JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

Abstract

هذا البروتوكول تفاصيل توليد اخلوي، بعد biofunctional، الكلى المصفوفة خارج الخلية (ECM) السقالات التي هي مفيدة بمثابة ركائز نموذجا مصغرا للتنمية أنسجة الجهاز النطاق. ومقنى الكلى الفئران سبراغ داولي عن طريق إدخال قسطرة في الشريان الكلوي ومع perfused سلسلة من المنظفات المنخفض التركيز (تريتون X-100 و سلفات الصوديوم دوديسيل (SDS)) أكثر من 26 ساعة لاشتقاق سليمة، السقالات كامل الكلى مع سليمة الأوعية الدموية perfusable، الكبيبات، والأنابيب الكلوية. بعد decellularization، يتم وضع سقالة الكلى داخل سفينة نضح مفاعل حيوي مصمم خصيصا، وتوصيل الشريان الكلوي القثطار إلى الدائرة نضح وتتألف من: مضخة تحوي؛ أنابيب. وتحقيقات اختياري للأس الهيدروجيني، الأكسجين الذائب، والضغط. بعد تعقيم السقالة مع حمض البيروكسي والإيثانول، وموازنة درجة الحموضة (7.4)، ويتم إعداد السقالة الكلى لبذر عبر نضح من مستنبت داخل تأحافظت حاضنة القدرات ه عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. يتم حقن أربعين مليون الظهارية أنبوبي القشرية (RCTE) خلايا الكلى من خلال الشريان الكلوي، وبسرعة perfused لمن خلال منصة الاعدام تحت تدفق عالية (25 مل / دقيقة) وضغط (~ 230 مم زئبق) لمدة 15 دقيقة قبل الحد من تدفق إلى معدل الفسيولوجية (4 مل / دقيقة). خلايا RCTE تعبئة في المقام الأول على ECM المتخصصة أنبوبي داخل القشرة الكلوية، تتكاثر، وتشكيل الهياكل الظهارية الأنبوبية على مدى سبعة أيام الثقافة نضح. وperfused لحل ريسازورين 44 ميكرومتر في مستنبت من خلال الكلى لمدة 1 ساعة خلال تبادل المتوسطة لتوفير فلوروميتريك، على أساس الأكسدة تقييم التمثيل الغذائي للبقاء الخلية والانتشار خلال tubulogenesis. مفاعل حيوي نضح الكلى يسمح أخذ العينات غير الغازية المتوسطة لتقييم والكيمياء الحيوية، والموانئ مدخل متعددة تسمح البذر الوراء بديل عن طريق الوريد الكلوي أو الحالب. هذه البروتوكولات يمكن استخدامها لrecellularize السقالات الكلى معمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك بطانة الأوعية الدموية، الظهارية أنبوبي، والخلايا الليفية اللحمية، لتقييم السريع داخل هذا النظام.

Introduction

كما لا يزال عدد من المرضى الذين يعانون من الفشل الكلوي في نهاية المرحلة إلى زيادة، وهناك نقص حاد ومتزايد في عدد من الكلى المانحة المتاحة للزرع. عدم القدرة على تلبية الطلب من عدد متزايد باستمرار من المرشحين المدرجة في الانتظار لزرع الكلى دفعت الأبحاث في مجال الهندسة الجهاز الكلى مع الهدف النهائي المتمثل بتطوير حسب الطلب، الطعوم الكلى زرع عند الطلب 1،2. سوف تعمل بناء أنسجة الكلى من خلايا المريض نفسه القضاء على الحاجة إلى تثبيط المناعة مدى الحياة، وتقلل من كمية الوقت المرضى يقضون على غسيل الكلى في انتظار عملية زرع الكلى، وتوسيع زرع المنقذة للحياة إلى مزيد من المرضى الذين يعانون من مرض الكلى المزمن.

الخطوة الأولى نحو الهندسة الحيوية نسيج الكلى باستخدام الخلايا المشتقة من المريض هو تطوير سقالة التي هي بمثابة الركيزة الداعمة لحمة الكلوي (على سبيل المثال epithe أنبوبيlial)، الخلايا الليفية سدى، ونمو الخلايا في الأوعية الدموية. السقالات مادة بيولوجية مستمدة من هيئة الطبيعي مصفوفات خارج الخلية (موبينيل) لديها العديد من الخصائص التي تجعلها مرغوبة للاستخدام في هندسة الأنسجة، بما في ذلك تكوين البيولوجي الطبيعي فيها؛ الاقتصاد الكلي والمجهرية مناسبا لمنح وظيفة فسيولوجية. وتوافق مع الحياة الخلوية، وتعزيز التصاق الخلية، والهجرة، والأنسجة بناءة إعادة عرض 3. وهناك طريقة واعدة لإنتاج السقالات لتجديد أنسجة الكلى من خلال decellularization من خيفي أو xenogeneic الكلى التي تحافظ على الكثير من التعقيد تكوين البروتين الطبيعي للECM الكلى 4، الإبقاء على تعقيد المعماري الأصيل للجهاز، والتغلب على الصعوبات المرتبطة من الأسفل يصل هندسة الأنسجة cellularized سميكة من خلال توفير إمدادات الأوعية الدموية إلى خلايا النامية بعد سقالة recellularization 5.

نضح decellularization هو عمليةيتم تسليم والمنظفات، والإنزيمات، أو غيرها من الحلول تعطيل الخلايا بشكل موحد من خلال شبكة الأوعية الدموية للجهاز 6. وقد أنشئت هذه الاستراتيجية باعتبارها عملية فعالة لاستخلاص ديكي السقالات ECM القائم على الجهاز كما ثلاثي الأبعاد (3D)، والقوالب البيولوجية للهندسة كامل الجهاز 6-8، كما يتضح من خلال تطوير نماذج الكلى ديكي من كلى الانسان التخلص منها 9 والكليتين xenogeneic تم الحصول عليها من واسع الحيواني (مثل الخنزير 10، الماعز 11) ومصادر القوارض 12. على وجه الخصوص، واستخدام النماذج الحيوانية الصغيرة مثل القوارض يتطلب أقل الخلايا وسائل الإعلام والثقافة، وهي مفيدة بشكل خاص للدراسات recellularization الجهاز الذي أعداد الخلايا وعادة ما تكون محدودة، كما هو الحال مع الأنسجة المشتقة من الخلايا الجذعية. والهدف من هذا البروتوكول decellularization وصفها هو إنتاج ECM الكلوي لا خلوي التي يمكن استخدامها كنظام سقالة 3D لتجديد متطوره الكلىوفاق، بما في ذلك الأنابيب كليون التي يتم إسكانها في المثال الحالي مع الإنسان الكلوي الظهارية أنبوبي القشرية (RCTE) الخلايا. وصفنا سابقا تقييم دقيق لدينا لالأمثل، القائم على بروتوكول المنظفات الفئران الكلى decellularization 7، التي هي أكثر سريعة (يوم واحد تقريبا) من طرق أخرى ذكرت سابقا (روس آخرون .- 5 أيام 12، الأغنية وآخرون .- 4.5 أيام 13)، ويعرض الجهاز إلى تركيز أقل من ذلك بكثير (0.1٪) من كبريتات الصوديوم دوديسيل ممسخ (SDS) خلال decellularization من التقارير السابقة 12-15.

وقد وصف عدد محدود من الدراسات استخدام الكلى القوارض لdecellularization واستخدامها فيما بعد بمثابة سقالة 3D لإعادة تعمير الخلوية (إعادة النظر في أماكن أخرى 1) 12-16. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم وصفا مفصلا لالمحددة مسبقا، واستراتيجية decellularization المثلى لدينا لإنتاج السقالات الكلى ديكيمن سبراج داولي الكلى الفئران 7. باستخدام مصمم خصيصا المفاعلات الحيوية نضح قادرة على المزدوجة البذر وصيانة نضح الثقافة 17، ونحن recellularize السقالات الكلى ديكي مع الخلايا RCTE الإنسان، الذي اعد اسكان على الدوام عنصر أنبوبي في هذه المصفوفات decellularized، تتكاثر، والبقاء على قيد الحياة في الثقافة نضح لأكثر من أسبوع. نظهر أيضا استخدامنا للمقايسة ريسازورين نضح - غير مكلفة وغير السامة للخلايا، وتقييم الأيضي غير الغازية المستخدمة سابقا من أجل سمية الخلايا يدرس 17 - لتوفير مؤشرا على بقاء الخلية والانتشار داخل الكلى recellularized مع مرور الوقت 7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ETHICS بيان: تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية التي وافقت عليها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة نورث وسترن.

1. الكلى Decellularization

  1. إعداد الحلول decellularization. إعداد المجلدات التالية الكاشف لكل كلية ليتم decellularized، بالإضافة إلى حجم إضافي واحد (على سبيل المثال، لمدة 4 الكلى، وإعداد 5000 مل تريتون X-100 للخطوة 1.1.3):
    1. إعداد 500 مل التناضح العكسي المياه (ROH 2 O). ملاحظة: بدلا من ذلك، الماء منزوع الأيونات يمكن أن تستخدم في الخطوات التي يشار ROH 2 O.
    2. إعداد 1000 مل تريتون X-100، 1٪ (V / V) في ROH 2 O. إضافة ببطء 10 مل تريتون X-100-990 مل من الماء في كوب كبير مع التحريك السريع على طبق من ضجة. السماح للكاشف لتذوب تماما قبل الاستخدام (على الأقل 10 دقيقة).
    3. إعداد 1000 مل تريتون X-100، 1٪ (V / V) في ROH 2 O (سبتمبرحجم arate).
    4. إعداد 1000 مل الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS)، 0.1٪ (V / V) في ROH 2 O. إضافة ببطء 5 مل SDS (20٪ محلول المخزون) إلى 995 مل من الماء في كوب كبير مع التحريك السريع على طبق من ضجة. السماح للكاشف لخلط موحد قبل الاستخدام (على الأقل 10 دقيقة).
    5. إعداد 500 مل ROH 2 O (مجلد مستقل).
  2. إعداد الكلى لdecellularization.
    1. استعادة الكلى من الذكور الفئران سبراغ داولي (250-300 ز) كما هو موضح سابقا 7.
      1. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من بنتوباربيتال (50 ملغم / كغم من وزن الجسم). دراسة في كثير من الأحيان على عمق التخدير (كل 10-15 دقيقة) من خلال رصد وظيفة الجهاز التنفسي ومعدل ضربات القلب، واستجابة قرصة أخمص قدميه أثناء الجراحة. إذا كان الحيوان لديه معدل التنفس مرتفعة أو المنعكس دواسة إيجابي، إدارة جرعة إضافية (مع 1/3 إلى 1/4 من الجرعة الأولى) من بنتوباربيتال.
      2. أداء خط الوسط abdomina الطوليل شق لفضح الكلى، الشريان الأورطي البطني، والوريد الأجوف السفلي.
      3. ضخ 2000 وحدات الهيبارين USP / كجم من وزن الجسم في الوريد القضيب.
      4. تعبئة كل من الكليتين عن طريق تشريح لطيف. فصل بعناية الكلى من الدهون محيط بالكلية، مع الحفاظ على كبسولة الكلى المحيطة الكلى سليمة. يروي الكلى مع المياه المالحة الباردة (10 مل) من خلال الشريان الأورطي البطني الأشعة تحت الكلى.
    2. ادخال قسطرة قياس 24 في الشريان الكلوي، ligate بإحكام القسطرة إلى الشريان، و(باستخدام حقنة) يروي بلطف الكلى مع 10 مل الفوسفات مخزنة المالحة الباردة (PBS) لواضح تماما الجهاز من الدم.
    3. تزج الكلى في 25 مل PBS في طبق بتري وضعها في الثلاجة -20 درجة مئوية إلى تجميد تدريجيا الجهاز (وبالتالي يحفز تحلل الخلية) لتخزين حتى decellularization.
      ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، ويمكن أيضا أن مقنى الحالب و / أو الوريد الكلوي لبذر الوراء، وإن لم يكن هو موضح في ثيالصورة البروتوكول.
    4. تماما ذوبان الجليد الكلى المجمدة (equilibriate في درجة حرارة الغرفة (RT))، ويروي بلطف مع 10 مل من برنامج تلفزيوني للتحقق من الشريان الكلوي ligated للكشف عن التسربات. إذا لوحظ تسرب أو مقاومة كبيرة، وإعادة يقثطر الشريان الكلوي.
  3. إعداد المعدات اللازمة لdecellularization. تجميع نظام نضح decellularization كما هو مبين في الشكل 1B.
    1. ربط واحدة 8 "طول مضخة تحوي أنابيب (1D الشكل، و) لاثنين من أطوال كافية (> 36" موصى به) من 1/16 "قطرها الداخلي (ID) المطاط سيليكون أنابيب (1D الشكل، ح). استخدام اثنين من قفل لور الذكور 1/8 "محولات الشائكة انضم إليه امرأة واحدة لور س الإناث محول لور للانضمام شرائح من الأنابيب (1D الشكل، ي). إدراج الذكور لور قفل إضافي إلى 1/8 "محول الشائكة (1D الشكل، ج) في نهاية المصب من خط نضح عن التعلق الكلويقسطرة الشريان.
    2. ربط كل قطعة ضخ أنابيب تحوي على 4 أسطوانات رأس المضخة باستخدام خرطوشة مضخة كبيرة.
    3. بعد وضع نهاية المنبع من أنابيب مطاط السيليكون في الخزان الحل الأول (ROH 2 O)، مع الاستمرار على زر "رئيس الوزراء" لرئيس بالكامل كل دائرة نضح مع الحل. CRITICAL: تحقق من عدم وجود فقاعات تبقى محاصر في الأنبوب، وبأن نهاية المنبع (مفتوحة اليسار لرسم السوائل) من أنابيب المطاط سيليكون هو المضمون تحت واجهة السائل الهواء من الخزان الكاشف، كما هو مبين في الشكل 1B.
  4. أداء بروتوكول decellularization في RT 7.
    1. توصيل قسطرة الشريان الكلوي من كل كلية إذابة إلى نهاية نضح الدائرة أنابيب المصب من المضخة، وضمان عدم وجود فقاعات الهواء هي محاصر في القسطرة. تسمح الكلى إلى تعليق على الجدار الداخلي للعلبة فارغة ل5 L الكأس (خزان جمع سائل الإرواء، انظر الشكللدى عودتهم 1B) بحيث الشريان الكلوي ليس متلوى أو ملفوف.
    2. ضبط محرك المضخة إلى 5 مل / دقيقة، ثم اضغط على زر "ابدأ". تأكد من أن كل الكلى وperfusing من خلال مراقبة حلول بالتنقيط من الجزء السفلي من الجهاز.
    3. يروي كل كلية مع الكواشف التالية كما هو موضح في الشكل 1A
      1. يروي مع 500 مل ROH 2 O في 5 مل / دقيقة لمدة 1 ساعة و 40 دقيقة.
      2. يروي مع 1000 مل 1٪ تريتون X-100 على 5 مل / دقيقة لمدة 3 ساعة و 20 دقيقة.
      3. يروي مع 1000 مل 1٪ تريتون X-100 في 1 مل / دقيقة لمدة 16 ساعة و 40 دقيقة.
      4. يروي مع 1000 مل 0.1٪ SDS في 5 مل / دقيقة لمدة 3 ساعة و 20 دقيقة.
      5. يروي مع 500 مل ROH 2 O في 5 مل / دقيقة لمدة 1 ساعة و 40 دقيقة.
        ملاحظة: قد يتم تخزين كل كلية decellularized في برنامج تلفزيوني (بدون إضافات) في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل في 4 ° C لمدة أقصاها أسبوعين قبل الاستخدام.

2. لكلالانصهار الجمعية مفاعل حيوي، الكلى التعقيم، والتحضير لRecellularization

  1. إعداد السفن مفاعل حيوي.
    1. غسل الخزانات الزجاجية مفاعل حيوي (المكون الجسم) ورؤساء مفاعل حيوي مع دافئة، وتمييع الحلول المنظفات طبق (على سبيل المثال 1٪ محلول منظف طبق فى ماء الصنبور) ويشطف جيدا بماء الصنبور ثم ROH 2 O. تسمح المكونات حتى يجف تماما.
    2. تطبيق كمية صغيرة (~ 5 مل) من siliconizing كاشف للأسفل كل خزان. ضمان كاشف يبلل السطح السفلي بأكمله لعدة ثوان، ثم تصفى السوائل الزائدة.
    3. السماح للخزانات لتجف في غطاء الدخان في RT O / N. بدلا من ذلك، يمكن تجفيف الخزانات في الفرن على 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتسريع تجفيف وتحسين المتانة للطلاء، الذي يهدف إلى منع المرفق من الخلايا إلى قاع الخزان الزجاج مفاعل حيوي.
  2. إعداد مكونات الدائرة نضح لتعقيم (الشكل1D).
    1. قطع أطوال التالية أنابيب (لكل مفاعل حيوي):
      1. قطع اثنين 25 "أطوال 1/16" مطاط السيليكون ID أنابيب (1D الشكل، ح).
      2. قطع واحد 8 "طول مضخة تحوي أنابيب (1D الشكل، و).
      3. قطع واحد 4.25 "طول 16/01" ID المطاط سيليكون أنابيب.
      4. قطع اثنين 1 "أطوال الجدران السميكة 1/16" سيليكون ID المطاط أنابيب (1D الشكل، ز).
      5. قطع واحد 2 "طول 1/4 'ID X 0.5" القطر الخارجي (OD) المطاط سيليكون أنابيب (1D الشكل، ه).
    2. إعداد محولات لور التالية (لكل مفاعل حيوي):
      1. إعداد 10 من الذكور لور القفل ل"محولات 08/01 الشائكة (1D الشكل، ج)
      2. إعداد 2 الذكور لور المقابس (1D الشكل، أ)
      3. إعداد 2 قبعات لور الإناث (1D الشكل، ب)
      4. إعداد 5 إناث لورمحولات x لور الإناث (X5؛ 1D الشكل، د)
    3. يغسل كل محولات الأنابيب ولور مع دافئة، وتمييع الحلول المنظفات طبق، شطف جيدا في ماء الصنبور ثم ROH 2 O، والسماح لهم لتجف.
  3. تجميع الدوائر الارواء.
    1. زلة 1 "طول الجدران السميكة 16/01" ID المطاط سيليكون أنابيب على مدخل متقبل لور تعلق على الرأس من مفاعل حيوي. ذكر مكان لور القفل ل1/8 "محول شوكة ID في نهاية مفتوحة للأنابيب. أكرر للآخرين لور متقبل مدخل، وربط سقف لور الإناث لاغلاق ميناء (يقصد لالحالب أو الوريدية تقنيات البذر وليس وصفها في هذا البروتوكول).
    2. ربط كل "شريحة من 16/1" 25 ID المطاط سيليكون أنابيب إلى "الجزء 8 من مضخة تحوي أنابيب باستخدام قفل لور الذكور 1/8" شوكة ID والإناث لور س الإناث محولات لور (1D الشكل، ي).
    3. قم بتوصيل أحد طرفي المفتوحة للسيليكون المطاط توبينز إلى منفذ سائل الإرواء وسائل الإعلام على السطح الخارجي للرئيس مفاعل حيوي. ربط "طول 16/01" 4.25 أنابيب ID إلى المعاكس (الداخلي) جانب من الإرواء وسائل الإعلام في الداخل من الرأس مفاعل حيوي.
    4. ربط قفل لور الذكور إلى 1/8 "محول الشائكة ID لتبقى نهاية مفتوحة للأنابيب الدائرة نضح. توصيل لور أنثى × الإناث محول لور القفل لور الذكور. ربط لور أنثى × الإناث محول لور لفتح الذكور لور قفل المؤدية الى مدخل لور متقبل على مفاعل حيوي. وهذا سيكون بمثابة وسائل الإعلام الإرواء مدخل المؤدي مباشرة إلى الشريان الكلوي القثطار.
    5. ضمان أن يتم ترك أي منافذ على غطاء مفاعل حيوي مفتوح أو عرضة للخطر. بإحكام إغلاق صمام فراغ على هيئة مفاعل حيوي.
    6. تناسب الرأس مفاعل حيوي أنحاء الجسم الخزان، مع الدائري O تقع بين الأخاديد متطابقة بطانة كل مكون. وضع المشبك المعدني عبر واجهة لعقد العنصرين معا.
    7. تناسب منفذ تهوية على رأسه مفاعل حيوي مع فلتر تنفيس 0.2 ميكرون، وربط عنصرين باستخدام "طول 2 من 1/4 'ID X 0.5" OD المطاط سيليكون أنابيب (1D الشكل، ه). فتح صمام تنفيس.
    8. تخفيف قليلا من سقف المسمار أحمر على رأسه مفاعل حيوي.
    9. وضع ما تبقى من محولات لور و 6 "عينة ملقط مسنن في الحقيبة autoclavable والختم.
  4. الأوتوكلاف المفاعلات الحيوية تجميعها والمقابس لور الذكور.
  5. إعداد الكواشف التالية لتعقيم سقالة ونضح المتوسط ​​قبل البذر (يتم سرد مجلدا في الكلى decellularized):
    1. داخل غطاء الدخان، وإعداد حمض البيروكسي 50 مل 0.1٪، 4٪ محلول الإيثانول عن طريق إضافة 2.56 مل من محلول حمض البيروكسي (39٪ تركيز الأسهم) و 40 مل 200 الإيثانول واقية إلى ~ 957 مل ROH 2 O في زجاجة 1 لتر. مزيج دقيق من قبل مرارا وتكرارا قلب زجاجة، ووضع في خزانة السلامة البيولوجية.
    2. إعداد150 مل 1X حل PBS، تعقيم مسبقا من قبل التعقيم.
    3. تجهيز 50 مل DMEM / F12 المتوسطة تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين ستربتومايسين (القلم بكتيريا).
  6. جمع البنود المتبقية لتجميع نضح مفاعل حيوي. وضع كافة العناصر الموجودة في خزانة السلامة البيولوجية. CRITICAL: تأكد من أن مجلس الوزراء السلامة البيولوجية مزودة العمل المقابس الكهربائية لتشغيل محرك مضخة الرقمي. بدلا من ذلك، استخدم سلك التمديد لتوصيل محرك المضخة إلى المآخذ الكهربائية الخارجية خارج مجلس الوزراء.
    1. جمع الكلى decellularized.
    2. جمع المفاعلات الحيوية تعقيمها مع الدوائر نضح المرفقة.
    3. جمع الحقيبة تعقيمها تحتوي على محولات لور وملقط.
    4. جمع محرك مضخة الرقمية المرفقة مع رئيس 4 أسطوانات، وخراطيش مضخة كبيرة (1 في حلبة التروية).
  7. استكمال الدائرة نضح كما هو موضح في الشكل 1C تحت ج معقمةonditions داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
    1. توصيل 3-الطريقة محبس (1D الشكل، ط) بين الذكور لور القفل ل1/8 "محول شوكة ID بالقرب من مدخل الإرواء وسائل الإعلام ولور الإناث محول العاشر لور الإناث. ترك جميع الموانئ الثلاثة على فتح محبس.
    2. إزالة الغطاء المسمار أحمر على رأسه مفاعل حيوي وماصة 50 مل من حمض البيروكسي 0.1٪، 4٪ محلول الإيثانول إلى الخزان المتوسطة من خلال فتح.
    3. ربط الجزء مضخة أنابيب تحوي على رأس المضخة باستخدام خرطوشة مضخة كبيرة. ضبط معدل تدفق إلى 5 مل / دقيقة، اضغط على "ابدأ"، والسماح للدائرة لرئيس الوزراء.
      1. عندما يملأ السائل خط نضح ويصل ما تبقى من منفذ مفتوح من ثلاثي محبس، والمكونات الميناء باستخدام لور التوصيل ذكر (1D الشكل، أ).
      2. السماح للدائرة لرئيس بالكامل حتى يتم احترام أي الهواء في الأنبوب الدائرة نضح أو في الداخل من مدخل لور المتقبلة. إذا necessaراي، وزيادة معدل تدفق مؤقتا لطرد فقاعات من خط التروية. عندما تستعد تماما، والتوقف عن محرك المضخة.
    4. المكونات بعناية لور نهاية الإناث لقسطرة الشريان الكلوي في مدخل الرجال متقبل لور على السطح الداخلي للرئيس مفاعل حيوي باستخدام معقم 6 "ملقط. تأكد من الاتصال هو ضيق وعدم ترك أي الهواء في القسطرة. السماح الكلى لشنق بلطف من الشريان الكلوي القسطرة، بحيث الشريان الكلوي لا تحريف أو شبك.
    5. تشديد المشبك المعدني متماسكا رئيس مفاعل حيوي والجسم بحيث يتم اغلاق خزان مفاعل حيوي بإحكام. أغلق الغطاء المسمار أحمر على رأسه مفاعل حيوي.
  8. تعقيم الكلى في RT التي نضح بنسبة 0.1٪ البيروكسي، 4٪ محلول الإيثانول في 5 مل / دقيقة لمدة 1 ساعة، ثم ثلاثة متتابعة perfusions 1-ساعة على RT مع 50 مل PBS في 5 مل / دقيقة.
    1. تغيير الحلول:
      1. بعد 1 ساعة، ووقف ضخ وفتح أحمر سقف المسمار. باستخدام الظريفيثير غضب (تعقيمها) ماصة باستير، نضح بعناية كل من الحل من خزان مفاعل حيوي. ترك الدائرة نضح تستعد بشكل كامل.
      2. ماصة 50 مل من محلول العذبة في خزان مفاعل حيوي، أغلق الغطاء المسمار، وبدء تشغيل المضخة.
  9. بعد PBS شطف النهائي، نضح PBS من الخزان وماصة في 50 مل DMEM / F12 المتوسطة تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ القلم بكتيريا. أغلق الغطاء المسمار، ونقل مفاعل حيوي مع الدائرة نضح تعلق على حاضنة ذات قدرة كبيرة حافظت على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  10. إذا لزم الأمر، ونقل محرك المضخة إلى الحاضنة. ربط مفاعل حيوي نضح الدائرة إلى المضخة، ويروي الكلى في 4 مل / دقيقة لا يقل عن 1 ساعة قبل البذر.

3. الكلى Recellularization مع خلايا الكلى القشرية أنبوبي الظهارية

  1. كميات كافية الدافئة DMEM / F12 (تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ القلم بكتيريا) وجالذراع النأي انزيم لرفع الخلية إلى 37 ° C. يتم سرد أحجام المقترحة أدناه:
    1. إعداد 10 مل خلية النأي الإنزيم و 10 مل DMEM / F12 في 175 سم 2 قارورة الثقافة لرفعها.
    2. إعداد 5-10 مل DMEM / F12 في الكلى أن المصنف.
  2. جمع عدد كاف من قوارير الثقافة للتركيز البذر المطلوب (4 × 10 7 خلدت الخلايا RCTE الإنسان 18 في نتائج الكلى في engraftment القصوى من خلايا RCTE باستخدام هذه الاستراتيجية البذر).
  3. خلايا رفع من قوارير باستخدام انزيم النأي الخلية. نضح المتوسطة من القارورة، ثم ماصة 10 مل خلية النأي الانزيم في قارورة. مكان قارورة في 37 ° C حاضنة للإسراع في التفكك.
  4. تحقق قارورة على المجهر النقيض من المرحلة كل 2 دقيقة حتى لوحظ التفكك الكامل من الخلايا من سطح القارورة. ملاحظة: فترة حضانة سوف تختلف تبعا لمستوى التقاء الخلايا، ولكن الخلايا RCTE سوف صequire حوالي 15 دقيقة لفصل كامل.
  5. أخذ عينة من تعليق خلية نأت لحساب قبل التكوير. تمييع تعليق الخلية مع حجم مساو من قبل حرارة متوسطة DMEM / F12، وأجهزة الطرد المركزي في 232 x ج قوة الطرد المركزي النسبية (RCF) لمدة 5 دقائق.
  6. عد الخلايا خلال الطرد المركزي. تمييع العينة التي تم الحصول عليها مع حجم مساو من التريبان الأزرق، وماصة 10 ميكرولتر في كل نهاية عدادة الكريات لفرزها. حساب الضروري حجم بيليه تخفيف للحصول على التركيز المطلوب بذر (2 × 10 7 خلية / مل).
  7. بعد الطرد المركزي، ويخفف من بيليه مع حجم مناسب من مستنبت للحصول على تركيز النهائي من 2 × 10 7 خلية / مل. وضع 2 مل من تعليق البذر في معقمة 5 مل حقنة.
  8. نقل مفاعل حيوي نضح إلى مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. تحويل صمام محبس لإغلاق تدفق إلى ميناء البذر. إزالة الذكور لور انزلاق المكونات منمحبس، وتوصيل حقنة محملة تعليق البذر.
  9. نقل بسرعة الدائرة نضح العودة إلى الحاضنة، واستخدام خرطوشة مضخة كبيرة لتأمين جزء ضخ أنابيب تحوي على رأس المضخة.
  10. البذر الخلية: إغلاق منفذ صمام محبس لافتا نحو المضخة. حقن ببطء تعليق خلية في الكلى، وضمان أن تعليق كامل يتم نقل من الحقنة في محبس ونضح الخط. تحويل صمام محبس لإغلاق تدفق من الحقنة، وبدء تشغيل المضخة في 25 مل / دقيقة لمدة 15 دقيقة.
  11. بعد 15 دقيقة، وانخفاض معدل تدفق المضخة إلى 4 مل / دقيقة. تبادل المتوسطة (حجم 100 مل لتغييرات لاحقة) في اليوم التالي وبعد ذلك كل يومين.

4. تقييم سلامة الخلية وانتشار استخدام ريسازورين الإرواء الفحص

  1. إعداد كاشف ريسازورين. حل 110.5 ملغ الملح ريسازورين الصوديوم في 100 مل من برنامج تلفزيوني مع التحريك، وتمييع 01:10 بإضافة 5 مل منمما أدى إلى حل 45 مل PBS جديدة لإنشاء 440 ميكرومتر حل الأسهم ريسازورين. فلتر تعقيم (باستخدام فلتر 0.2 ميكرومتر حقنة)، وتخزين حل الأسهم في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الخفيف محمية في 4 ° C.
  2. إعداد الضوابط وسائل الاعلام تستكمل ريسازورين. يعد حل 10٪ من ريسازورين كاشف في مستنبت (على سبيل المثال. 5 مل ريسازورين حل سهم + 45 مل مستنبت) لإنشاء ريسازورين حل العاملة. الأوتوكلاف حجم 10 مل من محلول العمل ريسازورين في حاوية الخفيفة محمية. ملاحظة: هذا سوف يقلل بشكل كامل مجمع ريسازورين إلى resorufin، وسيكون بمثابة مراقبة إيجابية لحساب الحد ريسازورين في المئة.
  3. قسامة 1 مل من محلول كل العمل ريسازورين (المؤكسد)، تعقيمها ريسازورين حل (خفض)، ومستنبت تعمل وحدها (فارغة) في منفصلة 1.5 مل أنابيب جمع. وضع أنابيب مفتوحة في نفس الحاضنة حيث المفاعلات الحيوية التروية.
  4. نقل نضح الكلىالدائرة من الحاضنة لمجلس الوزراء السلامة البيولوجية. إزالة الغطاء المسمار من رأسه مفاعل حيوي، والثقافة نضح المتوسطة من خزان مفاعل حيوي باستخدام ماصة باستور.
  5. ماصة 10 مل من ريسازورين الحل في الخزان، بالقرب سقف المسمار العمل، ونقل الدوائر نضح الكلى العودة إلى الحاضنة.
  6. بدء تشغيل المضخة في 4 مل / دقيقة والسماح كاشف ليروي عن طريق الكلى بالضبط 1 ساعة.
  7. بعد 1 ساعة، ووقف ضخ، ونقل الدوائر نضح الكلى لمجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
  8. جمع مكيفة (خفض جزئيا) حل ريسازورين، وإضافة 100 مل مستنبت إلى الخزان مفاعل حيوي. نقل نضح الدائرة إلى الحاضنة، واستئناف تدفق (4 مل / دقيقة).
  9. ماصة 100 ميكرولتر (× 3 مكررات) مشروطة ريسازورين حل، حل ريسازورين العمل، تعقيمها حل العمل، وفارغة سائل الإعلام والثقافة إلى الأسود (معتم) 96-جيدا لوحة الفحص. قراءة كثافة مضان (excitatايون: 540/35؛ الانبعاثات: 590/20) باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
  10. حساب تخفيض في المئة كنسبة من شدة مضان تطبيع من شدة مضان (FI) التي تم إنشاؤها بواسطة المتوسطة ريسازورين المؤكسد (مكتب إدارة السجلات، أو ريسازورين العمل الحل لا يتعرض للخلايا) أو انخفاض ريسازورين المتوسطة (RRM، أو تعقيمها الحل العمل):٪ الحد = 100 × {[FI (حل ريسازورين مكيفة) - FI (ORM)] / [FI (RRM) - FI (ORM)]}. لتطبيع النتائج، مضاعفة الحد٪ من خلال تعميم حجم (10 مل)، والقسمة فترة حضانة (1 ساعة).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

الكلى perfused لبالتتابع مع ​​الماء وتمييع الحلول المنظفات (1٪ تريتون X-100، 0.1٪ SDS) وفقا ل، بروتوكول decellularization الأمثل المحددة سابقا (انظر الشكل 1A، B) 7، وتصبح تدريجيا أكثر شفافية خلال فترة 26 ساعة، كما هو مبين في الشكل 2A. الناتج ديكي سقالة الكلى هي خالي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

بروتوكول decellularization وصف ينتج باستمرار ECM الكلى لا خلوي تماما أن يخدم كنموذج 3D للثقافة الخلايا البشرية الكلى القشرية أنبوبي الظهارية (على حد سواء القريبة والبعيدة المستمدة من أنبوب صغير)، بالإضافة إلى خلايا بطانة الأوعية الدموية 7،17. يخدم الأوعية الدموية الكلوية...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank the support of the Zell Family Foundation. We recognize support from the Northwestern Memorial Foundation Dixon Translational Research Grants Initiative, the American Society of Transplant Surgeon’s Faculty Development Grant, and a Research Grant for the Young Investigator from the National Kidney Foundation of Illinois. We acknowledge support from the Robert R. McCormick Foundation. This work was also supported by NIDDK K08 DK10175 to J.A.W. Imaging and histology cores used for this research is supported by the Mouse Histology and Phenotyping Laboratory, Electron Probe Instrumentation Center (EPIC), and Simpson Querrey Institute Equipment Core at Northwestern University, and a Cancer Center Support Grant (NCI CA060553). The authors would like to acknowledge the Northwestern University Microsurgery Core for rodent kidney procurements. Evaluation of renal tubular epithelia morphology following recellularization conducted in the Fluorescence Microscopy Shared Resource supported by P30 CA118100.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCOVWRM143-4L
Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2OSigma-Aldrich05030
Peracetic acid solution, purum, ~ 39% in acetic acid (RT)Sigma-Aldrich77240Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles).
200 proof ethanolVWRV1001TP
Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfacesSigma-AldrichSL2For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent.
DMEM/F12 mediaLife Technologies11320-033
Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, MediatechCorning35-010-CV
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL StreptomycinCorning30-002-CI
TrypLE Express (1X), Phenol RedLife Technologies12605-028Referred to in text as cell dissociating enzyme.
Trypan Blue Stain (0.4%)Life Technologies15250-061
Resazurin sodium saltSigma-AldrichR7017
Equipment:
Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VACCole-ParmerEW-07522-20
Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads.Cole-ParmerEW-07519-70Referred to in text as large pump cartridge.
Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head.Cole-ParmerEW-07519-06
Straight 6" specimen forceps, serratedVWR82027-438
*Kidney perfusion bioreactorWilMad Labglass*Custom designsBioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication.
Perfusion Circuit Components
24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca)BD Biosciences381412Referred to in text as 24 gauge catheter.
Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25'Cole-ParmerHV-06508-14Referred to in text as peristaltic pump tubing.
Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16" ID X 1/8" OD, 25 ft/packCole-ParmerHV-06411-62Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing.
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft.Cole-ParmerHV-96410-14Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing.
VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" ODVWR89068-484
Acro 50 Vent Filters, Pall Life SciencesVWR28143-558Referred to in text as 0.2 micron vent filter.
Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/pkCole-ParmerT-45505-11Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/pkCole-ParmerEW-45505-58
Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pkCole-ParmerEW-45502-22Referred to in text as female Luer x female Luer adapter.
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/pkCole-ParmerEW-45502-28
Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L - 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/csCareforde Healthcare10254821Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L.
Other Components
5 ml BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip.BD Biosciences309646
35 mm x 10 mm Easy Grip Culture DishBD Biosciences353001Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding.

References

  1. Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current opinion in nephrology and hypertension. 23, 399-405 (2014).
  2. Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W. Perspectives on whole-organ assembly: moving toward transplantation on demand. J Clin Invest. 122, 3817-3823 (2012).
  3. Badylak, S. F. Decellularized allogeneic and xenogeneic tissue as a bioscaffold for regenerative medicine: factors that influence the host response. Ann Biomed Eng. 42, 1517-1527 (2014).
  4. Miner, J. H. Renal basement membrane components. Kidney Int. 56, 2016-2024 (1999).
  5. Nichol, J. W., Khademhosseini, A. Modular Tissue Engineering: Engineering Biological Tissues from the Bottom Up. Soft matter. 5, 1312-1319 (2009).
  6. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
  7. Caralt, M., et al. Optimization and critical evaluation of decellularization strategies to develop renal extracellular matrix scaffolds as biological templates for organ engineering and transplantation. American Journal of Transplantation. 15, 64-75 (2015).
  8. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annu Rev Biomed Eng. 13, 27-53 (2011).
  9. Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34, 5915-5925 (2013).
  10. Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33, 7756-7764 (2012).
  11. Vishwakarma, S. K., et al. Preparation of natural three-dimensional goat kidney scaffold for the development of bioartificial organ. Indian journal of nephrology. 24, 372-375 (2014).
  12. Ross, E. A., et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded into kidney scaffolds. J Am Soc Nephrol. 20, 2338-2347 (2009).
  13. Song, J. J., et al. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat Med. 19, 646-651 (2013).
  14. Bonandrini, B., et al. Recellularization of well-preserved acellular kidney scaffold using embryonic stem cells. Tissue Eng Part A. 20, 1486-1498 (2014).
  15. Burgkart, R., et al. Decellularized kidney matrix for perfused bone engineering. Tissue Eng Part C Methods.2. 20, 553-561 (2014).
  16. Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8, 49-55 (2012).
  17. Uzarski, J. S., et al. Dual-purpose bioreactors to monitor non-invasive physical and biochemical markers of kidney and liver scaffold recellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
  18. Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European journal of biochemistry / FEBS. 267, 5421-5426 (2000).
  19. Loghman-Adham, M., Nauli, S. M., Soto, C. E., Kariuki, B., Zhou, J. Immortalized epithelial cells from human autosomal dominant polycystic kidney cysts. American journal of physiology. Renal physiology. 285, F397-F412 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Erratum


Formal Correction: Erratum: Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development
Posted by JoVE Editors on 3/03/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development.

The human RCTEC/RCTE cell stocks used here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 were originally provided by Dr. Loghman-Adham (then at St. Louis University) to co-author Dr. Wandinger-Ness (University of New Mexico) through an MTA in 2001. The SV40 immortalized human RCTEC/RCTE cells were characterized as being of distal tubule cell line as detailed in Loghman-Adham et al., 2003. On the basis of recent short tandem repeat (STR) DNA sequencing (Performed by IDEXX BioResearch) of the earliest passages of the RCTEC/RCTE cell stocks it became evident the cells were of mixed lineage. Further analyses of PCR products using QIAxcel capillary electrophoresis demonstrated the presence of a canine product. The product was sequenced and established to be of canine origin. A set of canine specific STR markers were compared to the sample and showed that the sample had a genetic profile with 92% identity to the MDCK cell line.  Later cell stocks that were used in the present publication were STR profiled and showed drift to 100% MDCK lineage. Despite being of canine origin, rather than human as was previously thought, MDCK is similarly a distal tubule epithelial cell line. For this reason, previous interpretation and conclusions drawn using these cells here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 remain sound, but for purposes of rigor, reproducibility and experimental validation by others we report on this misidentification. This information will also be reported for listing on the International Cell Line Authentication Committee (ICLAC) database (http://iclac.org).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

102 decellularization recellularization

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved