روز البنغال Photothrombosis بواسطة التصوير الضوئي متحد البؤر<em&gt; في فيفو</em&gt;: نموذج لسفينة واحدة السكتة الدماغية

Summary

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Abstract

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel.

The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Introduction

تقنية الموضحة تصاريح التصور في الجسم الحي الاستجابات الخلوية التالية تحريض روز البنغال على الفور photothrombosis في الماوس سليمة. روز البنغال (4،5،6،7-tetrachloro-2، 4، 5، 7'-tetraiodofluorescein) هو صبغ حساس يستخدم للحث على السكتة الدماغية في النماذج الحيوانية (الماوس والفئران). بعد حقن البلعة من RB عن طريق الوريد الذيل وإضاءة لاحقة من خلال الجمجمة ضعيفة مع ضوء الليزر 564 نانومتر، الجلطة هو فعل يسبب السكتة الدماغية الفسيولوجية ^1. طريقة وصفت في الأصل من قبل روزنبلوم وايل الصبان في عام 1977، وتكييفها في وقت لاحق من قبل واتسون في منتصف 1980s ^1،2. وباختصار، فإن المشع روز البنغال مع الضوء الأخضر الإثارة (ليزر 561 نانومتر في حالتنا)، الذي يولد إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية، والذي ينشط في وقت لاحق العامل النسيجي، وهو البادئ شلال التخثر. تحريض شلال التخثر ينتج الدماغية ليهأيون التي هي ذات الصلة مرضي السكتة الدماغية السريرية ^3.

السكتة الدماغية لديها الفيزيولوجيا المرضية المعقدة ويرجع ذلك إلى تفاعل العديد من خلايا مختلفة الأنواع بما في ذلك الخلايا العصبية، الدبقية، البطانة والجهاز المناعي. اختيار أفضل أسلوب لدراسة تتطلب عملية الخلوية معينة اعتبارات متعددة. تقنيات تجريبية تقع على نطاق واسع في واحدة من ثلاث فئات: في المختبر، في الجسم الحي وسيليكون ولكل منها مزايا وعيوب في الدراسات المختبرية لديها عيب أساسي لإزالة الخلايا من بيئتها الطبيعية، وبالتالي قد لا تتكاثر آثار ينظر في حالها. الحيوانات الحية. في الجسم الحي تقنيات توفير لتعزيز النسخ التجريبية من الحالات المرضية مع زيادة أهمية متعدية. وفي سيليكون وتشير بصفة عامة إلى النمذجة الحاسوبية من مرض أو عملية الخلوية، وحين تستخدم بشكل متزايد لدراسة التفاعلات المخدرات المحتملة للامتحانسبيل، ما زال يتعين اختبار أي معلومات استقاها في الخلايا أو الأنسجة الحية.

يجب أن النموذج المثالي من السكتة الدماغية في إعداد مختبر تظهر ملامح مرضية مشابهة لتلك التي ظهرت في عدد السكان. في حين أن هناك خصائص مشتركة الفسيولوجية من السكتة الدماغية في البشر، وهناك أيضا العديد من الاختلافات تبعا لنوع الإصابة من ذوي الخبرة. السكتة الدماغية في البشر كما يحدث انسداد صغيرة أو كبيرة سفينة، والآفات نزفية، والشريان إلى الشريان أو الانسدادات القلب والتي تؤدي إلى احتشاء أحجام متنوعة فضلا عن الاختلافات في الآليات المتعلقة بكل علم الأمراض. الاستفادة من استخدام نماذج السكتة الدماغية الحيوان هو الجيل من عوائق استنساخه التي تحاكي خصائص السكتة الدماغية الإنسان. وتشمل النماذج الأكثر شيوعا السكتة الدماغية الحيوان انسداد الشريان باستخدام: وسط انسداد الشريان الدماغي (أساليب خيوط صمية أو اللف) التي نماذج القاصي MCAO ونموذج photothrombosis. مزايا لوقد استعرض د عيوب كل نموذج في مكان آخر (انظر ⁴ و ^5). نماذج عالمية الدماغية (MCAO)، في حين أن من السهل نسبيا لأداء هي أقل أهمية من السكتة الدماغية البشرية من هي نماذج السكتة الدماغية التنسيق. وبالإضافة إلى ذلك، وهذه الأساليب تختلف اختلافا كبيرا في إحداث تقرحات احتشاء الدماغ استنساخه. نموذج photothrombosis هو تكرار للغاية طالما يتحكم المجرب التجارب بشكل جيد، وتوفير ميزة واضحة على نماذج MCAO. ومع ذلك، ويرجع ذلك إلى الأوعية الدموية الدقيقة إهانة وقد وصفت نموذج لعرض غبش الدماغية الحد الأدنى، المنطقة التي يعتقد أن الخلايا لتكون انقاذها ^6،7. بالإضافة إلى ذلك، وذمة وعائية المنشأ وتشكيل السامة للخلايا وذمة ويمكن أيضا أن يتسبب الإشعاع التالي من منطقة التصوير. على الرغم من هذه القيود وفرت تقنية نظرة جديدة في العديد من العمليات الفسيولوجية التالية السكتة الدماغية ^{8، 9، 10، 11.}

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة تكساس مركز العلوم الصحية في سان انطونيو، وكانت متسقة مع المبادئ التوجيهية صلوا اليها.

1. التخدير لإعداد القشرية

1. ضع الماوس في غرفة الاستقراء مع 2-3٪ isofluorane مختلطة مع الأكسجين للحث على التخدير. نلاحظ انخفاض معدل التنفس كما هو الناجم عن الماوس. قرصة مخلب من الماوس لتحديد ما إذا كان الفأر هو على استعداد للانتقال إلى مخروط الأنف. ملاحظة: مستوى التخدير هو خطوة حاسمة في أي تحضير في الجسم الحي، وينبغي الحرص على عدم للحث على المستوى الذي سوف يسبب نقص التروية العالمي.
2. مرة واحدة يتم تخدير الماوس بما فيه الكفاية، ونقل الحيوان إلى الجراحة / منصة التصوير ووضع الأنف الماوس، في مخروط الأنف وتطبيق 1-1،2٪ isofluorane للحفاظ على حالة تخدير. تأكد من أن الفأر هو ملقى على درجة حرارة المشتركntrolled سادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم (37 درجة مئوية +/- 0.5 ° C) في جميع أنحاء الإجراءات المتبقية. وضع مرهم التعليم والتدريب المهني في العيون لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
3. مراقبة علم وظائف الأعضاء من الفأرة باستخدام نظام قياس التأكسج نبض باستخدام الذيل أو القدم كليب المتوفرة مع النظام. تأكد من أن معدل التنفس ويحتفظ بين 50-65 الأنفاس / دقيقة. تأكد من أن معدل ضربات القلب لا يزال بين 300-450 نبضة في الدقيقة وتشبع الأكسجين يحتفظ بين 97-98٪ لضمان البقاء على المدى الطويل للحيوان.
4. عندما يتم تخدير الماوس بشكل كاف، حلق شعر على الجمجمة باستخدام كليبرز الكهربائية، إزالة الشعر المتبقي ونظيفة مع betadine، تليها مسحة الإيثانول. كرر هذا الإجراء حتى ثلاث مرات لضمان بيئة الجراحية المعقمة.

2. إجراء العمليات الجراحية

1. مع فروة الرأس وتنظيفها بالكامل وحليق، وجعل 5 ملم شق في فروة الرأس من الفأرة للكشف عن fissu الجمجمةالدقة وتحديد bregma.
2. استخدام قضيب من القطن المعقم لإزالة أي رباط المتبقية المغطي الجمجمة.
3. الغراء حلقة العرف الفولاذ المقاوم للصدأ (الشكل 1) مع لاصق الأنسجة حتى العظم المغطي القشرة الجدارية باستخدام إحداثيات التجسيمي من Bregma: -1 الى -3 ملم والوحشي: 2-4 ملم. ملاحظة: الغراء يحدد عادة في غضون 2 دقيقة بعد وضع الحلقة على العظام.
4. يضعوا عصابة لحامل التجسيمي (الشكل 2) لتحقيق الاستقرار في الماوس ولمنع الحركة أثناء التصوير.
5. تحت المجهر الجراحي الصف تشريح، حفر ببطء قسم 1-2 ملم في الجمجمة باستخدام سرعة تسيطر عليها مثل DREMEL أداة (Meisinger 3.9 مم مثقاب) والتأكد من الحفاظ على مستوى المنطقة كما هو حفر عليه. تحقيق ذلك باستخدام نمط التعرج. لتجنب حرارة بناء، ضبط سرعة الحفر إلى الأقل وأخذ فترات راحة متكررة.
6. عندما تصبح الجمجمة الجمجمة تسلق في المظهر، ومواصلة رقيقمن الجمجمة باستخدام شفرة مشرط باستخدام نفس نمط التعرج للحفاظ على مستوى سطح ضعفت لتسهيل إزالة السلس للطبقات رقيقة من الجمجمة الجمجمة. استخدام غيض من شفرة مشرط جعل السكتات الدماغية خطية صغيرة مع الضغط الخفيف لإزالة طبقات رقيقة من العظام في وقت واحد. مواصلة هذا العمل حتى بشكل واضح الأوعية الدموية وضوحا من خلال المجهر تشريح.
7. إذا يثقب المجرب من خلال أو كسر في الجمجمة أثناء عملية رقيق، الموت ببطء الحيوان بسبب الضرر المحتمل أن القشرة الكامنة.
   ملاحظة: الجمجمة الماوس ما يقرب من 300 ميكرون في سمك ويتكون من اثنين من طبقات رقيقة من العظم المضغوط (الطبقة الداخلية واحد خارجي واحد)، وطبقة من العظم الإسفنجي تقع بين طبقتين من العظم المضغوط. الطبقة الخارجية من العظم المضغوط ويتم إزالة معظم العظم الإسفنجي داخل منطقة حفر 5 مم أدى إلى التقريبية طبقة 50 ميكرون من العظم المضغوط المتبقية (انظر الشكل 2B). Visualizسوف أوجه من الأوعية الدموية ضمان النهائية الجمجمة ضعيفة سليمة ما يقرب من 50 ميكرون في سمك. لذا الجمجمة لا تزال موجودة عندما ضعفت هذه سمك.

3. المجهر مجموعة المتابعة

1. استخدام نظام مجهر مقلوب (التقليدية، متحد البؤر أو النظامين الفوتون) الذي يحتوي على العاكس موضوعي. ملاحظة: من الممكن أيضا للاستفادة من المجهر تستقيم القياسية. فإن العامل المحدد أن تكون المساحة بين مرحلة والأهداف. تعديلات على مرحلة قد تكون ضرورية لتحقيق هذا الإعداد.
2. تأمين منصة الجراحية / التصوير إلى مرحلة العرف الذي يقع جانبا قاعدة المجهر. ملاحظة: يرصد منصة باستخدام جاك مختبر للسماح الحركة الرأسية من منصة العمليات الجراحية / التصوير تحت الهدف. هي التي شنت جاك مختبر لوحة الملصقة على أربعة أعمدة اسطوانية. (انظر الشكل 2).
3. وضع العاكس موضوعي يحتوي على 20Xالهدف خلال نافذة الجمجمة. استخدام مصدر ضوء خارجي للعثور على نافذة الجمجمة من خلال النظر من خلال العدسات المجهر ووضع الهدف في مجال التصوير. ملاحظة: سيتم يرمز منطقة التصوير من خلال وجود الأوعية الدموية.
4. لتحقيق أهداف المياه القائمة، استخدم السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي (ACSF) (130 ملي كلوريد الصوديوم، و 30 ملي بوكل، 12 ملي KH ₂ PO _4، 200 ملي NaHCO ₃ و 30 ملي HEPES، و 100 ملي الجلوكوز) باعتبارها وسيلة نظرا لاحتمالات تسرب داخل تجويف الجمجمة أثناء التصوير (الشكل 3).

4. روز البنغال صبغ إعداد وإدارة وتحريض السكتة الدماغية

1. إعداد 20 ملغ حل / مل جديدة من روز البنغال في السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي (ACSF)؛ تصفية وتعقيم قبل الإدارة. لا إعادة استخدام أو تخزين البنغال روز مرة واحدة وقد تم مزجه. جعل حل جديد لكل تجربة.
2. إعطاء حقن الوريد 0.1 مل ذيل روز البنغال بينما الصورةتعليب النافذة الجمجمة مع ليزر 561 نانومتر لضمان حقن كاف من الحل. ملاحظة: سيتم تصور روز البنغال في 5 ثانية بعد الحقن في الأوعية الدموية في الدماغ. ينبغي أن تملأ وعاء كامل مع روز البنغال.
3. بعد الحقن كافية من روز البنغال صبغ اختيار سفينة مناسبة للتخثر على أساس قطر الأوعية الدموية (40-80 ميكرون) لضمان استنساخ حجم الآفة بشكل خاص. التفريق بين الشرايين والأوردة من خلال النظر في اتجاه تدفق الدم: والشرايين تنتقل من قطر أكبر للسفن القطر الأصغر، وعروق تتحرك من أصغر لسفن القطر الأكبر. ويتم إنجاز هذا بسهولة عن طريق التصور مرة واحدة يتم حقن روز البنغال.
4. تغيير الإعداد المجهر على النحو التالي:
   1. زيادة مدة بقاء. ملاحظة: هذا وسوف تختلف وفقا لنظام المجهر يجري استخدامها.
   2. زيادة قوة الليزر إلى 100٪.
   3. جمع الصور التسلسل الزمني في 1 إطار / ثانية باستخدامأقصى سرعة المسح الضوئي.
5. مسح الماوس حتى يتم تشكيل جلطة مستقرة داخل السفينة. ملاحظة: هذا يتحقق عادة في غضون 5 دقائق من المسح المستمر (انظر الشكل 4).
6. بعد تحريض تشكيل الجلطة باستخدام روز البنغال، وإزالة الماوس من منطقة التصوير إلى مجهر تشريح. إزالة بعناية حلقة من الصلب غير القابل للصدأ من الجمجمة الجمجمة. دراسة نافذة في الجمجمة عن أي نزيف. في حالة حدوث نزيف، إنهاء التجربة.
7. استخدام 6.0 حيدة خياطة لإغلاق الجرح على الجمجمة. وضع مرهم مضاد حيوي على طول خط خياطة لمنع العدوى. حقن Buprenex (0.05 ملغ / كلغ) تحت الجلد كل 12 ساعة لمدة ثلاثة أيام لإدارة الألم.
8. عودة الماوس إلى غرفة الإنعاش بعد إزالة من مخدر حتى مستيقظا تماما والتحرك بحرية.
9. عودة الماوس إلى قفص نظيفة لمزيد من التحقيق في وقت لاحق.

5. التصوير الطولي على اللاحقة أيام

1. توظيف الأساليب التالية لإجراء التصوير الطولي في أيام لاحقة آخر photothrombosis.
   1. تخدير الماوس كما هو موضح في المادة 1 من الطرق.
   2. على الكافية التخدير إعادة فتح فروة الرأس عن طريق إزالة أي الغرز المتبقية لإعادة فتح الجلد المغطي مجال التصوير المحفورة سابقا.
   3. استخدام قضيب من القطن المعقم لإزالة أي رباط المتبقية المغطي الجمجمة.
   4. الغراء حلقة العرف الفولاذ المقاوم للصدأ (الشكل 1) مع لاصق الأنسجة حتى العظم المغطي مجال التصوير السابق.
   5. يضعوا عصابة لحامل التجسيمي (الشكل 2) لتحقيق الاستقرار في الماوس ولمنع الحركة أثناء التصوير.
   6. تحديد الأوعية الدموية الكامنة وراء الجمجمة ضعيفة سابقا. استخدام الوريد الذيل حقن FITC-ديكستران للتحقق من وجود تجلط يسببها سابقا.
   7. استخدام 6.0 حيدة خياطة لإغلاق فيCISION على الجمجمة. وضع مرهم مضاد حيوي على طول خط خياطة لمنع العدوى. حقن Buprenex (0.05mg / كلغ) تحت الجلد كل 12 ساعة لمدة ثلاثة أيام لإدارة الألم.
   8. عودة الماوس إلى غرفة الإنعاش بعد إزالة من مخدر حتى مستيقظا تماما والتحرك بحرية.

6. التأكيد من السكتة الدماغية التعريفي (بعد الوفاة)

1. في ختام دراسة، تحقق من حجم المخ باستخدام 2،3،5-triphenyltetrazolium كلوريد (TTC) تلطيخ كما هو مبين في الشكل (5). إن طريقة الكامل يمكن العثور عليه في ^12.

النتائج

وكان الهدف من هذا الأسلوب للحث على السكتة الدماغية في النماذج الحيوانية (الماوس والفئران) بعد حقن البلعة من RB عن طريق الوريد الذيل وإضاءة لاحقة من جمجمة ضعفت مع ضوء الليزر 561 نانومتر. الصور في الشكل (4) تدل على تطور تكوين جلطة في وعاء واحد بعد التشعيع في المنطق?...

Discussion

ابتليت القدرة على ترجمة التجريبية الفيزيولوجيا المرضية السكتة الدماغية من الحيوان إلى الإنسان التطبيق مع الفشل. ومع ذلك، فإن استخدام نماذج حيوانية، مثل نموذج photothrombosis، ويسمح لفهم أفضل للالسكتة الدماغية الفيزيولوجيا المرضية واستكشاف طرق علاجية جديدة لتوفير الحماي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Rose Bengal	Sigma	330000
Isoflurane Anesthetic	MWI Veterinary Supply	088-076
Vetbond	1469SB	1469SB
aCSF	126 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM glucose and 26 mM NaHCO3 (pH 7.4).
[header]
Equipment
Dissecting Scissors	Bioindustrial Products	500-410
Operating scissors 14 cm	Bioindustrial Products	12-055
Forceps Dumont High Tech #5 style, straight	Bioindustrial Products	TWZ-301.22
LabJack 132X80	Optosigma Co	123-6670
Platform for Labjack 8X 8	Optosigma Co	145-1110
Ear bar holder from stereotaxic setup	Stoelting/Cyborg	51654
Dispomed Labvent Rodent anesthesia machine	DRE, Inc.	15001
Tech IV Isoflurane vaporizer	DRE, Inc.	34001
F Air Canister	DRE, Inc	80120
Bain circuit breathing tube	DRE, Inc	86111B
Rodent adapter for bain tube	DRE, Inc	891000
O2 regulator for oxygen tanks	DRE, Inc	CE001E
Rodent induction chamber	DRE, Inc	15004C
Ethicon Silk 6-0; 18 in with P-3 needle	Suture Express	1639G
Objective inverter Optical Adapter	LSM technologies
Foredom drill Dual voltage 110/120	Foredom	134.53
Meisinger 3.9 mm drill bit	Meisinger		(Ref#310 104 001 001 009)