في وقت واحد ثنائي الفوتون<em&gt; في فيفو</em&gt; تصوير متشابك المدخلات والأهداف بعد المشبكي في اللحاء ماوس خلف الطحال

Summary

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Abstract

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.

The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.

The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAV^mCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex.

This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Introduction

ثورة ثنائي الفوتون المجهري مراقبة نشاط الدماغ في العيش والتصرف الحيوانات. منذ إطلاقها في عام 1990 وسرعان ما اكتسب شعبية ويتم تنفيذه الآن واحدة من الطرق الأكثر إثارة للاهتمام ومبتكرة من أجل النظر في جوانب عديدة من نشاط الدماغ في الجسم الحي ^1،2. وتشمل هذه التطبيقات قياس تدفق الدم، وتنشيط الخلايا العصبية (على سبيل المثال، وذلك باستخدام مؤشرات مستوى الكالسيوم أو الجينات في وقت مبكر فورية التعبير) ومورفولوجيا الخلايا العصبية. عدد متزايد من المختبرات استخدام المجهر ثنائي الفوتون، وتنفيذ تقنية في جميع أنحاء العالم العلمي كمعيار جديد للتصوير في الجسم الحي الدماغ.

ينطوي على نهج موحد زرع نافذة في الجمجمة (حفرة مستديرة في الجمجمة مغطاة غطاء زجاجي) على برميل أو القشرة البصرية في الدماغ الماوس ^3. المقبل، اعتمادا على بروتوكول التجريبية، ومذكرة التفاهمحد ذاته يخضع لسلسلة من التصور والدورات التدريبية السلوكية، مما يسمح لرصد التغيرات في نشاط الدماغ ومورفولوجيا الخلايا العصبية على مر الزمن ^4،5. في كلتا الحالتين يؤثر على حج القحف فقط العظم الجداري، دون عبور الغرز. ويعتقد إلى حد كبير أن العيب الرئيسي لهذه التقنية هو التطبيق المحدود لاللحاء يمكن الوصول إليها بسهولة مثل برميل أو القشرة البصرية. زرع نافذة في الجمجمة على مناطق أخرى يطرح الكثير من الصعوبات، بسبب النزيف و / أو إعاقة المكاني.

في هذه الورقة نقترح زرع نافذة في الجمجمة فوق قشرة خلف الطحال (RSC)، ومنطقة أخرى ممكنة من الفائدة لمدة الفوتون في الجسم الحي المجهري ^6. RSC هو عنصر هام من الدائرة الدماغ المسؤولة عن تكوين الذاكرة المكانية. تشريحيا، RSC هو جزء من شبكة الخلايا العصبية التي تربط القشرية، الحصين، والمناطق مهادي ^7. أنهشارك بقوة في مجموعة من السلوكيات، مثل التعلم المكاني والانقراض وكذلك الملاحة الفضائية ^6.

من أجل تصور التغيرات المورفولوجية من الخلايا العصبية التي نستخدمها خط الماوس المعدلة وراثيا التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) تحت المروج thy1. في هذه الفئران، ويتم التعبير عن GFP في ما يقرب من 10٪ من الخلايا العصبية في الدماغ مما يسمح لتصور واضح للمحاور القشرية والتشعبات باستخدام اثنين من الفوتون المجهري ^8. آخر الابتكارات التي نقترحها هي حقن المؤتلف الغدة المرتبطة المصلي فيروس 2/1 (rAAV2 / 1) الترميز بروتين أحمر فلوري (mCherry) تحت الخلايا العصبية المحددة كمكي المروج ⁹ في هياكل العميقة من الدماغ إسقاط لRSC ، مثل الحصين. التعبير عن rAAV2 / 1 ^mCherry في حصين الماوس Thy1-GFP يسمح لتصور في وقت واحد من العناصر قبل وبعد المشبكي من hippocampo-corticaل نقاط الاشتباك العصبي ^10. التعبير مدفوعة rAAV من mCherry يتطلب 2-3 أسابيع للبروتين لتصل إلى مستوى كاف في محطات محور عصبي. هذه الفترة هي متسقة مع الوقت المعتاد المطلوبة للانتعاش من حج القحف.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وقد وافق جميع الإجراءات التجريبية المبينة أدناه من قبل لجنة الأخلاقية المحلية في معهد نينكي البيولوجيا التجريبية، أكاديمية العلوم البولندية.

ملاحظة: يتم تسارع بعض المشاهد في الفيديو المرتبطة. يشار عامل السرعة في هذه المشاهد.

1. جراحة التحضير

1. تعقيم جميع الأدوات والعبوات الزجاجية للسوائل ومسحات القطن في الأوتوكلاف. استخدام قفازات يمكن الاستغناء عنها. تنظيف طاولة الجراحة، والإطار التجسيمي وجميع المناطق المحيطة بها مع 70٪ من الإيثانول. استخدام وسادة الجراحية المعقمة لخلق مساحة معقمة لجميع المعدات المعقمة. قطع جلفوم إلى قطع صغيرة وينقع في محلول ملحي.
   ملاحظة: وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، الإيثانول يست المعقمات ولا مطهر رفيع المستوى. وينبغي أن تستخدم فقط كعامل تنظيف / defatting على الأسطح تعقيم سابقا.
2. وضع الحيوان في الالبريد غرفة تحريض وتعيين مستوى الأيزوفلورين إلى 5٪ وتدفق الأوكسجين إلى 2 لتر / دقيقة. هذا الإجراء ينبغي أن يستغرق حوالي 3 دقائق.
3. خذ الحيوان من غرفة تحريض. استخدام الذيل أو أخمص القدمين القرصات من أجل التأكد من أن الحيوان مخدرا تماما.
4. باستخدام الانتهازي الدقيق يحلق الشعر من مؤخرة الرأس (بين الأذنين) ما يصل الى العينين.
5. وضع الحيوان في إطار التجسيمي وتحقيق الاستقرار في الرأس بقضبان الأذن.
6. تحديد مستويات التخدير إلى 1.5-2٪ الأيزوفلورين و 0.3 لتر / دقيقة الأكسجين.
7. تطبيق مرهم العين.
8. حقن تحت الجلد الحيواني مع Tolfedine (4 ملغ / كلغ)، Butomidor (2 ملغ / كلغ) وBaytril (5 ملغ / كلغ) لمنع التهاب والألم والعدوى، على التوالي.
9. حقن في العضل الحيوان مع ديكساميثازون (0.2 ملغ / كلغ) لمنع تورم الدماغ.
   ملاحظة: من الممكن لحقن ديكساميثازون تحت الجلد أو داخل الغشاء البريتونى لمنع تلف العضلات.
10. تنظيف الجلد باستخدام الصورةمسحات القطن terile مع Betadine تليها 70٪ من الإيثانول.
11. تغيير القفازات وترشها مع 70٪ من الإيثانول.
    ملاحظة: أثناء استخدام القفازات القابل للتصرف لا تلمس المجال المعقم. لمس الحيوان فقط مع نصائح من الأدوات الجراحية المعقمة ومسحات معقمة.

جراحة 2. الجمجمة النافذة

1. رفع الجلد مع ملقط واستخدام المقص الصغير شق الجلد أفقيا على طول قاعدة من الرأس ومن ثم بشكل غير مباشر إلى النقطة الأمامية بين العينين. إزالة رفرف الجلد.
2. تطبيق يدوكائين مرهم مع مسحة معقمة على السمحاق لمنع النزيف والألم.
3. استخدام قطعة قطن معقمة أو مشرط لإزالة السمحاق. تجفيف الجمجمة مع مسحات معقمة.
4. باستخدام إبرة معقمة تطبيق كثيفة الغراء cyanoacrylate على حواف الجلد لشل حركة لهم، ومنع من الاتصال مع الاسمنت الأسنان. انتظر الغراء لتجف.
5. وضع العقيمة ساترة 3 مم أنحاء رانه الجمجمة الأمامية إلى الدرز اللامي. توسيط ساترة في RSC تنسق: AP، bregma -2.8. ML، bregma 0. كافة حواف ساترة من خدش سطح الجمجمة بإبرة معقمة. وضع ساترة مرة أخرى في حاوية معقمة مع 70٪ من الإيثانول.
6. استخدام حفر الأسنان عالية السرعة مع لدغ قطرها صغير لوضع الخطوط العريضة لدائرة قطرها 3 مم. تنظيف موقع الحفر من الغبار العظام مع ملحي معقم مسحات تراجع. استخدام جلفوم ومسحات لوقف النزيف في بعض الأحيان وتنظيف العظام.
7. بين الحفر فحص سماكة العظام مع ملقط غرامة عن طريق لمس بلطف دائرة العظام وفحص التنقل به. نضع في اعتبارنا أن العظام هي أكثر سمكا في منطقة خياطة و. وقف الحفر عند دائرة العظام هي النقالة وتركت فقط حتى، طبقة رقيقة من العظم على محيط. تنظيف الميدان العملي من كل الغبار العظام المتبقية مع المياه المالحة انخفض مسحات.
8. إسقاط ملحي معقم على منطقة الحفر، والتي تغطي سي آي آر حفرشركة كلي. بعناية نقب دائرة العظام مع ملقط غرامة ثم بلطف ولكن بحزم إزالة العظام من خلال رفع لأعلى. يجب الحرص على عدم تحريف دائرة العظام في حين رفع لمنع الضرر المحتمل لالجافية.
9. بلطف تطبيق جلفوم غارقة في المياه المالحة عقيمة على الجافية للمساعدة في وقف النزيف. انتظر حتى يتم إيقاف جميع النزيف تماما. إزالة بعناية جلفوم لا تعكر صفو عملية التخثر.
   ملاحظة: المنطقة خياطة هي أوعية دموية للغاية، وبالتالي فإن النزيف في هذه المرحلة قد يثبت أن تكون عميقة. لا بد من الانتظار لوقت كاف للنزيف لوقف تماما. ومن المفيد للحفاظ على جلفوم غارقة في المياه المالحة المبردة عن طريق وضعه على الجليد.

3. الفيروسات حقن

1. إرفاق مضخة التسريب إلى برج المجسم وربط وحدة تحكم.
2. ادخال الإبرة 35G في حقنة. تدفق الحقنة 10 مرات مع الإيثانول لتعقيمها و 10 مرات مع ملحي معقم لإزالة آثار هthanol. إزالة فقاعات الهواء من الحقنة. إدراج الحقنة في مضخة.
   ملاحظة: النظر في استخدام المطهرات الأخرى.
3. ذوبان الجليد جرعة واحدة من rAAV2 / 1 إعداد ^mCherry (ينصح 10 ¹² PFU) والحفاظ على الجليد. ملء المحاقن مع الحل فيروس.
4. توسيط إبرة على bregma ثم تضاف برفق في قرن آمون باستخدام الإحداثيات التالية: AP -2، ML +/- 1.0، DV -1. وسيكون مقر هذه الإحداثيات بالقرب من حافة حج القحف. الانتظار لمدة 5 دقائق للأنسجة لتحقيق الاستقرار.
5. ضخ 0.7 ميكرولتر من الحل ^mCherry rAAV2 / 1 بمعدل 50 نيكولا لانغ / دقيقة. انتظر 10 دقيقة للفيروس إلى كثف تماما. إزالة بلطف الإبرة. وصمة عار مع جلفوم في حالة حدوث نزيف. كرر مع الموقع المقابل.

4. الجمجمة النافذة زرع

1. وضع العقيمة، ساترة المجففة على رأس الجافية في إطار دائرة حفر. عقد ساترة مع forcالعائد على السهم إلى تتسطح بلطف الجافية وجلب ساترة 'حواف أقرب إلى سطح الجمجمة.
   ملاحظة: من الممكن أن ساترة يعطل جلطة ونزيف السير الذاتية. إذا كان هذا هو الحال، ورفع ساترة، وضعه في الكحول وجافة والعودة إلى الخطوة 2.9.
2. باستخدام إبرة معقمة تطبيق الغراء cyanoacrylate كثيفة على حواف ساترة لضمها إلى الجمجمة. انتظر الغراء لتجف.
3. وضع شريط التثبيت (الجوز M2 أو تصميم حسب الطلب) في الجزء الأمامي من الجمجمة. تطبيق الغراء cyanoacrylate على حواف العارضة. انتظر الغراء لتجف.
   1. وضع شريط التثبيت في المنصب الذي سيمكن وضع أفقي من نافذة في الجمجمة أثناء التصوير الدورة. وضعه بعيدة قدر الإمكان من النافذة. إذا ما وضعت قريبة جدا من النافذة، ونقابة المحامين، والمسمار الذي يربط مع صاحب العرف قد تشكل عائقا لتحقيق الهدف أثناء عملية التصوير.
إعداد الاكريليك الأسنان وتطبيقه على سطح الجمجمة حول الزجاج. ومن المفيد لتشكيل شكل يشبه فوهة البركان حول النافذة. فإنه سيتم إنشاء تجويف للمياه تطبيقها في وقت لاحق للتصوير مع الهدف المياه.
4. إنشاء سقف مع الاكريليك الأسنان التي تغطي باقي المساحة التشغيلية، وحواف الجلد، شريط التثبيت، وتعزيز الحفرة حول نافذة في الجمجمة. انتظر الاسمنت الأسنان لتتصلب.
5. إزالة الحيوان من الإطار التجسيمي ووضعها في غرفة الإنعاش.
6. الانتظار للحيوان للتعافي من الجراحة مع مراعاة الوظائف الفسيولوجية.
7. تطبيق تسكين بعد العملية (كاربروفين، 10 ملغ / كلغ) والعلاج المضادات الحيوية (baytril، 5 ملغ / كلغ) لمدة 48 ساعة.

5. التصوير

1. بدء تي: ليزر الياقوت، قوة تصل المجهر. وقد تم تجهيز النظام المستخدم في هذه التجربة مع ليزر ثنائي الفوتون، نظام OPO والمزدوج PMT GaAsP.
2. وضع الحيوان في inducغرفة نشوئها وإحداث التخدير.
3. إزالة الحيوان من غرفة تحريض ومكان في قناع التخدير الغاز تحت المجهر. انخفاض تدفق الأكسجين إلى 0.3 لتر / دقيقة وتركيز الأيزوفلورين إلى 1.5-2٪.
4. إصلاح الحيوان إلى الإطار المجهر مخصصة مع المسمار M2 (أو نظام مخصص آخر). مستوى النافذة في الجمجمة.
   ملاحظة: من الممكن استخدام نظام رئيس تثبيت الصانع المجهر، على الرغم من أن إطار مخصص محدد يعطي نتائج أفضل (تحسين الاستقرار الرأس، وتحديد المواقع المستمر في جلسات متعددة خلال تجربة المزمنة).
5. باستخدام إعدادات المجهر widefield وانخفاض مركز موضوعي التكبير وجهة النظر على أحد جانبي القشرة خلف الطحال والتركيز على سطح ساترة.
6. تطبيق قطرة من الماء في البئر الاكريليك تشبه فوهة البركان. التحول إلى هدف غمر المياه لمسافات طويلة. نقل الهدف نحو النافذة الجمجمة حتى يخدع الغضروف المفصلي المياهnects العينة والهدف.
7. التبديل إلى إعدادات ثنائي الفوتون والبدء في مسح رأس العينة إلى أسفل باستخدام أدنى التكبير. سوف عبور جافية تكون واضحة كما مرأى ومسمع من ارتفاع في إشارة غير محددة.
8. ضبط إعدادات اكتساب المجهر في كل قنوات (GFP وmCherry) وفقا لقوة الإشارة من الخلايا فلوري من أجل تغطية النطاق الديناميكي بأكمله.
9. بعد العثور على الخلايا العصبية مناسبة (مع الشجرة شجيري فصلها عن الخلايا الأخرى) إجراء المسح الأولي فقط باستخدام filterset GFP مع أدنى التكبير وض مسافة 5 ميكرون.
10. الحصول على إسقاط الحد الأقصى لكومة الممسوحة ضوئيا وطباعته الشروح (باستخدام الألوان المقلوب).
11. ضبط التكبير إلى قيمة من شأنها أن تسمح لصورة تفاصيل الشكلية المطلوبة. صورة الشجرة شجيري كامل في قنوات GFP وmCherry باستخدام الحد الأقصى إسقاط كدليل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

التعبير عن GFP في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية في مراسل الماوس Thy1-GFP يسمح في التصوير المجراة من التشعبات القشرية والتوقعات محور عصبي المحلية في RSC. ويبين الشكل 1A أقصى الإسقاط من كومة من الصور مع العديد من التشعبات GFP إيجابية وا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذه الورقة نقدم بروتوكول لفي وقت واحد ثنائي الفوتون في التصوير المجراة من مدخلات متشابك والأهداف بعد المشبكي في RSC من خلال نافذة في الجمجمة. تتكون إجراء زرع عدة خطوات رئيسية. أولا، هذا الحيوان هو تخدير عميق وثابت في إطار المجسم، ومن ثم ضعفت الجمجمة على RSC ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drug
Isoflurane	Baxter	AErrane 8DG9623	5-2% pre-operative
Isoflurane	Baxter	AErrane 8DG9623	1.5-2% during surgery
Dexametasone	Scan Vet	Dexasone 2mg/ml	0.2 mg/kg intramuscular
Baytril	Bayer	2.50%	5 mg/kg subcutaneously
Tolfedine	Vetoquinol	4%	4 mg/kg subcutaneously
Butomidor	Richter Pharma	10 mg/ml	2 mg/kg subcutaneously
Carprofen	KRKA-Polska	Rycarfa 50mg/ml	10 mg/kg subcutaneously
Lidocaine	Jelfa	Lignocainum	topically
Lidocaine	Jelfa	20 mg/g	topically
Surgery
Gelfoam	Ethicon	Spongostan dental; REF MS0005
Eye ointment	Dedra	Lubrithal	topically
CA glue	Pelikan Daniel	20G Huste
Dental acrylic	SpofaDental	Duracryl Plus
Stereotaxic frame	Stoelting	51500D
Tool
Coverglass	Harvard Apparatus	HSE-64-0720	3 mm diameter
Dental drill	Sigmed	Keystone KVet
Fixation bar	Custom made	N/A	M2 or M3 screw nuts could be used
Forceps	Renex	PN-7B-SA
Micro scissors	Falcon	BM.183.180
Dissection microscope	KOZO	XTL6445T
Imaging
Holder frame	Custom made	N/A
Two-photon microscope	Zeiss	Upright Axio Examiner Z1	Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors.
Reagent
Virus	gift from K. Deisseroth		Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter