الاستقراء وتقييم الإصابة الإسكيمية-ضخه في Langendorff perfused لالجرذ القلوب

Summary

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

Abstract

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

Introduction

توضيح من الأحداث الكامنة وراء استجابة القلب لكلا نقص التروية وضخه ضرورية في تحسين علاج احتشاء عضلة القلب ⁽¹⁾ والقلب العمليات الجراحية التي تتطلب الأبهر عبر ^{تحامل-2.} في حين أن النماذج في الجسم الحي من نقص التروية إصابة ضخه تسمح تحليل نقطة النهاية مفيدة جدا، فهي ليست فعالة كما هو الحال لدراسة الآثار الفنية من نقص التروية إصابة ضخه تماما في الوقت الحقيقي. بالإضافة إلى ذلك، في نماذج نقص تروية الجسم الحي ضخه تنتج عادة التباين الكبير في حجم احتشاء، والتسليم المباشر من المخدرات إلى القلب في وقت ضخه يشكل تحديا. الاستفادة من نظام القلب Langendorff معزولة لدراسة إصابة نقص التروية ضخه يسمح في الوقت الحقيقي للتقييم وظيفي من العلاجات الدوائية، منطقة موحدة من الأنسجة محتشية، والتسليم الفوري من الدواء مباشرة إلى عضلة القلب.

وصف لأول مرة بذ أوسكار Langendorff في عام 1895 ^3، قلب Langendorff معزولة هو نموذج قوي لدراسة نقص التروية إصابة ضخه، بعد أن تم استخدامها في الأبحاث نقص التروية ضخه على مدى السنوات ال 40 الماضية ^4،5. هنا، يتم إجراء بعض التعديلات لتحسين قلب معزولة عن التحليل الوظيفي. وفي إقناء؛ إدخال القنية الموقع من الشريان الأورطي في حين أن القلب هو الضرب يضمن أن القلب لا تواجه شروط مسبقة الدماغية، التي من شأنها أن تغير نتائج التجارب نقص التروية ضخه ^6. ولتيسير ذلك، يتم تنفيذ عملية القصبة الهوائية، مما يسمح للتهوية وضمان الاستقرار الفسيولوجية للفئران أثناء الجراحة. ثم يرد القلب إلى كوب تغلف عمود الماء دوامة من خلالها يتم تسليم عازلة كريبس هنسلايت عبر نضح الوراء مباشرة في الشريان الأورطي. يتم إدخال بالون مملوء المالحة إلى البطين الأيسر وتعلق على محول الضغط، والذي يسمح لقياس الوقت الحقيقي من الضغوط من داخل لالبطينحساب د المعلمات وظيفية متعددة. في ختام التجربة، يتم مسح قلب مع المياه المالحة الباردة لاعتقال الانكماش وفلاش المجمدة في النيتروجين السائل لتمكين تحليل المصب من مستويات DNA، RNA والبروتين. وبالتالي تعديلها، يخدم قلب Langendorff perfused لكنظام فعال للرصد المباشر من أثر الفسيولوجية التدخلات الدوائية في أي وقت حادة خلال إصابة نقص التروية ضخه.

Protocol

وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات المذكورة هنا من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في كلية الطب بجامعة ولاية كارولينا الجنوبية. وصف التجارب هنا حادة، والتجارب عدم بقاء. على هذا النحو، لا يوجد أي استخدام مرهم العين وليس بحاجة لجناح التشغيل العقيمة. ويتحقق القتل الرحيم التي كتبها استنزاف أثناء الحصاد من القلب.

1. إعداد التجريبية

1. انشاء إما الضغط المستمر أو التدفق المستمر Langendorff الإرواء جهاز ^4.
2. إعداد 4 L المعدلة كريبس هنسلايت عازلة (في ملي: 112 كلوريد الصوديوم، 5 بوكل، 1.2 MgSO _4، 1 K ₂ هبو _4، 1.25 CaCl ₂ و 25 NaHCO _3، 11 D-الجلوكوز، 0.2 حمض الأوكتانويك، ودرجة الحموضة = 7.4).
   1. جعل 10X مخازن المخزون.
      1. حل كلوريد الصوديوم، بوكل، MgSO _4، وK ₂ هبو ₄ في 3 لتر ماء عالى النقاء.
      2. حل CaCl ₂ في 500 مل عالى النقاء واي المياهال 40 مل من 1 N حمض الهيدروكلوريك.
      3. إضافة ببطء CaCl ₂ حل لعازلة المحرز في 1.2.1.1. إضافة ما يكفي من الماء عالى النقاء لإجمالي 4 L. السماح ليقلب لمدة 1 ساعة قبل تصفية من خلال 0.8 ميكرون التصفية. تخزينها في 4 ° C.
      4. حل NaHCO ₃ في 4 لتر ​​ماء عالى النقاء. السماح ليقلب لمدة 1 ساعة قبل التصفية من خلال 0.8 ميكرون التصفية. تخزينها في 4 ° C
   2. الجمع بين 400 مل 10X كريبس هنسلايت عازلة مع 400 مل 10X NaHCO ₃ العازلة. إضافة ما يكفي من الماء عالى النقاء لإجمالي 4 L. حل الجلوكوز وحمض الأوكتانويك مع التحريك. من خلال تصفية 0.8 ميكرون التصفية.
3. إعداد نظام للقلب.
   1. إضافة 2 L العازلة التي تمت تصفيتها إلى زجاجة 4 L ضعت 38 في فوق محبس تعلق على قنية الشريان الأبهر. وهذا يلقي ضغط التروية 70-80 مم زئبق إلى القلب، وهو نضح الضغط الموصى به ^(4).
   2. إدراج الغاز تشتت الفوار في المخزن المؤقت في زجاجة.
   3. تشغيل المخزن المؤقت من خلال النظام، ويجري التأكد من القضاء على أي فقاعات من داخل الأنبوب.
   4. بدوره على الغاز (95٪ O _2/5٪ CO ₂₎ لا يقل عن 30 دقيقة قبل القلب إلى أن توضع على النظام. استخدام مسبار تدفق الغاز ومحلل غازات الدم للتحقق من تشبع الأكسجين.
4. إعداد المستلزمات الجراحية والبالون.
   1. لحصاد القلب، وإعداد زوج واحد من 6.75 "مقص جراحي، زوج واحد من 4.5" مقص، واثنين من أزواج من المرقأة، مجموعتين من ملقط caramalt، واثنين من المحاقن مع الإبر 27 G، 2 قطعة من 0-GUAGE خياطة الحرير (حوالي 15 سم في الطول)، واحدة 16/01 بوصة قنية الشائكة، واحدة قنية القصبة الهوائية.
   2. لتجميع القصبة الهوائية قنية، الغراء قطعة قصيرة من 1/16 بوصة أنابيب قطرها البلاستيك إلى Y-الموصل.
   3. لتجميع جهاز بالون: نعلق إبرة التغذية الأنبوبية لقطعة من 1/16 بوصة أنابيب، ثم إرفاق أنابيب في السكن محول الضغط. A حقنة صغيرة تعلق على الجانب الآخر من TR الضغطسوف ansducer الإسكان تسمح التضخم والانكماش من البالون.
      1. قطع مربع من البلاستيك التفاف ومكان غيض من إبرة أنبوب تغذية في المركز. التفاف التفاف البلاستيك حول الإبرة تسمين.
      2. ملء البالون بمحلول ملحي وربطة عنق قبالة مع اثنين من الغرز. تضخيم بالون لضمان عدم وجود تسرب. يجب أن يكون حجم من المياه المالحة داخل بالون منتفخ ما يقرب من 200 ميكرولتر، ولكن يمكن أن تختلف تبعا لحجم الفئران.
      3. بدلا من ذلك، استخدم المهد إصبع اللاتكس بدلا من الاغطية البلاستيكية. وضع أنبوب تغذية إبرة داخل المهد الاصبع، وملء مع المياه المالحة وربطة عنق قبالة.

2. حصاد قلب

1. كبح جماح فأر سبراغ داولي باستخدام decapicone أو غيرها من جهاز ضبط النفس اليدوي. وزن الفئران.
2. إدارة الكيتامين / خليط زيلازين (0.85 ملغم / كغم من الكيتامين و 0.15 ملغ / كغ زيلازين) عن طريق الحقن داخل الصفاق لتخدير الفئران. وهذه جرعة من مخدر توفر التخدير كافية ل20-40 دقيقة، ولكن ينبغي أن يكتمل الإجراء في أسرع وقت ممكن بعد تأكيد التخدير.
3. تأكيد درجة مناسبة من التخدير عن طريق اختبار قرصة أخمص قدميه لا ارادي.
4. الحثار
   1. إزالة قذف من منتصف forepaw إلى قاعدة الفك، وذلك باستخدام المرقأة لرفع قذف ومقص لجعل شق. الحفاظ على قذف مرتفعة لفصلها عن العضلات الأساسية، مما يسمح احد لقطع على طول قذف وإزالته.
   2. استخدام المرقأة، ورفع الأنسجة الغدية وجعل شق أفقي في رباط أقل شأنا من الأنسجة الغدية. استخدام المرقأة لنشر شق مفتوحة، مع الحرص على عدم شق عروق الوريد.
   3. استخدام المرقأة والعضلات قرصة المغطي القصبة الهوائية، وباستخدام مقص جعل شق عرضي في عضلة أسفل غيض من المرقأة. استخدام المرقأة، وانتشار الأنسجة وبصرف النظر للكشف القصبة الهوائية.
   4. إدراج بعناية المرقأة تحت القصبة الهوائية، وتطهير لفافة بينما تتقدم من خلال تطوير بلطف والتراجع المرقأة.
   5. مرة واحدة يتم وضعها المرقأة بنجاح وراء القصبة الهوائية، قرصة 0-0 خياطة الحرير مع المرقأة وhemisect القصبة الهوائية مع، الزوج حاد من مقص صغير.
   6. إدراج القصبة الهوائية قنية في القصبة الهوائية hemisected، وسحب الخيط وراء القصبة الهوائية، وربطة عنق خياطة حول القصبة الهوائية مقنى وترسيخ خياطة إلى Y-الفخذ من قنية مع عقدة الجراحين.
   7. باستخدام إبرة 27 G، وضخ 1000 U / كغ الهيبارين في الوريد الوداجي، والسماح لتعميم لمدة 30 ثانية.
5. بضع الصدر
   1. إزالة قذف من منتصف البطن إلى المنطقة منتصف forepaw عن طريق معسر مع المرقأة وقطع مع مقص.
   2. جعل ¾ بوصة عرضية شق في الجدار العضلي في البطن، أسفل الحجاب الحاجز.
   3. جعل شق عمودي فوق جدار البطن وجدار الصدر، وقطع على طول القص.
   4. قطع الحجاب الحاجز الخلفي ثنائيا، ثم انتشرت القفص الصدري لكشف القلب، المشبك القفص الصدري مع المرقأة للتأكد من أنه لا يزال انتشار.
   5. استخدام المرقأة، وإزالة بلطف الغدة الصعترية، وفضح الأبهر الصاعد.
   6. ندف المرقأة من خلال حلقة الأبهر، والنهوض والتراجع المرقأة وبلطف نشر رباط للسماح غيض من المرقأة من خلال.
   7. استخدام المرقأة لسحب 0-0 خياطة الحرير وراء الأبهر الصاعد، ربط الخيط الى فضفاضة نصف عقدة مربع.
   8. تحويل محبس لبدء تدفق العازلة نضح، hemisect الشريان الأورطي وعلى الفور إدراج قنية في تجويف الشريان الأبهر. بسرعة حزام السرج ونصف مربع عقدة واستكمال عقدة، وتشديد بدقة.
   9. استخدام المقص لتشريح القلب بعيدا عن الأوعية الدموية الكبرى، وإزالة القلب من الصدر ونعلق على العمود الارواء.
   10. تقليم بعيدا أنسجة الرئة الزائدة والسماح القلب لكي تتوازن على عمود لمدة 15 دقيقة قبل إدخال البالون. استخدام معدل التدفق الطبيعي للالعازلة من خلال قلب 10-20 مل / دقيقة.

3. Langendorff الإرواء ونقص التروية ضخه من الإصابات

1. وضع LV مسبقابالون ssure
   1. فرغ بالون بينما المتداول في شكل مخروط وتحويل محبس لضمان يبقى بالون منتفخ.
   2. المكوس الأذين الأيسر مع زوج من مقص صغير لفضح الوصول إلى الصمام التاجي.
   3. إدراج البالون من خلال الأذين الأيسر والبطين صمام تاجي إلى اليسار.
   4. بدء مراقبة ضغط البرنامج (LabChart برو).
   5. تضخيم بالون عن طريق فتح محبس وزيادة كمية من المياه المالحة في البالون حتى الضغط الانبساطي القراءة من مقياس الضغط المكروي يتجاوز الصفر بلطف.
   6. للتحقق استجابة طول التوتر، وتضخيم بالون ببطء إلى الضغط الانبساطي 75 ملم زئبقي، فرغ ببطء، كرر مرة واحدة.
   7. مجموعة الضغط الانبساطي إلى 10 مم زئبق عن طريق تحوير كمية من المياه المالحة في البالون. تحويل محبس لاغلاق بالون على هذا المستوى من التضخم، والحفاظ على نظام الضغط مغلقة بين البالون LV والضغط على المفاتيح.
   8. القلب انخفاض في تسخين غرفة وغطاء غرفة مع البلاستيك.
2. إعلانإسعاف من نقص التروية ضخه من الإصابات
   1. المكونات الجزء السفلي من غرفة ساخنة والسماح الغرفة لملء مع العازلة effused.
   2. عندما عازلة وقد غمرت القلب، وتحويل محبس لوقف تدفق عازلة في القلب، الأمر الذي أدى نقص التروية العالمي. الوقت نقص التروية يمكن أن تختلف تبعا لأهداف التجربة.
   3. بعد 30 دقيقة من نقص التروية، وتحويل محبس لاستعادة تدفق عازلة في القلب، وبدء ضخه.
   4. السماح ضخه من القلب لمدة 1 ساعة قبل إنهاء التجربة. استخدام مرة ضخه متغيرة، تبعا لأهداف التجربة.
3. إنهاء التجربة وحصاد الأنسجة
   1. باستخدام منفذ جانب والديوك، وإدارة 10 مل من الفوسفات مخزنة المالحة في 4 ° C في القلب بمعدل 10 مل / دقيقة للقبض على القلب.
   2. إزالة القلب من العمود التروية، وتقليم بعيدا المتبقية النسيج الأذيني.
   3. وضع القلب في الفولاذ المقاوم للصدأ تشريح الأنسجة مصفوفة، وتغطي مع السلطة الفلسطينيةrafilm، ومكان في -80 درجة مئوية لمدة 8 دقائق أو حتى قلب لديه مثل الاتساق الخطمي.
   4. إزالة كتلة من الفريزر وإدراج razorblades تشريح مصفوفة لشريحة القلب إلى 2 مم شرائح فيه. ويمكن أيضا كتل الأنسجة شراؤها مع أحجام شريحة أخرى من 2 ملم.
   5. إزالة شرائح في وقت واحد وتسقط في النيتروجين السائل لفلاش تجميد للدراسات كيميائية حيوية. الإبقاء على شريحة البطين الثالثة من قمة لاحتشاء تلطيخ.
   6. إزالة الأنسجة من النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى استخدامها في التجارب الكيميائية الحيوية.
4. احتشاء تلطيخ
   1. احتضان شريحة البطين الثالثة في 10 مل من 1٪ ث / ت triphenyltetrazolium كلوريد (TTC) عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: الحضانة في TTC لا يمكن أن يؤديها لمدة 15 أو 30 دقيقة مع أي تغيير في فعالية ^15.
   2. نقل شريحة الأنسجة من TTC إلى 10٪ مخزنة الفورمالين والسماح لاحتضان في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. لأفضل النتائج، والاستماعينبغي أن تؤخذ نهاية الخبر من الفورمالين والتقط خلال 24 ساعة ^4.
   3. صورة ملطخة شريحة واستخدام البرمجيات مثل يماغيج لتقدير حجم احتشاء وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. التقاط الصور في أقرب وقت ممكن بعد التثبيت، كما الصبغة سوف تتلاشى مع مرور الوقت.

النتائج

اليسار الجهاز بالون البطين يسمح للرصد في الوقت الحقيقي من الضغوط التي وضعتها البطين التعاقد اليسار (الشكل 1). كما هو موضح سابقا ^7، وهذا أثر ضغط يمكن استخدامها لحساب العديد من المعلمات وظيفة البطين. هذه الحسابات يمكن أن تكون في المرحلة الأساسية فضلا عن م?...

Discussion

ومعزولة perfused لقلب الفئران يمكن استخدامها بنجاح لدراسة تأثير التدخل الدوائي على شروط مسبقة القلب في نقص التروية إصابة ضخه ^9. ومع ذلك، هناك بعض الخطوات الأساسية إلى الإجراء الذي يجب أن تكون موحدة من أجل ضمان تحقيق نتائج استنساخه. الحفاظ على درجة حرارة 37.4 درجة مئو?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P9541
Magnesium Sulfate	Sigma Aldrich	203726
Potassium Phosphate Dibasic	Sigma Aldrich	RES20765-A7
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma Aldrich	C8106
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
D-Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Octanoic Acid	Sigma Aldrich	C2875
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Sigma Aldrich	T8877
Medical Pressure Transducer	MEMSCAP	SP844
Masterflex Peristaltic Pump	Cole Parmer	EW-07521-40
Masterflex Easy Load Pump Head	Cole Parmer	EW-07518-10
Heated circulating water bath	Lauda	M3
Tubing Flow Module	Transonic	TS410
Modular Research Console	Transonic	T402
Inline flow sensor	Transonic	ME2PXN
PowerLab Data Acquisition Device	AD Instruments	PL3508
LabChart data acquisition software	AD Instruments	MLU60/8