Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وصفنا هنا مقايسة وذلك بربط تحديد الأدينين DNA ناقلة الميثيل (DamID) الى ارتفاع التسلسل الإنتاجية (DamID وما يليها). يوفر هذا الأسلوب تحسين دقة أعلى وأوسع نطاق الدينامية، ويسمح تحليل البيانات DamID وما يليها بالاشتراك مع غيرها من البيانات التسلسل إنتاجية عالية مثل رقاقة وما يليها، RNA وما يليها، الخ

Abstract

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

Introduction

DNA تحديد الأدينين ناقلة الميثيل (DamID) 1،2 هو وسيلة للكشف عن التفاعلات DNA البروتين في الجسم الحي وغير نهج بديل للمناعي لونين (رقاقة) 3. ويستخدم كمية قليلة نسبيا من الخلايا و لا يتطلب الكيميائية عبر ربط البروتين مع الحمض النووي أو الأجسام المضادة محددة للغاية. هذا الأخير هو مفيدة بشكل خاص عندما فضفاضة أو غير مباشر ويرتبط البروتين الهدف مع DNA. وقد استخدم DamID بنجاح لرسم خريطة للمواقع الربط من مجموعة متنوعة من البروتينات بما في ذلك البروتينات المغلف النووي 10/04، لونين المرتبطة البروتينات 11-13، لونين تعديل الانزيمات 14، عوامل النسخ وشارك في العوامل 15-18 والأجهزة رني 19. طريقة قابلة للتطبيق في الكائنات متعددة بما في ذلك S. الخباز 13، S. pombe 7، C. ايليجانس 9،17، D. البطن 5،11،18،20، A. thaliana 21،22 فضلا عن الماوس والخلايا البشرية خطوط 6،8،10،23،24.

واستند تطوير فحص DamID على كشف محدد من شظايا الحمض النووي ميثليته الأدنين في الخلايا حقيقية النواة التي تفتقر الأدينين الذاتية مثيلة 2. بروتين الانصهار أعرب، التي تتكون من بروتين ملزمة DNA من الفائدة وE. القولونية DNA الأدينين ناقلة الميثيل (السد)، ويمكن ميثيل قاعدة الأدينين في تسلسل GATC التي هي في القرب المكاني (الأهم في حدود 1 كيلو بايت وتصل إلى ما يقرب من 5 كيلو بايت) إلى مواقع الربط من البروتين في الجينوم 2. شظايا الحمض النووي تعديل يمكن أن تتضخم على وجه التحديد وتهجين لالمجهرية للكشف عن مواقع الربط الجينومية من البروتين من الفائدة 1،25،26. وهذه الطريقة DamID الأصلي محدودة بسبب توافر المجهرية وكثافة تحقيقات محددة سلفا. لذا قمنا متكاملة إنتاجية عالية التسلسل فيلDamID 10 وعينت الأسلوب كما DamID وما يليها. عدد كبير من باختصار يقرأ ولدت من DamID وما يليها تمكن التعريب الدقيق للتفاعلات-DNA البروتين على نطاق الجينوم. وجدنا أن DamID وما يليها توفير دقة أعلى ومجموعة ديناميكية أوسع من DamID من قبل ميكروأري لدراسة الجينوم النووي الصفيحة (NL) جمعيات (10). وتسمح هذه الطريقة تحسن التحقيق الجمعيات NL داخل هياكل الجين 10 ويسهل مقارنات مع غيرها من البيانات التسلسل إنتاجية عالية، مثل رقاقة وما يليها وRNA وما يليها.

بروتوكول DamID تسلسل وصفها هنا وضعت في البداية لرسم خرائط الجينوم NL الجمعيات 10. ولدت لنا بروتين الانصهار بواسطة تشغيل ربط الماوس أو لامين البشري B1 إلى E. القولونية DNA الأدينين ناقلة الميثيل واختبار البروتوكول في 3T3 الخلايا الليفية الماوس الجنينية، C2C12 الماوس myoblasts 10 و IMR90 الليفية رئة الجنين الإنسان (بيانات غير منشورة). في هذا البروتوكول، ونحن نبدأ مع جonstructing النواقل والتعبير عن البروتينات الانصهار سد-المربوطة عن طريق العدوى lentiviral في خلايا الثدييات 24. المقبل، وصفنا بروتوكولات مفصلة لتضخيم شظايا الحمض النووي ميثليته الأدينين وإعداد مكتبات التسلسل الذي ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق في الكائنات الحية الأخرى.

Protocol

1. جيل والتعبير عن البروتينات الانصهار والسد الحرة البروتينات

  1. البروتين استنساخ المصالح في ناقلات DamID.
    1. تضخيم [كدنا من البروتين ذات الاهتمام (POI) باستخدام عالية الدقة DNA بوليميريز المطلوب والاشعال المناسبة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تجريبيا تحديد شروط التضخيم المثلى لضمان التضخيم السليم للتدرج.
    2. تشغيل agarose هلام وتنقية تضخيم [كدنا من POI من قبل مجموعة استخراج الهلام وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    3. استنساخ [كدنا من POI في ناقلات pDONR201 باستخدام BP Clonase الثاني وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    4. استنساخ [كدنا من POI من ناقلات المانحة في ناقلات جهة pLGW-RFC1-V5-EcoDam أو pLGW-EcoDam-V5-RFC1 جهة ناقلات 27 باستخدام LR Clonase الثاني وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة، اعتمادا على الاتجاه المطلوب من الصمامات POI إلى N-محطة أو عشرالبريد C-محطة من E. القولونية DNA الأدينين ناقلة الميثيل (EcoDam) 27.
    5. التحقق من قبل تسلسل أن كدنا] المستنسخة لديها التسلسل الصحيح والنماذج في إطار الاندماج في EcoDam.
  2. توليد الأسهم lentiviral.
    1. توليد الأسهم lentiviral معربا عن سد-V5-POI وV5-السد (من ناقلات pLGW-V5-EcoDam 27) باستخدام نظم التعبير lentiviral. استخدم الإجراء ترنسفكأيشن إلى الأمام وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      1. استخدام الخلايا 293T وlipofection لتوليد الأسهم lentiviral وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة لترنسفكأيشن.
      2. تتضمن الخطوة مرشح 0.45 ميكرومتر PVDF.
  3. تصيب الخلايا مع الفيروسة البطيئة.
    1. قبل يوم واحد العدوى (يوم 0)، تمر الخلايا الملتصقة مثقف في وسائل الإعلام نمو مناسب لهذا النوع من الخلايا إلى 6 جيدا نسيج لوحة الثقافة باستخدام وسائط النمو نفسه من دون مضادات حيوية لتحقيق 50٪ التقاء في اليوم من العدوى. خلايا مكان في الحاضنة 37 درجة مئوية.
    2. في يوم من العدوى (يوم 1)، وإزالة 2 cryovials كل من سد-V5-POI وV5-سد supernatants lentiviral من -80 ° C الفريزر والمكان في 37 ° C حمام الماء لذوبان الجليد.
      1. إزالة وسائط النمو من خلايا واستبدالها مع 0.5 مل من وسائط النمو الطازجة بدون المضادات الحيوية.
      2. إضافة 1 مل من الفيروسة البطيئة إذابة إلى كل بئر (2 الآبار مع V5 السدود والآبار 2 مع سد-V5-POI). إضافة 1 مل من وسائط النمو دون المضادات الحيوية إلى 2 المتبقية آبار هذا سيكون بمثابة سيطرة سلبية. يهز بلطف لوحة 6 جيدا لخلط ووضع مرة أخرى في 37 ° C حاضنة O / N.
    3. بعد يوم من العدوى (يوم 2)، وإزالة تعليق الفيروسية من الخلايا واستبدالها مع 2 مل وسائط النمو دون المضادات الحيوية. خلايا المكان مرة أخرى في C الحاضنة 37 درجة لمدة 48 ساعة.
  4. عزل gDNA.
    1. وسائل الإعلام نضح من كل بئر وديخلايا تاش باستخدام 250 ميكرولتر 0.05٪ التربسين-EDTA. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
    2. غسل الخلايا قبالة اللوحة مع 1 مل وسائط النمو والخلايا ماصة من كل بئر في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
    3. غسل الخلايا مكعبات مع 500 ميكرولتر PBS وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 2 دقيقة في RT.
    4. الخلايا resuspend مكعبات في 200 ميكرولتر PBS.
    5. عزل gDNA من قبل مجموعة الدم والأنسجة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل gDNA في 200 العازلة ميكرولتر AE وتحديد تركيز من خلال قياس OD 260 باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
      ملاحظة: gDNA من الخلايا المصابة غير المصابة أو وهمية يمكن أن تكون معزولة عن ضوابط السلبية. يعجل gDNA لتركيزات أعلى للتخزين على المدى الطويل.
      1. إضافة 3 مجلدات من الإيثانول بنسبة 100٪ و 0.1 حجم 3 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.5)، وتخلط بواسطة قلب أنابيب 4-6 مرات.
      2. مخزن في -20 درجة CO / N.
      3. الطرد المركزي في 16000 سز لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
      4. إزالة طاف بعناية. غسل الكريات مع 70٪ (حجم / حجم) الإيثانول وأجهزة الطرد المركزي في 16000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      5. إزالة بعناية الايثانول والسماح للهواء الجاف الكريات لمدة 3 دقائق على RT.
      6. حل gDNA في T 10 E 0.1 (7.5 درجة الحموضة) إلى ما يقرب من 1 ميكروغرام / ميكرولتر. تجمع gDNA من كل عينة تجريبية أو سيطرة سلبية وقياس تركيز. تخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية.

2. أسهب الأدينين ميثليته-شظايا الحمض النووي

  1. ملخص gDNA مع DpnI الذي يمر فقط GATCs-ميثليته الأدينين.
    1. إعداد رد فعل على الجليد مع 2.5 ميكروغرام gDNA، 1 ميكرولتر 10X العازلة، 0.5 ميكرولتر DpnI (20 U / ميكرولتر) وملء مع H 2 O إلى وحدة تخزين ما مجموعه 10 ميكرولتر. لكل عينة gDNA، وإعداد ثلاثة ردود الفعل - واحدة من دون DpnI ("لا DpnI"، استبدل DpnI مع 0.5 ميكرولتر H 2 O) واثنين ثإيث DpnI ("مع DpnI").
    2. ملخص O / N عند 37 درجة مئوية وتعطيل DpnI في 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  2. Ligate محولات DamID.
    1. إعداد محولات DamID.
      1. resuspend كل من الاثنين DamID محول oligos 24 في H 2 O إلى تركيز النهائي من 100 ميكرومتر.
      2. الجمع بين كميات متساوية من اثنين DamID محول oligos، ومزيج وضع في أنبوب مغلق بإحكام. ختم أنبوب مع parafilm، والجلوس في رفوف وضعها في كوب مملوء بالماء عند 90 ° C. الحفاظ على مستوى الماء أقل من الحد الأقصى للأنبوب (لتجنب الحصول على الماء في أنبوب) ولكن فوق سطح مزيج بنسبة ضئيلة.
      3. دع الماء البارد لRT حتى يصلب محولات ببطء.
      4. قسامة محولات صلب (50 ميكرومتر) وتخزينها في -20 ° C.
    2. إعداد رد فعل على الجليد. في كل أنبوب من 2.1.2، إضافة 6.2 ميكرولتر H 2 O، 2 ميكرولتر 10X العازلة ربط، 0.8 ميكرولتر 50 ميكرومتر DamID الإعلانaptors (إذابة على الجليد) و 1 ميكرولتر T4 DNA يغاز (5 U / ميكرولتر). الحجم الكلي هو 20 ميكرولتر. في واحد من اثنين "مع DpnI" الأنابيب، استبدال يغاز مع 1 ميكرولتر H 2 O ("لا يغاز") لاحظ أن كل عينة gDNA اثنين ضوابط السلبية - "لا DpnI" و "لا يغاز".
    3. Ligate O / N في 16 ° C ووقف نشاط يغاز عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. ملخص DNA مع DpnII لتدمير شظايا التي تحتوي على GATCs unmethylated.
    1. إعداد رد فعل على الجليد. في كل أنبوب من 2.2.3، إضافة 24 ميكرولتر H 2 O و 5 ميكرولتر 10X DpnII العازلة و1 ميكرولتر DpnII (10 U / ميكرولتر). الحجم الكلي هو 50 ميكرولتر.
    2. ملخص عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعة وتعطيل DpnII عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  4. تضخيم شظايا الحمض النووي ميثليته الأدينين.
    1. إعداد رد فعل على الجليد مع 5 ميكرولتر DpnII الهضم من 2.3.2، 5 μل 10X العازلة PCR، 12.5 ميكرولتر 5 ميكرومتر DamID PCR التمهيدي 24، 4 ميكرولتر 10 ملي dNTP المزيج، 1 ميكرولتر 50X مزيج البلمرة و 22.5 ميكرولتر H 2 O. الحجم الكلي هو 50 ميكرولتر.
    2. تشغيل PCR على النحو التالي: 68 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 65 ° C لمدة 5 دقائق، 68 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. 4 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 65 ° C لمدة 1 دقيقة، 68 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. 17 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 65 ° C لمدة 1 دقيقة، 68 ° C لمدة 2 دقيقة.
    3. تحليل 5 منتجات ميكرولتر PCR من كل رد فعل على هلام الاغاروز 1٪. يجب أن تظهر منتجات PCR كما مسحة يتراوح بين 0.2 و 2 كيلو بايت (الشكل 2). يجب أن يكون التحكم "لا DpnI" و "لا يغاز" لا أو بوضوح أقل التضخيم.
    4. إذا كانت النتيجة من الخطوة 2.4.3 مرضية، كرر الخطوات 2.4.1-2.4.3 مع اثنين أو ثلاثة ردود الفعل للعينة التجريبية ورد فعل واحد لكل اثنين من الضوابط السلبية.
    5. تجمع وتنقية المنتجات PCR من نفسالعينة التجريبية باستخدام أدوات تنقية PCR أو المرحلة الصلبة عكسية الشلل (سبري) الخرز وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. لا تنقي "لا DpnI" أو ضوابط "لا يغاز". أزل الحمض النووي مع العازلة EB.
    6. قياس تركيز الحمض النووي تنقيته عن طريق قياس OD 260 باستخدام مقياس الطيف الضوئي، التي ينبغي أن تكون نحو 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر أو أعلى. جمع ما لا يقل عن 10 ميكروغرام DNA لكل عينة. إذا باستخدام أدوات تنقية PCR، وتنقية كل 50 ميكرولتر المنتجات PCR مع عمود واحد، أزل في 30 العازلة ميكرولتر EB وتجميع eluates.
  5. ملخص DNA مع DpnII لمنع الاشعال DamID PCR من أن التسلسل.
    1. إعداد رد فعل على الجليد مع DNA النقي 5 ميكروغرام من 2.4.6، 5 ميكرولتر 10X DpnII العازلة، 1 ميكرولتر DpnII (10 U / ميكرولتر) وملء مع H 2 O إلى وحدة تخزين ما مجموعه 50 ميكرولتر. إعداد اثنين أو ثلاثة من ردود الفعل لكل عينة.
    2. الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعةوتعطيل DpnII عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    3. تجمع وتنقية هضم من نفس العينة مع مجموعات تنقية PCR أو الخرز سبري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل الحمض النووي مع العازلة EB.
    4. قياس تركيز الحمض النووي المنقى الذي ينبغي أن يكون حول 0.06 ميكروغرام / ميكرولتر أو أعلى. جمع ما لا يقل عن 6 ميكروغرام DNA لكل عينة. إذا باستخدام أدوات تنقية PCR، وتنقية كل 50 ميكرولتر الهضم مع عمود واحد، أزل في 30 العازلة ميكرولتر EB وتجميع eluates.

3. إعداد مكتبة للإنتاجية عالية التسلسل

  1. جزء DNA
    1. تجريبيا تحديد الوقت الهضم المناسب لكل دفعة جديدة من dsDNA Fragmentase. كما قد يقلل من نشاط انزيم مع مرور الوقت، كرر الاختبار قبل تنفيذ تجربة جديدة. لحفظ الحمض النووي من 2.5.4 لتفتيت الفعلي، استخدم تنقية المنتجات PCR الميثيل من 2.4.6 أو DNA اضافية من experime السابقاليلة في هذه الخطوة.
      1. إعداد مزيج الرئيسي مع DNA 6 ميكروغرام، 12 ميكرولتر 10X Fragmentase العازلة وملء مع H 2 O إلى الحجم الإجمالي من 114 ميكرولتر.
      2. دوامة القارورة الأسهم Fragmentase لمدة 3 ثانية، إضافة إلى 6 ميكرولتر مزيج الرئيسي ودوامة مزيج الرئيسي لمدة 3 ثانية. الحجم الكلي هو 120 ميكرولتر.
      3. قسامة 20 ميكرولتر من مزيج الرئيسي لكل من 5 أنابيب جديدة. احتضان جميع أنابيب 6 إلى 37 درجة مئوية لمدة 5-55 دقائق على زيادة قدرها 10 دقيقة. إضافة 5 ميكرولتر 0.5 M EDTA لوقف التفاعل.
      4. تحليل 12.5 الهضم ميكرولتر (0.5 ميكروغرام DNA) من كل رد فعل وكذلك 0.5 ميكروغرام DNA عسر الهضم على هلام الاغاروز (الشكل 3). تحديد الحد الأدنى من الوقت (T 0.2kb) اللازمة لهضم معظم مسحة إلى حوالي 0.2 كيلو بايت. 6 حدد فترات زمنية بين 5 دقائق و T 0.2kb (بما في ذلك 5 دقائق وT 0.2kb) مع زيادات متساوية للتجزئة الفعلي.
    2. إعداد fragmen الفعليةالكساء كما هو موضح في 3.1.1.1-3.1.1.3. احتضان ردود الفعل عند 37 درجة مئوية لفترات زمنية تحددها في 3.1.1.4.
    3. تجمع 6 ردود الفعل وتنقية هضم مع مجموعات تنقية PCR أو الخرز سبري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل DNA العازلة في 51 ميكرولتر EB. شطافة النهائي ~ 50 ميكرولتر.
  2. إصلاح ينتهي من الحمض النووي مجزأة
    1. إعداد رد فعل على الجليد مع شطافة من 3.1.3، 25 ميكرولتر H 2 O، 10 ميكرولتر 10X T4 DNA يغاز العازلة مع 10 ملي ATP، 4 ميكرولتر 10 ملي مزيج dNTP، 5 ميكرولتر DNA T4 البلمرة (3 U / ميكرولتر) ، 1 ميكرولتر Klenow DNA البلمرة (5 U / ميكرولتر)، و 5 ميكرولتر T4 كيناز عديد النوكليوتيد. الحجم الكلي هو 100 ميكرولتر. تخلط جيدا مع ماصة. تجنب رغوة وفقاعات.
    2. احتضان عند 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. تنقية الحمض النووي مع مجموعات تنقية PCR أو الخرز سبري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل DNA العازلة في 33 ميكرولتر EB. شطافة النهائي ~ 32 & #181؛ ل.
  3. إضافة "A" يتدلى
    1. إعداد رد فعل على الجليد مع شطافة من 3.2.3، 5 ميكرولتر 10X Klenow العازلة، 10 ميكرولتر 1 ملي dNTP، و 3 ميكرولتر Klenow (3 '→ 5' exo-) (5 U / ميكرولتر). الحجم الكلي هو 50 ميكرولتر. تخلط جيدا مع ماصة. تجنب رغوة وفقاعات.
    2. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. تنقية الحمض النووي مع مجموعات تنقية PCR أو الخرز سبري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل DNA العازلة في 22 ميكرولتر EB. شطافة النهائي ~ 21 ميكرولتر.
  4. محولات التسلسل Ligate
    1. إعداد محولات تسلسل 28.
      1. resuspend كل محول بنسبة ضئيلة إلى تركيز 100 ميكرومتر في 10 ملي تريس، الكلور (درجة الحموضة 7.8)، 0.1 ملي EDTA (8.0 درجة الحموضة) و 50 ملي كلوريد الصوديوم.
      2. خلط كميات متساوية من محول عالمي 28 ومحول مفهرسة 28.
      3. يصلب محولات في cycler الحرارية بما يليالبرنامج: 95 ° C لمدة 2 دقيقة. 140 دورات لمدة 30 ثانية ابتداء من 95 درجة مئوية، وتنخفض بنسبة 0.5 ° C كل دورة. عقد في 4 درجات مئوية.
      4. محولات قسامة وتخزينها في -20 ° C.
    2. إعداد رد فعل على الجليد مع شطافة من 3.3.3، 25 ميكرولتر 2X العازلة ربط، 1.5 ميكرولتر 50 ميكرومتر صلب محولات التسلسل (إذابة على الجليد) من 3.4.1.4 و 2.5 ميكرولتر DNA T4 يغاز. تخلط جيدا مع ماصة. تجنب رغوة وفقاعات. إذا كان المطلوب تسلسل متعددة، استخدام محول مفهرسة مختلفة لكل عينة.
    3. في احتضان RT لمدة 1 ساعة.
    4. تنقية الحمض النووي مع مجموعات تنقية PCR أو الخرز سبري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل DNA العازلة في 24 ميكرولتر EB. شطافة النهائي ~ 23 ميكرولتر.
  5. تحويل محولات على شكل Y لdsDNA لتمكين بدقة تحديد جزء DNA أحجام 28
    1. إعداد رد فعل على الجليد مع شطافة من 3.4.4، 12.5 ميكرولتر H 2 O، 1 ميكرولتر 25 ميكرومتر التمهيدي 1 28، 1 ميكرولتر 25 ميكرومتر التمهيدي 2 28، 1.5 ميكرولتر dNTP 10MM، 10 ميكرولتر 5X PCR العازلة و 1 ميكرولتر البلمرة DNA (1 U / ميكرولتر).
    2. تشغيل PCR على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 5 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 63 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ 72 ° C لمدة 1 دقيقة. 4 درجات مئوية على الانتظار.
    3. تنقية الحمض النووي مع مجموعات تنقية PCR أو الخرز سبري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل DNA العازلة في 11 ميكرولتر EB. شطافة النهائي ~ 10 ميكرولتر.
  6. حجم اختيار المكتبة
    1. إعداد 2٪ agarose هلام مع العازلة 1X TAE. إضافة إيثيديوم بروميد (تنبيه!) لتركيز النهائي من 500 نانوغرام / مل عندما يبرد ذاب حل تاي-الاغاروز لتجنب استنشاق بروميد إيثيديوم. تأكد من أن لديك ما يكفي الممرات لجميع العينات، سلم DNA وممرات فارغة.
    2. إضافة 8 ميكرولتر صبغ 6X تحميل لشطافة من 3.5.3.
      3. <لى> إعداد سلم DNA عن طريق خلط 1 كيلوبايت زائد سلم DNA (1.0 ميكروغرام / ميكرولتر)، 6X صبغ التحميل وH 2 O في نسبة 1: 1: 4.
    3. تحميل 6 ميكرولتر سلم DNA، وعينات من الحمض النووي 3.6.2 وسلم 6 ميكرولتر آخر، كل في ممر منفصل ومع واحد على الأقل ممر فارغ من عينات المجاورة / سلالم.
    4. تشغيل هلام في 120 V لمدة 60 دقيقة.
    5. عرض الجل على نقل transilluminator الأشعة فوق البنفسجية (تقليل زمن التعرض للأشعة فوق البنفسجية). ارتداء النظارات الواقية ودرع الوجه. تأكد من واحد على الأقل من سلالم DNA تعمل بشكل جيد مع تباعد المناسب (ما يكفي لاستئصال 3 شرائح هلام) بين 300 و 400 نقطة أساس العصابات مضت. تباعد ضيق يزيد من صعوبات في استئصال شرائح هلام متعددة، بينما تباعد واسعة يزيد من حجم شرائح هلام رفعه.
    6. استخدام مشرط جديد أو شفرة حلاقة لكل حارة. المكوس ثلاث شرائح رقيقة جل ما بين 300 و 400 نقطة أساس من كل حارة (الشكل 4) ووضعها في كل أنبوب microcentrifuge. الحفاظ على حجم كل الصورة هلامالقمل عند أدنى مستوى ممكن (<100 ميكرولتر).
    7. قياس حجم كل شريحة هلام (1 ميكرولتر هلام يزن حوالي 1 ملغ)، إضافة وحدات 6X العازلة QG واحتضان عند 50 ° C.
    8. دوامة الخليط QG جل كل 2-3 دقائق حتى يذوب شريحة هلام تماما. إضافة وحدات جل 2X من الأيزوبروبانول وتخلط.
    9. من هذه الخطوة، اتبع البروتوكول من مجموعات استخراج الهلام. أزل DNA العازلة في 51 ميكرولتر EB. شطافة النهائي ~ 50 ميكرولتر.
  7. إثراء محول تعديل تسلسل الحمض النووي شظايا
    1. تحسين عدد من دورات PCR 29.
      1. إعداد رد فعل على الجليد مع 1 ميكرولتر شطافة من 3.6.10، 1 ميكرولتر 25 ميكرومتر التمهيدي 1 28، 1 ميكرولتر 25 ميكرومتر التمهيدي 2 28، 7 ميكرولتر H 2 O و 10 ميكرولتر SYBR الخضراء Supermix. الحجم الكلي هو 20 ميكرولتر.
      2. تشغيل QPCR على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. 20 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 63 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، وقراءة اللوحة.
      3. تحليل البيانات باستخدام برامج التحليل QPCR وتحديد دورة الكمي (CQ) أو دورة عتبة (CT) لكل عينة باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة. تواصل مع العينات التي لديها CQ / ط م ≤ 14. استخدام الأقصى CQ (CQ 0) ناقص 1 (مقربا إلى العدد الصحيح الأعلى الذي يليه) بصيغتها النهائية PCR عدد دورة (N PCR).
      4. ضبط كميات من قوالب DNA بحيث يتم تضخيم عينات مختلفة لكميات متساوية تقريبا بعد تشغيل نفس عدد دورات PCR. استخدام 8 قالب ميكرولتر لعينة وفقا لأعلى CQ (CQ 0)، وحساب حجم القالب من عينات أخرى مع الصيغة التالية:
        المجلد الأول = 8 × 1.8 CQ ط -Cq 0
    2. إعداد ردود الفعل PCR على الجليد مع وحدات التخزين قالب تحسب من 3.7.1.4: 1 ميكرولتر 25 ميكرومتر التمهيدي 1 28، 1 ميكرولتر 25 ميكرومتر التمهيدي 2 28، 1.5ميكرولتر 10 ملي dNTP، 10 ميكرولتر 5X العازلة، 1 ميكرولتر البلمرة DNA (1 U / ميكرولتر) وملء مع H 2 O إلى وحدة تخزين ما مجموعه 50 ميكرولتر.
    3. تشغيل PCR على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 45 ثانية؛ دورات N PCR (تحديد في 3.7.1.3) من 98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 63 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ 72 ° C لمدة 1 دقيقة. 4 درجات مئوية على الانتظار.
    4. تحليل 5 منتجات ميكرولتر PCR في هلام الاغاروز 2٪ (الشكل 5A). وتشير واضحة الفرقة "واحدة" أن شظايا تضخيم الحمض النووي هي ضمن نطاق ضيق طول وأن مكتبة DNA يمكن أن تخضع لمزيد من التحليل.
    5. تكرار رد فعل واحد للحصول على عينات مختارة وتجمع المكتبات تضخيم الحمض النووي من نفس العينة.
    6. تنقية المكتبات DNA تم اختيارها لالتسلسل.
      1. إذا dimers التمهيدي / محول غير مرئية في 3.7.4، تنقية مكتبات الحمض النووي مع مجموعات تنقية PCR أو الخرز سبري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. أزل DNA العازلة في 21 ميكرولتر EB. الشطافة النهائي ~ 20 ميكرولتر. إذا منشأة التسلسل المستخدم لديه تعليمات محددة على شطف العازلة، والحجم النهائي، وما إلى ذلك، وإعداد العينات وفقا لذلك.
      2. إذا dimers التمهيدي / محول واضحة للعيان في 3.7.4، تنقية المكتبات على النحو التالي.
        1. DNA تحميل من 3.7.5 وسلم DNA في 2٪ هلام الاغاروز الجاهزة. يمكن تنقية عينات كما هو موضح في 3.7.6.1 للحد من حجم أو يمكن تحميلها في الآبار متعددة. وضع الجل الاغاروز في نظام الطاقة المناسب. السماح للهلام لتشغيل لمدة 15 دقيقة.
        2. باستخدام نقل transilluminator المناسب، قطع الفرقة المطلوب مع نظيفة مشرط / الحلاقة لكل عينة ووضع شريحة جل في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
        3. عزل DNA باستخدام أدوات استخراج الهلام وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة مع تعديلين: احتضان العازلة خليط QG-جل في خلاط الحرارية عند 37 درجة مئوية و 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة، وإضافة وحدات جل 2X من الأيزوبروبانول.
  8. إرسال المكتبات DNA النقاء إلى مرفق التسلسل. اتبع جميع المبادئ التوجيهية المرفق.
    ملاحظة: تحليل نوعية من قبل Bioanalyzer (الشكل 5B) يجب أن يتم تنفيذ قبل التسلسل من أجل تحديد مدى حجم الدقيق وتركيز مكتبة DNA.

النتائج

تم التحقق من انصهار بروتين سد-V5-LMNB1 يشترك المترجمة مع البروتين الذاتية لامين B المناعي تلطيخ (الشكل 1).

التضخيم PCR الناجح لشظايا الحمض النووي ميثليته الأدنين هو خطوة رئيسية لDamID وما يليه?...

Discussion

Whether Dam-tagged proteins retain the functions of endogenous proteins should be examined before a DamID-seq experiment. The subcellular localization of Dam-tagged nuclear envelope proteins should always be determined and compared with that of the endogenous proteins. For studying transcription factors, it is suggested to examine whether the Dam-fusion protein can rescue the functions of the endogenous protein in regulating gene expression. This functional test can be performed in organisms in which knockout mutants of ...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Dr. Bas van Steensel for providing the DamID mammalian expression vectors. We thank Yale Center for Genome Analysis and the Genomics Core in Yale Stem Cell Center for advice on preparing NGS libraries and implementing high throughput DNA sequencing. This work was supported by the startup funding from Yale School of Medicine, a Scientist Development Grant from American Heart Association (12SDG11630031) and a Seed Grant from Connecticut Innovations, Inc. (13-SCA-YALE-15).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ViraPower Lentiviral Expression SystemsLife TechnologiesK4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20, and K371-20
Gateway BP Clonase II Enzyme MixLife Technologies11789-020
Gateway LR Clonase II Enzyme MixLife Technologies11791-020
DNeasy Blood & Tissue Kit (250)QIAGEN69506 or 69504  
Gateway pDONR 201Life Technologies11798-014
293T cellsAmerican Type Culture CollectionCRL-11268
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redLife Technologies25300-054
DMEM, high glucose, pyruvateLife Technologies11995-065
Fetal Bovine SerumSigmaF4135
Trisbrand not critical
EDTAbrand not critical
200 Proof EtOHbrand not critical
Isopropanolbrand not critical
Sodium Acetatebrand not critical
DpnINew England BiolabsR0176supplied with buffer
DamID adaptors "AdRt" and "AdRb"Integrated DNA Technologiessequences available in ref. 24; no phosphorylation of the 5' or 3' end to prevent self-ligation.
T4 DNA LigaseRoche Life Science10481220001supplied with buffer
DpnIINew England BiolabsR0543supplied with buffer
DamID PCR primer "AdR_PCR"Integrated DNA Technologiessequences available in ref. 24
Deoxynucleotide (dNTP) Solution SetNew England BiolabsN0446100 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP
Advantage 2  Polymerase MixClontech639201supplied with buffer
1Kb Plus DNA LadderLife Technologies107870181.0 µg/µl
QIAquick PCR Purification KitQIAGEN28104 or 28106
MinElute PCR Purification KitQIAGEN28004 or 28006for an elution volume of less than 30 µl
SPRI beads / Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63880apply extra mixing and more elution time if less than 40 µl elution buffer is used
Buffer EBQIAGEN19086
NEBNext dsDNA FragmentaseNew England BiolabsM0348supplied with buffer
T4 DNA Ligase Reaction BufferNew England BiolabsB0202
T4 DNA PolymeraseNew England BiolabsM0203
DNA Polymerase I, Large (Klenow) FragmentNew England BiolabsM0210
T4 Polynuleotide KinaseNew England BiolabsM0201
Klenow Fragment (3’ → 5’ exo-)New England BiolabsM0212supplied with buffer
sequencing adaptorsIntegrated DNA Technologiessequences available in ref. 28
Quick Ligation KitNew England BiolabsM2200used in 3.4.3; supplied with Quick Ligation Reaction Buffer and Quick T4 DNA Ligase
sequencing primer 1 and 2Integrated DNA Technologiessequences available in ref. 28
KAPA HiFi PCR KitKapa BiosystemsKK2101 or KK2102supplied with KAPA HiFi DNA Polymerase, 5x KAPA HiFi Fidelity Buffer and 10 mM dNTP mix
agaroseSigma AldrichA4679
ethidium bromideSigma AldrichE1510-10ML10 mg/ml
QIAquick Gel Extraction KitQIAGEN28704 or 28706
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725121 or 1725122
Spectrophotometerbrand not critical
0.45 μm PVDF Filterbrand not critical
25 ml Seringebrand not critical
10 cm Tissue Culture Platesbrand not critical
6-well Tissue Culture Platesbrand not critical
S1000 Thermal CyclerBio-Rad Laboratories
C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad Laboratoriesfor qPCR
Vortex Mixerbrand not critical
Dry Block Heater or Thermomixerbrand not critical
Microcentrifugebrand not critical
Gel electrophoresis system with power supplybrand not critical
Magnet standfor purification of DNA with SPRI beads; should hold 1.5-2 ml tubes; brand not critical
UV transilluminatorbrand not critical
E-gel electrophoresis systemLife TechnologiesG6400, G6500, G6512ST

References

  1. van Steensel, B., Delrow, J., Henikoff, S. Chromatin profiling using targeted DNA adenine methyltransferase. Nat Genet. 27, 304-308 (2001).
  2. van Steensel, B., Henikoff, S. Identification of in vivo DNA targets of chromatin proteins using tethered dam methyltransferase. Nat Biotechnol. 18, 424-428 (2000).
  3. Fu, A. Q., Adryan, B. Scoring overlapping and adjacent signals from genome-wide ChIP and DamID assays. Mol Biosyst. 5, 1429-1438 (2009).
  4. Guelen, L. Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions. Nature. 453, 948-951 (2008).
  5. Kalverda, B., Pickersgill, H., Shloma, V. V., Fornerod, M. Nucleoporins directly stimulate expression of developmental and cell-cycle genes inside the nucleoplasm. Cell. 140, 360-371 (2010).
  6. Kubben, N. Mapping of lamin A- and progerin-interacting genome regions. Chromosoma. 121, 447-464 (2012).
  7. Steglich, B., Filion, G. J., van Steensel, B., Ekwall, K. The inner nuclear membrane proteins Man1 and Ima1 link to two different types of chromatin at the nuclear periphery in S. pombe. Nucleus. 3, 77-87 (2012).
  8. Harr, J. C. Directed targeting of chromatin to the nuclear lamina is mediated by chromatin state and A-type lamins. J Cell Biol. 208, 33-52 (2015).
  9. Gonzalez-Aguilera, C. Genome-wide analysis links emerin to neuromuscular junction activity in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 15, R21 (2014).
  10. Wu, F., Yao, J. Spatial compartmentalization at the nuclear periphery characterized by genome-wide mapping. BMC Genomics. 14, 591 (2013).
  11. Filion, G. J. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
  12. Vogel, M. J. Human heterochromatin proteins form large domains containing KRAB-ZNF genes. Genome Res. 16, 1493-1504 (2006).
  13. Venkatasubrahmanyam, S., Hwang, W. W., Meneghini, M. D., Tong, A. H., Madhani, H. D. Genome-wide, as opposed to local, antisilencing is mediated redundantly by the euchromatic factors Set1 and H2A.Z. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16609-16614 (2007).
  14. Shimbo, T. MBD3 localizes at promoters, gene bodies and enhancers of active genes. PLoS Genet. 9, e1004028 (2013).
  15. Orian, A. Genomic binding by the Drosophila Myc, Max, Mad/Mnt transcription factor network. Genes Dev. 17, 1101-1114 (2003).
  16. Artegiani, B. Tox: a multifunctional transcription factor and novel regulator of mammalian corticogenesis. EMBO J. , (2014).
  17. Schuster, E. DamID in C. elegans reveals longevity-associated targets of DAF-16/FoxO. Mol Syst Biol. 6, 399 (2010).
  18. Bianchi-Frias, D. Hairy transcriptional repression targets and cofactor recruitment in Drosophila. PLoS Biol. 2, e178 (2004).
  19. Woolcock, K. J., Gaidatzis, D., Punga, T., Buhler, M. Dicer associates with chromatin to repress genome activity in Schizosaccharomyces pombe. Nat Struct Mol Biol. 18, 94-99 (2011).
  20. Luo, S. D., Shi, G. W., Baker, B. S. Direct targets of the D. melanogaster DSXF protein and the evolution of sexual development. Development. 138, 2761-2771 (2011).
  21. Germann, S., Gaudin, V. Mapping in vivo protein-DNA interactions in plants by DamID, a DNA adenine methylation-based method. Methods Mol Biol. 754, 307-321 (2011).
  22. Zhang, X. The Arabidopsis LHP1 protein colocalizes with histone H3 Lys27 trimethylation. Nat Struct Mol Biol. 14, 869-871 (2007).
  23. Orian, A. Chromatin profiling, DamID and the emerging landscape of gene expression. Curr Opin Genet Dev. 16, 157-164 (2006).
  24. Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat Protoc. 2, 1467-1478 (2007).
  25. Greil, F., Moorman, C., van Steensel, B. DamID: mapping of in vivo protein-genome interactions using tethered DNA adenine methyltransferase. Methods Enzymol. 410, 342-359 (2006).
  26. de Wit, E., Greil, F., van Steensel, B. Genome-wide HP1 binding in Drosophila: developmental plasticity and genomic targeting signals. Genome Res. 15, 1265-1273 (2005).
  27. . Illumina TruSeq adaptors & PCR primers Available from: https://ethanomics.wordpress.com/chip-seq-library-construction-using-the-illumina-truseq-adapters/ (2015)
  28. . Optimization of PCR cycles for NGS Available from: https://ethanomics.wordpress.com/ngs-pcr-cycle-quantitation-protocol/ (2015)
  29. Bernstein, B. E. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28, 1045-1048 (2010).
  30. Encode Project Consortium. A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE). PLoS Biol. 9, e1001046 (2011).
  31. Asp, P. Genome-wide remodeling of the epigenetic landscape during myogenic differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E149-E158 (2011).
  32. Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nat Cell Biol. 16, 919-927 (2014).
  33. Avital, G., Hashimshony, T., Yanai, I. Seeing is believing: new methods for in situ single-cell transcriptomics. Genome Biol. 15, 110 (2014).
  34. Navin, N. E. Cancer genomics: one cell at a time. Genome Biol. 15, 452 (2014).
  35. Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: advances and future challenges. Nucleic Acids Res. 42, 8845-8860 (2014).
  36. Nagano, T. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
  37. Kind, J. Single-cell dynamics of genome-nuclear lamina interactions. Cell. 153, 178-192 (2013).
  38. Southall, T. D. Cell-type-specific profiling of gene expression and chromatin binding without cell isolation: assaying RNA Pol II occupancy in neural stem cells. Dev Cell. 26, 101-112 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

107 DamID DamID DNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved