بديل بسيط لحقن المجسم لالدماغ ضربة قاضية محددة من ميرنا

Summary

MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.

Introduction

ظهرت MicroRNAs كأهداف علاجية جديدة بسبب الدور العالمي في تنظيم التعبير الجيني وأدلة مباشرة للمشاركة في المرض. ويجري بحث MiRNAs بنشاط لإمكاناتهم كأهداف المخدرات ^1،2. وعلاوة على ذلك، ترتبط التعديلات في التعبير ميرنا مع العديد من الأمراض ³ والمحاكاة من هذه التغييرات اضطراب الاصطناعي من ميرنا التعبير يمكن استخدامها لدراسة مسارات الخلوية المشاركة في مظاهر المرض. الأنسجة تسليم محددة من ميرنا المخدرات تستهدف حاليا تحديا كبيرا لتطوير الأدوية ميرنا القائمة. Antagomirs ويحاكي ميرنا وكلاء واعدة لاحداث بلبلة مستويات ميرنا ^4-6. ومع ذلك، السمات الخاصة التي تعزز خصوصيتها والفعالية يجب أن تكون دمجها في تصميم antagomirs قبل أنها يمكن أن تستخدم في الجسم الحي اضطراب ميرنا التعبير.

MicroRNAs هي ذات الصلة خاصة كأهداف في الاعصاب غير قابل للشفاء حاليا والأمراض العصبية التطورية. حاجز الدم في الدماغ يشكل قيدا لتسليم antagomirs في الدماغ. يتم استخدام الحقن المجسم على نطاق واسع في نماذج القوارض لتسليم الجزيئات في مواقع محددة في الدماغ ^7. فهو يتطلب مهارة والاستثمار المكثف في الأجهزة والوقت. حقن المجسم هي الغازية، تنطوي عملية جراحية، تسبب ما لا يقل عن قاصر الإصابة وتقتصر على التسليم المحلي. استخدام الخلايا اختراق الببتيدات مع تفضيل الخلايا العصبية التي تستهدف يمكن مواجهة هذه القيود لأنها يمكن أن يتم تسليمها عبر الطريق عبر الأوعية الدموية ولكن اختراق حاجز الدم في الدماغ. هذا الببتيد المستمدة من فيروس داء الكلب البروتين السكري (RVG)، وكان يستخدم في السابق لتسليم سيرنا ضد فيروس التهاب الدماغ الياباني في الفئران ^8. لقد وجدنا أن استخدام الببتيد لantagomir التسليم، miRNAs يمكن أن تكون فعالة ترسيتها في مخ الفأر ^9.

ontent "> إن التحدي الرئيسي الثاني للميرنا تدق إلى أسفل ينشأ من صغر حجم miRNAs وجود إيسفورمس تسلسل ارتباطا وثيقا. نحن نأخذ مثال MMU-مير 29 عائلة التي تتكون من ثلاثة إيسفورمس ترتبط ارتباطا وثيقا، مير-29A و b و c. كما المعدلة Antagomirs عموما على طول العمود الفقري لزيادة استقرارها وجعلها مقاومة للهجوم من قبل nucleases. مغلق الأحماض النووية (LNAs) توفر ميزة أخرى أنها تعزز الاستقرار الحراري وتؤدي إلى استهداف تدهور أكثر وخارجها عائق الفراغية ^10. تقديم تعديلات على طول العمود الفقري يمكن أن تكون فعالة ولكنها مكلفة. لقد رأينا في وقت سابق أن التعديلات يتجاوز العدد الأمثل قد لا تزيد من تعزيز فعالية. وبالتالي، فإن تصميم antagomir ينطوي على تعديل الأمثل للantagomir.

لمجمع antagomir غير تساهمي مع الببتيد موجه للعصب، واتهم سباعي لتمديد NONA أرجينين يستخدم. D-ارجينينوتستخدم المخلفات لأنها تمنح أعلى الاستقرار لأنها ليست عرضة للانشقاق من قبل البروتياز. سباعي إلى NONA أرجينين مساحات العمل خلية اختراق كلاء فعالة قدر، على الرغم من أنها لا تضفي نوع من الخلايا خصوصية. من خلال ربط تساهمي الببتيد RVG إلى رابط NONA أرجينين، وهو موجه للعصب، تم إنشاء خلية اختراق الببتيد. بقايا موجبة الشحنة من الببتيد تتفاعل مع الشحنة السالبة العمود الفقري الحمض النووي، لتشكيل المجمعات. هذه المجمعات يمكن استخدامها ل transfect فعال DNA أو RNA في الخلايا المستزرعة والحية في الأنسجة.

Protocol

ملاحظة: وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات بما في ذلك المواد الحيوانية جنة المؤسسي الحيوانات الأخلاقيات (هيئة الطاقة الذرية) في معهد علم الجينوم والبيولوجيا التكاملية، نيودلهي (IGIB / AEC / 10/2013). ويتم تعديل هذا البروتوكول خصيصا لاستهداف تسليم Antagomir-29 في الدماغ وضربة قاضية من مير-29.

1. استراتيجية تصميم Antagomir

1. استرداد تسلسل ميرنا ناضجة من miRBase ¹¹ (http://www.mirbase.org/).
2. استرداد متواليات من أفراد الأسرة ميرنا المتعلقة باستخدام الرابط "جين العائلة" في السجل miRBase
   (http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl؟fam=MIPF0000009).
3. عكس تكمل التسلسل: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html يوفر أداة ملائمة لعكس تسلسل المتممة.
4. بمناسبة المواقف التي يمكن تعديلها من قبل LNA باستخدام الإرشادات التالية:
   1. اختيار بقايا ثايمين وضعت 3-4 قواعد بصرف النظر عن تعديل LNA، منذ البريميدينات LNA هي أكثر استقرارا من البيورينات ^12.
   2. اختيار بقايا السيتوزين مفصولة 3-4 بقايا إذا الخطوة السابقة تنتج أقل من خمسة تعديلات.
   3. أولويات التعديلات الخمسة إلى 5 'نهاية antagomir، لأن هذا يتجنب تسلسل البذور.

2. Antagomir-نيوروبيبتيدي إعداد مجمع

ملاحظة: هذه هي الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول ويحتاج التوحيد. لتوحيد بروتوكول أي قليل النوكليوتيد fluorescently المسمى (FLO) يمكن استخدامها في مكان antagomir ^9. يجب أن يكون الببتيدات عالية النقاء (HPLC الصف، 98٪ نقاء) وترد .Sequences والمسؤول عن الببتيد وantagomir في الجدول 1.

1. قرر عدد من موليه من antagomir ليتم حقنه على أساس تهمة المولي على antagomir، سميتها والوزن من الفأرة. احسب عدد مولات الببتيد ليتم حقنه على أساس نسبة تهمة المولي من antagomir: الببتيد.
   ملاحظة: توحيد نسبة تهمة المولي من antagomir: الببتيد لسمية والتسليم الفعال في دماغ الفأر. استخدام نسب مختلفة تهمة المولي من قليل النوكليوتيد fluorescently المسمى: الببتيد لتوحيد. وجدنا أن Antagomir-29 و الرقابة سواء كانت سامة في 4microgram / غرام من وزن الجسم من الماوس. واستخدمت Antagomir-29 والسيطرة على 2microgram / غرام من وزن الجسم، ولكن من المرجح أن تختلف عن كل الرنا الميكروي هذا التركيز الفعال.
2. تمييع الببتيد وantagomir في أنابيب microfuge منفصلة عن الحلول الأسهم العقيمة مع 10٪ D-الجلوكوز إلى التركيز النهائي على النحو المرغوب فيه المحسوبة في الخطوة 1.
3. الحفاظ على microfuge أنبوب مع حل الببتيد في دوامة في معتدلة السرعة vortexing ل.
4. إضافة 1/3 ^{الثالثة} من لحل ntagomir إلى أنبوب حل الببتيد، ببطء، وانخفاض الحكمة، في حين يتم مزجه جيدا في خلاط دوامة.
5. مواصلة خلط الحلول على دوامة لمدة 1 دقيقة المقبل ومن ثم السماح للخليط الوقوف لمدة 1 دقيقة.
6. كرر الخطوة 4 و 5 مرتين أكثر لمزج ما تبقى من antagomir الحل مع حل الببتيد في نفس microfuge أنبوب. إضافة بطيئة أمر بالغ الأهمية لتشكيل المجمعات أحادية تفريق تكون فعالة في ترنسفكأيشن. السريعة بالإضافة إلى ذلك يمكن أن يؤدي إلى تجميع المجمعات وهطول الأمطار بهم.
7. احتضان المجمع لمدة 30 دقيقة في RT دون vortexing ل. خلال هذا الوقت من الحضانة، والتأقلم الفئران إلى المختبر حيث سيتم إجراء الحقن.

3. الذيل الوريد حقن مجمع Antagomir-نيوروبيبتيدي

1. لكبح جماح الحيوان، ضع الماوس في رادع أو decapicone من الحجم المناسب.
2. تنظيف السطح من الذيل باستخدام مسحة القطن العلاقات العامةفي ماء دافئ (حوالي 40 درجة مئوية) غارقة ه. وهذا تشجيع توسع الأوعية وزيادة وضوح الوريد.
3. الاقتراب من الذيل مع حجم صغير (0،5-1،0 سم مكعب) حقنة الانسولين في زاوية 15-20 درجة. يجب الحرص على عدم إدخال أي الهواء في حقنة. تبدأ في الجزء الأعلى من الذيل. حقن المجمع. إزالة الإبرة وتطبيق مسحة مطهر مباشرة إلى موقع الحقن (حوالي 5-10 ثانية) لوقف أي نزيف.
4. استبدال الماوس في قفص التهوية بشكل فردي في مجموعة من 3-5، مع كوز الذره والمناديل الورقية كما تخصيب اليورانيوم. لا تبقي الفئران uninjected وحقن في نفس القفص.

4. السلوكي فحوصات

ملاحظة: الحفاظ على الفاصل الزمني من 3-4 ساعة في المقايسات بين الحقن والسلوكية للسماح للانتعاش بعد الحقن. جلب الماوس إلى غرفة هادئة. لا تخل هذه الحيوانات خلال هذه الفترة من التأقلم.

1. التأقلم الماوس إلىغرفة جديدة لمدة 30 دقيقة ثم بدء فحوصات السلوكية التالية. الحفاظ على فجوة من 10 دقيقة بين كل فحص السلوكي.
2. الشبك Hindlimb:
   ملاحظة: هذا الاختبار يبين ضعف الحركية وإعاقة للجهاز العصبي.
   1. رفع الماوس بلطف من خلال عقد بالقرب من قاعدة الذيل في الخلفية واضحة.
   2. التحقق من موقف hindlimb لمدة 10-15 ثانية. النوع البري splays الماوس hindlimbs بعيدا عن البطن، في حين أن الماوس رنحي يميل إلى التراجع واحد أو كلا hindlimbs نحو البطن أكثر من 50٪ من وقت علقت ^13.
   3. عودة الماوس إلى القفص
3. الحافة الاختبار:
   1. رفع الماوس برفق عن طريق الضغط على الذيل ويبقيه على الحافة من القفص.
   2. مراقبة الماوس على وجه التحديد في ركن من أركان القفص. النوع البري الماوس يمكن أن تمر زوايا بسهولة دون خوف وفقدان التوازن. الماوس رنحي يفقد توازنه، تجميد أو يهز في حين أن المشي على طول الحافة القفص وعند الزوايا.
فحص الفأر الطباعة القدم:
ملاحظة: للحصول على هذا الاختبار حفاظ على ورقة ماصة على استعداد، على أرضية مدرج الضيق (~ 70 سم طويلة، ~ على نطاق 5 سم، وبها ~ الجدران 5 سم عالية).
1. عقد الماوس بلطف بواسطة يد واحدة وتطبيق حبر على أطرافه الخلفية بواسطة فرشاة.
2. وضع ورقة ماصة على أرضية مدرج ضيق.
3. السماح الماوس على المشي أو الجري على ورقة ماصة في خط مستقيم في المدرج واحدة من نهاية إلى أخرى.
4. تكرار هذه العملية مرتين أخريين مع كل فأر باستخدام ورقة ماصة جديدة.
5. قياس المسافة بين خطوتين متتاليتين في حركة إلى الأمام. لا تشمل آثار أقدام القليلة الأولى والأخيرة حيث الحيوان هو مجرد بدء والانتهاء من شوطه، على التوالي.

النتائج

باستخدام الإجراء المقدمة هنا والمجمعات من قليل النوكليوتيد 50microgram fluorescently المسمى (FLO) و ~ 850microgram RVG الببتيد من 1:15 المولي نسبة المسؤول: تم إعداد (FLO الببتيد) وحقنه مرة واحدة فقط خلال الوريد الذيل. وقد استخدم المجمع من غير موجه للعصب مصفوفة فيروس داء الكلب (RVM) الببتيد وFLO كع...

Discussion

Here we demonstrate a widely accessible methodology to study the effects of miRNA modulation. Currently, most attempts at in vivo characterization of miRNA functions involve the creation of knockout mice or a transgenic that expresses a miRNA sponge. Most miRNAs, even the cell type specific ones are expressed in more than one organ. For instance, miRNAs initially thought to be specific to the hematopoietic system are also expressed in the brain, due to the presence of microglia. Thus even a cell type specifi...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vortex
Restrainer or Decapicone
Narrow runway			~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls.
Reagents
Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO)	GE Healthcare Dharmacon INC	D0016300120
10% sterile D-glucose
Antagomir-29	Exiqon	custom synthesis
Antagomir-control	Exiqon	custom synthesis
Neuropeptide RVG	G.L.Biochem (Shanghai) Ltd.	custom synthesis	>98% purity
Neuropeptide RVM	G.L.Biochem (Shanghai) Ltd.	custom synthesis	>98% purity
Other
Cotton
Warm water
Insulin syringes
Absorbent sheets
Ink
Brush
Antiseptic