأحمر طيف الانبعاث هو الأزرق تحول في بيئات غنية بالدهون أقل القطبية مثل تلك الموجودة في الخلايا الشحمية وطبيعية CNS المايلين (الانبعاثات ذروة ~ 580-590 نانومتر) ^27. في المقابل، قمم طيف الانبعاث هذه الصبغة الحيوية في في ~ 625 نانومتر في endbulbs كما شكلت محاور تخضع السقم محور عصبي ^27. على الرغم من أن الآليات الدقيقة الكامنة وراء هذه التحولات الطيفية تحديدا في endbulbs مقابل المايلين طبيعيا لا تزال غير واضحة، قد مثل هذه التغييرات الطيفية تكشف عن التعديلات الأساسية في تراكم البروتين أو الفوضى مما أدى إلىتعرض مواقع الربط مسعور ^27.

بينما التصوير في الجسم الحي هو المقياس النهائي لمراقبة الحبل الشوكي ديناميات إصابة محور عصبي في بيئتهم المحلية، فمن الصعب فنيا ويتطلب خبرة جراحية كبيرة، وغالبا ما يكرر عملية جراحية لفضح العمود الظهري التي قد يعرض القطع الأثرية التجريبية (على سبيل المثال، والتهاب وندبة التأسيس). وبالإضافة إلى ذلك، في كثير من الأحيان هناك حاجة إلى معدات مكلفة للسماح للتعليق وتحديد المواقع حيوان سليمة تحت المجهر عدسة موضوعية. تحتاج الحيوانات التي يتعين رصدها بعناية وكذلك لضمان أنها لا تزال دافئة، لضمان تجديد السوائل، وضمان عدم وجود علامات نقص الأكسجين بسبب جلسات التصوير تخدير لفترة طويلة. وهذا الأخير هو في غاية الأهمية كما المحاور والمايلين تتطلب تماما نضح المستمر ومستويات الأكسجين الكافية لتبقى قابلة للحياة. ومع ذلك، وهذا هو في كثير من الأحيان لم يبلغ عنها أو رصدها في معظم الدراسات المجراة لالتاريخ. وبالإضافة إلى ذلك، والتحف الحركة نظرا لمعدل ضربات القلب والتنفس (الأيزوفلورين تخدير الماوس الكبار: ~ 300-450 نبضة في الدقيقة (BPM) هو الأمثل للحفاظ على 97-98٪ تشبع الأكسجين (المعدل الطبيعي ~ 632 BPM) و ~ 55-65 الأنفاس لكل دقيقة (المعدل الطبيعي هو ~ 163 نفسا في الدقيقة)، على التوالي)) ³⁰ واجهتها خلال المجراة الشوكي جعل التصوير الحبل التفريق الردود إصابة محور عصبي الابتدائية والثانوية باستخدام عالية الدقة مضان المجهر تحدي حتى أسرع المسح الضوئي الليزر هي حتما تخضع لهذه الحركة التحف. التقدم في فائق السرعة الماسحات الضوئية الرنانة جنبا إلى جنب مع جامدة الفقري نافذة زرع مؤطرة قد يسمح التصوير من الحبل الشوكي الفئران في الحيوانات المستيقظة، ولكن مرات أسرع المسح الضوئي حتما يقلل من إشارة إلى نسبة الضوضاء جودة الصورة المهينة. المزيد من التحسينات في تقنيات التصوير الحبل الشوكي تستخدم حاليا لتصوير الدماغ قد التغلب على كثير من هذه العقبات وتحد يفند المحتملة التي أدخلتها ماننضح الأنسجة dequate، على سبيل المثال، ^31-33.

وقد تم تحديد معظم ما هو معروف عن البيض علم وظائف الأعضاء وآليات الإصابة المادة البيضاء مسألة استخدام في المختبر أو خارج الحي الاستعدادات من المادة البيضاء من العصب البصري، الأعصاب الطرفية، وشرائح من الحبل الشوكي المادة البيضاء ^34-41. استمرت هذه التحضيرات لدفع معرفتنا آليات إصابة المادة البيضاء، التي تسمح تسيطر التغيرات في العوامل البيئية، وتطبيق رقابة من الأدوية والكواشف، وتقييمات الوظيفية باستخدام الكهربية، والملاحظات مضان المجهر مباشرة من المحاور والميلين في الأنسجة الحية. ومع ذلك، وبعض الأساليب السابقة لمراقبة محاور عصبية من الحبل الشوكي شرائط العمود الظهري البطني أو شرائط المادة البيضاء حتما تجرح محاور السطح خلال مرحلة إزالة التي قد تؤثر على استجابة من المحاور تعارض بشكل وثيق. للاستفادة من التلاعب التجريبية أعلاه وتجنب الأضرار التي لحقت هاءالألياف راي قيد التحقيق، ونحن نستخدم نموذج الحبل الشوكي العنقي خارج الحي كما أنه يمنع الاتصال المباشر من الجانب الظهري للحبل. وهكذا، فإن بنية الأم الحنون والمجاورة محاور العمود الظهري سطحية لا تزال قابلة للحياة ورابط الجأش أثناء العزلة.

نحن هنا وصف نهج بسيط نسبيا التي تسمح التصور المباشر لmyelinated محاور عصبية مركزية كما أنها تستجيب بشكل ديناميكي لإصابة تنسيق في الوقت الحقيقي يصل إلى 8 - 10+ ساعة بعد الإصابة. إصابة الحبل الشوكي (LiSCI) نموذج الليزر التي يسببها يسمح التفريق بين آليات إصابة محور عصبي الابتدائية والثانوية والآفة الأولية (الموقع الاجتثاث) ما زال مقيدا مكانيا مع مرور الوقت. غرفة التصوير حمام مفتوح يمكن الوصول إلى التدخل العلاجي، والتسليم الكاشف، والتلاعب البيئية. وكلاء واقية axomyelinic المفترضة يمكن تقييم بسرعة في الوقت الحقيقي من خلال الملاحظات المباشرة مقابل تجارب طويلة ومكلفة تنطوي عملية النسيججي، باجتزاء، المناعية، والتقاط الصور، والتحليل، وبالتالي تقدم نموذجا بديل مفيد لتقييم الردود الحادة والتلاعب وقائية قبل اختبار وكلاء التجريبية في الحيوانات الحية.

Protocol

ملاحظة: تم تنفيذ كافة الإجراءات الحيوانية في إطار المبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة لويزفيل، والتمسك اللوائح الاتحادية.

1. إعداد منخفضة الكالسيوم ²⁺ و 2 ملي كا ²⁺ السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) Perfusates

1. إعداد 2X منخفضة الكالسيوم ²⁺ (0.1 ملم) سهم C العازلة، 2X الكالسيوم الطبيعي ²⁺ (2 ملم) سهم منطقة عازلة، و2X المالية B عازلة كما هو موضح في الجدول 1. الحلول الأسهم الفردية تسمح تعديل المحتوى أيون (على سبيل المثال، منخفضة أو الصفر الكالسيوم ²⁺⁾ ويمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
2. لنضح داخل القلب أثناء تشريح، إضافة 100 مل من 2X منخفضة الكالسيوم ²⁺ سهم C و 100 مل من 2X المالية B في زجاجة من البلاستيك لجعل الكالسيوم منخفض 1X ²⁺ ACSF. خلط وتخزين بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو جعل الطازجة.
3. لنضح من خارج الحي الحبل الشوكي أثناء ايماججي، إضافة 500 مل من 2X العادي الكالسيوم ²⁺ المالية وو 500 مل من 2X المالية B في زجاجة 1 لتر لتوليد 1X ACSF. خلط وتخزين بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة أو جعل الطازجة.
4. ضبط درجة الحموضة من مخازن ACSF إلى 7.4. مع الحفاظ على ACSF في درجة حرارة الغرفة، ووضع منخفض الكالسيوم ²⁺ ACSF على الجليد ثم فقاعة كلا مخازن بالغاز كربوجين (95٪ O _2، 5٪ CO ₂₎ لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام وبشكل مستمر خلال نضح.

2. إعداد فيفو السابقين غرفة التصوير

1. التفاف بطانية للتدفئة (أي اغلاق التلقائي) حول زجاجة ACSF وضبط الحرارة إلى منخفض / الإعداد المتوسط.
2. إدراج ACSF خط نضح مخصص في زجاجة متصلة مضخة نضح وتمشيا سخان التي تسيطر عليها وحدة تحكم في درجة الحرارة وردود الفعل مسبار درجة الحرارة ثنائي القطب كما هو مبين في الشكل 1A.
3. إرفاق مرحلة المجهر شقة إدراج (152 X 102 مم) إلى 2 الفوتون الإثارة / أسيوطocal مرحلة المجهر مزودة حاوية التسرب.
4. ضع غرفة كبيرة نضح حمام مفتوح (ث ل س س ح و 12 × 24 × 8 ملم) في وعاء تسرب لاستيعاب وتوفير تدفق مستمر من ACSF الاوكسيجين الطازجة إلى الحبل الشوكي خارج الجسم الحي (انظر الشكل 1B لمناسبة السابق فيفو التصوير تصميم غرفة).
5. ربط المعادن منفذ إخراج سخان على خط إلى خارج الحي غرفة التصوير باستخدام أنابيب مناسبة. وضع وسادة ماصة رقيقة تحت غرفة التصوير فيفو السابقين للمساعدة في الحفاظ على درجة حرارة المخزن المؤقت / الأنسجة أثناء التصوير.
6. الالتزام غرفة التصوير خارج الحي في الجزء السفلي من إدراج الحاويات تسرب / المرحلة باستخدام تك لزجة قابلة للإزالة. فإن سهولة تشكيل تك لزجة تسمح للغرفة الى تعديلها حسب الحاجة لضمان مسار الهدف في ضوء هو عمودي على سطح الأنسجة. إذا لزم الأمر، استخدم مستوى بولس لضبط الغرفة.
7. تأمينفي خط ردود الفعل سخان مسبار درجة الحرارة بالقرب من مدخل السائل غرفة وغير القابل للصدأ أنبوب الشفط الصلب متصلة خط فراغ عند مخرج القاعة. أصحاب الشريط المغناطيسي وممص مكروى المناسب والمفيد في هذا الصدد. بدوره على مصدر فراغ.
8. بدوره على مضخة نضح لبدء ملء غرفة التصوير مع ACSF المؤكسج. ضبط مضخة نضح إلى 1.5-2 مل لكل دقيقة.
9. التحكم في حجم ACSF في غرفة التصوير عن طريق ضبط خط فراغ. من المهم أن يكون هناك ما يكفي من ACSF في غرفة التصوير لتغطية جزء الحبل الشوكي والسماح مسافة العمل كافية بين هدف غمس الماء وسطح الأنسجة. المايلين ومحاور عصبية يمكن أن تتأثر ضارا إذا لم يتم المغمورة قطاع النسيج تماما في ACSF الاوكسيجين الطازجة الرائدة التحف التي يسببها المجرب ل.
10. ضبط تحكم في درجة الحرارة سخان في الخط بحيث درجة حرارة سائل الإرواء في غرفة التصوير هي درجة حرارة الغرفة القريب.

<ص الطبقة = "jove_title"> 3. تشريح الكبار الفئران عنق الرحم الحبل الشوكي

1. الموت ببطء بالغ 6-10 أسبوع thy1 القديمة -YFP الماوس المعدلة وراثيا (استخدام سلالة المناسب الذي لديه الفلورسنت التعبير البروتين في الخلايا العصبية الجذرية الظهرية العقدة) عن طريق حقن جرعة زائدة من الصوديوم بنتوباربيتال التخدير (200 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن داخل الصفاق.
2. مرة واحدة تحت المستوى المناسب من التخدير (على سبيل المثال، أي رد فعل لقرصة أخمص قدميها، وفقدان طرفة رد الفعل)، حلاقة بعناية الجلد المغطي للنخاع الشوكي والدماغ مع كليبرز الجراحية. تطهير الجلد باستخدام بتدين و 70٪ منصات الايثانول.
3. رش الصدر / منطقة البطن مع الايثانول 70٪، ثم يروي هذا الموضوع transcardially باستخدام المبرد،-فقاعات كربوجين الكالسيوم منخفض ²⁺ ACSF. (انظر الشكل 1C لمقاعد البدلاء اقترح تشريح وضع أعلى متابعة).
4. كما تتضاءل الكبد، وتأمين إبرة نضح في القلب باستخدام مقطع صغير. تحويل الموضوع على الوصول إلى الجانب الظهري حلق لهذا الموضوع، ومسح منطقة حلق مع 70٪ من الإيثانول.
5. وجعل شق الجلد الظهرية على طول خط الوسط ابتداء من الأنف إلى الورك باستخدام مقص تشريح لفضح الدماغ والعمود الفقري (الشكل 2A). تأمين إعداد من خلال وضع دبابيس في الأنف والكفل.
6. باستخدام مجهر تشريح من هذه النقطة، وقطع بقوة عبر السطح الظهري من الجمجمة على مستوى بصيلات الشم. إدراج واحدة من النصائح مقص في الحواف الجانبية للشق وقطع على طول حواف قلنسوة ثنائيا حتى المخيخ.
   ملاحظة: لا المكوس تماما قلنسوة كما هو مطلوب في وقت لاحق لرفع الأنسجة المغطي من الحبل الشوكي في جميع أنحاء تشريح (انظر الشكل 2B).
7. رفع قلنسوة لفضح الدماغ. خفض بلطف الحواف اليسرى واليمنى من العظم الجداري (الموجود في المخيخ) وتسحبه إلى الوراء نحو caudally لفضح الدماغ / الحبل الشوكي (الشكل 2C ).
8. استخدام مقص يميل غرامة عقدت في زاوية 45 درجة إلى سطح الطاولة وقطع فقرات ثنائيا فقط أقل شأنا من الجذور الخلفية العصبية.
   ملاحظة: تجنب الاتصال مع الأعمدة الظهرية بيضاء مشرقة. هذه الألياف هي تلك التي سيتم تصويرها (الشكل 2D) ويمكن أن تتلف بسهولة.
9. رفع قلنسوة والظهرية سطح العمود الفقري مع ملقط يميل غرامة، وسحب بلطف النسيج المغطي في قطعة واحدة كما يتم إجراء تخفيضات لفضح الحبل الشوكي. مواصلة خفض فقرات إلى المستوى الصدري العلوي لعزل شريحة 1-2 سم من الحبل عنق الرحم للتصوير لاحقة (الشكل 2E).
10. استخدام مقص لقطع بالتوازي الأنسجة / العظام إلى العمود الفقري والانسجة واضحة تحت العمود. جعل هذه التخفيضات عن مستوى ممكن. من المهم جدا أن الأنسجة تكمن مسطحة في غرفة بحيث الحبل هو مستوى للتصوير.
11. استخدام مشرط رقم 11 لالقطع جذع الدماغ (الماضيإنهاء ألياف الحزمة النواة الناحلة) وعلى مستوى الصدري العلوي لعزل جزء الحبل الشوكي العنقي (انظر الشكل 2F). استخدام المقص لقطع الأنسجة / عظم في هذه نفس نقطتين. وينبغي أن يتضمن الأنسجة المعزولة 2/3 العمود الفقري يشمل الدماغ الذيلية، وتوسيع عنق الرحم، والجزء العلوي من الحبل الشوكي الصدري (الشكل 2G).
12. وضع العمود الفقري معزولة في طبق بتري من-فقاعات كربوجين، الكالسيوم منخفض المبردة ²⁺ ACSF. إذا لزم الأمر، وتقليم الأنسجة تحت العمود الفقري حتى انها تقع شقة في الطبق.
13. نقل العمود الفقري معزول إلى غرفة التصوير خارج الحي وزيادة تدريجية في درجة حرارة سائل الإرواء أكثر من 1 ساعة إلى 36-37 درجة مئوية. الحفاظ على درجة الحرارة هذه أثناء التصوير.

4. التنسيب من فيفو السابقين النخاع الشوكي إلى غرفة التصوير والمايلين وصفها مع النيل الأحمر

1. تأمين بعناية العمود الفقري في طغرفة maging مع شريحة المناسب المناسبة يعقدون تعديل أسفل مع منصة الشبكة العمودية التي تتكون من المواضيع ليكرا الدقيقة (إزالة المواضيع الوسطى من منصة الشبكة للسماح مساحة للالحبل الشوكي؛ انظر الشكل 3A).
2. ذوبان الجليد قسامة من النيل الأحمر (5 ملي الأسهم في DMSO و 0.22 ميكرون تصفيتها، ويمكن تخزينها لمدة 1 شهر في 4 درجات مئوية، أو 6 أشهر في -20 درجة مئوية في الظلام). فقط قبل إضافة النيل الأحمر إلى غرفة التصوير، والحد من تدفق مضخة نضح وضبط خط فراغ لضمان السوائل في غرفة ويغطي دائما الحبل الشوكي.
3. إضافة 5-10 ميكرولتر النيل الأحمر حل الأسهم إلى غرفة التصوير قرب نهاية الذيلية من الحبل (الشكل 3B). استخدام ماصة 1 مل إلى المزيج بلطف النيل الأحمر في جميع أنحاء الغرفة. السماح النيل الأحمر على البقاء في غرفة لمدة 1-2 دقائق، ثم ضع خط فراغ ذهابا وضبط مضخة نضح إلى 1.5-2 مل لكل دقيقة ليروي باستمرار الحبل الشوكي.
4. بعناية رفع المسرح المجهرومحاذاة الهدف مع مركز للجزء الحبل الشوكي وإعلامي على أعمدة الظهرية حتى الهدف غمر المياه ما يقرب من 10 مم من سطح ACSF في الغرفة. استخدام المجهر عجلة التركيز الأنفية لجلب ببطء الهدف لأسفل حتى أنها تمس برفق سطح ACSF. استخدام مصدر الضوء epifluorescent لتركيز أعمدة الظهرية في مجال الرؤية (الشكل 3C).

5. فيفو السابقين التصوير من الحبل الشوكي الماوس مع TPLSM والتي يسببها الليزر اصابات الحبل الشوكي (LiSCI)

ملاحظة: يوفر الوريد الخلفي علامة مفيدة لتوسيط الأنسجة والألياف الحزمة النواة الناحلة (تنشأ من خلايا الجسم من الظهرية العقد الجذرية ويصعد من T6 وتحت على طول خط الوسط من الحبل الشوكي) بالتوازي مع هذه الأوعية الدموية. كما توفر YFP + عنق الرحم توقعات الجذر الظهري سمكا علامة مفيدة مثل الارتفاع الألياف وتنحدر أفقيا إلى YFP + الحزمة النواة الناحلة الألياف التي هي أصغر في قطر.

1. مرة واحدة يتم محاذاة الأنسجة الحبل الشوكي بشكل مناسب، والتبديل إلى وضع المسح الضوئي ليزر لأداء التصوير الأساسي من الصعود الحزمة النواة الناحلة الألياف مياليني. لإثارة كلا YFP والنيل الأحمر، استخدام مصدر ليزر ثنائي الفوتون ضبطها إلى 950 نانومتر الطول الموجي (~ 17 ميغاواط قياس في الخروج من 25X، 1.1 الهدف NA) وdichroics المناسب (DM) والمرشحات ممر الموجة لعزل الانبعاثات الفلورسنت من fluorophores (نستخدم 525/50 DM560، DM640 600/60، 685/70 و، لفصل YFP، والنيل الأحمر إلى الأصفر البرتقالي، وقنوات الحمراء الموسعة، على التوالي).
   1. إذا كان أكثر من 3٪ من محاور عصبية تظهر الأجسام الشبه الكروية محور عصبي أثناء التصوير الأساسي (30-60 دقيقة)، ونبذ إعداد بسبب القطع الأثرية التي يسببها المجرب.
2. لحث على LiSCI بواسطة المكبرة مجال الرؤية ل30.3X (لخلق ~ 20 ميكرون قطر الاجتثاث). ضبط الليزر إلى 800 نانومتر، وزيادة قوة الليزر ل~ 110 ميغاواط فيالعينة. سماح 5 ميدانية كاملة من بالاشعة عرض ليزر لضمان مقطوع الألياف تماما.
3. تأكيد LiSCI عن طريق تغيير إعدادات الليزر إلى الإعدادات التصوير (950 نانومتر، 17 ميغاواط في العينة، 2.08X) ومسح الأنسجة لتصور الاجتثاث. تحقق من قطر الاجتثاث وأن محاور ذاب الأولية ومقطوع تماما (انظر الشكل 3D). استخدام إعدادات الوقت الفاصل على المجهر جنبا إلى جنب مع التقاط ض لتسجيل الاستجابة الديناميكية من المحاور والمايلين إلى إصابة ما يصل إلى 8-10 + ساعة بعد الإصابة.
   ملاحظة: إذا كان الاجتثاث غير مكتمل (أي transection ناقصة من الألياف)، ونبذ إعداد، وتحديد آليات الإصابة الأولية والثانوية سيتم مرتبك. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تصوير شرائح الحبل الشوكي معزولة تصل إلى 24 ساعة بعد LiSCI مع خفيفة الى معتدلة فقط تلف الأنسجة LiSCI مستقل.

النتائج

تفاصيل مختبر المناسب اقامة اللازمة لعزل، والحفاظ على قدرتها على البقاء، وصورة يظهر الحبل الشوكي خارج الحي في الشكل 1. ويحتاج المجهر لتكون مجهزة ليزر الفيمتو ثانية الانضباطي نابض، dicroics الاقتضاء والمرشحات الانبعاثات، والإمداد غمس عدسة موضوعية مع فتحة ع...

Discussion

نحن تصف طريقة التصوير خارج الحي الحبل الشوكي محاور العصبي (أي الحزمة النواة الناحلة) جنبا إلى جنب مع إصابة الحبل الشوكي التي يسببها الليزر لدراسة تطور ديناميكي كل من انحطاط محور عصبي مياليني الابتدائي والثانوي مع مرور الوقت. خارج الحي التصوير من سطح ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Large bath chamber with slice supports	Warner Instruments	RC-27L	For ex vivo imaging chamber
Standard Slice Supports	Warner Instruments	SS-3	For ex vivo imaging chamber
Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers	Warner Instruments	SHD-27LP/10	For ex vivo imaging chamber
Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed	Warner Instruments	ST-1L	For ex vivo imaging chamber
Solution In-line heater/cooler	Warner Instruments	SC-20	To regulate perfusate temperature during imaging
Bipolar temperature controller	Warner Instruments	CL-100	To regulate perfusate temperature during imaging
Liquid Cooling System	Warner Instruments	LCS-1	To regulate perfusate temperature during imaging
Cable assembly for heater controllers	Warner Instruments	CC-28	To regulate perfusate temperature during imaging
Replacement bead thermisitor for CC-28 cable	Warner Instruments	TS-70B	To regulate perfusate temperature during imaging
Magnetic holder with suction tubing	Bioscience Tools	MTH-S	To hold the stainless steel vacuum suction tubing
Adjustable holder	Bioscience Tools	MTH	To hold the temperature probe
clear silicone sealant			For ex vivo imaging chamber
superglue			For ex vivo imaging chamber
thin plexiglass strips			For ex vivo imaging chamber
nile red	Life Technologies	N-1142	For labeling myelin