متلازم الضوء والمجهر الإلكتروني لدراسة دبقية التفاعل مع اللوحات-β اميلويد

Summary

توضح هذه المقالة بروتوكول لتصور اميلويد لويحات Aβ في نماذج الفئران مرض الزهايمر باستخدام ميثوكسي-X04، الذي يعبر حاجز الدم في الدماغ وبشكل انتقائي يربط بيتا-مطوي أوراق وجدت في لويحات Aβ نواة كثيفة. فإنه يسمح الفرز المسبق من أقسام الأنسجة التي تحتوي على لوحة قبل المناعية وتجهيز المجهر الإلكتروني.

Abstract

ويرد بروتوكول مفصلة هنا لتحديد اميلويد لويحات Aβ في أقسام الدماغ من نماذج الماوس مرض الزهايمر قبل المناعية تضمين ما قبل (على وجه التحديد لالمتأين ملزم الكالسيوم محول جزيء 1 (IBA1)، وهو بروتين ملزمة الكالسيوم التي أعرب عنها الخلايا الدبقية الصغيرة) ومعالجة الأنسجة ل المجهر الإلكتروني (EM). ميثوكسي-X04 هو صبغة الفلورسنت التي تعبر حاجز الدم في الدماغ وبشكل انتقائي بربط أوراق بيتا مطوي وجدت في لويحات Aβ نواة كثيفة. حقن الحيوانات مع ميثوكسي-X04 قبل للتضحية وتثبيت الدماغ يسمح الفرز المسبق واختيار من أقسام الدماغ التي تحتوي على لوحة لمزيد من المعالجة مع التلاعب تستغرق وقتا طويلا. وهذا مفيد بشكل خاص عند دراسة علم الأمراض في وقت مبكر م ضمن مناطق محددة في الدماغ أو الطبقات التي قد تحتوي على عدد قليل جدا من لويحات والحاضر إلا في جزء صغير من الأقسام. معالجة ما بعد الوفاة من أقسام الأنسجة مع الكونغو الأحمر، Thioflavin S، وThioflتي AVIN (أو حتى مع ميثوكسي-X04) يمكن تسمية ورقة بيتا مطوي، ولكن يتطلب تطهير واسعة مع الإيثانول لإزالة الصبغة الزائدة وهذه الإجراءات لا تتفق مع الحفاظ التركيبية. ومن شأنه أيضا أن تكون غير فعالة لأداء العلامات لAβ (وغيرها من علامات الخلوية مثل IBA1) على جميع أقسام الدماغ من المناطق ذات الاهتمام، إلا أن تسفر عن جزء صغير يحتوي على لويحات Aβ في الموقع المناسب. الأهم من ذلك، لويحات Aβ لا تزال مرئية بعد معالجة الأنسجة لEM، والسماح لتحديد دقيق للمناطق (بشكل عام ليصل إلى بضعة مليمترات مربعة) لفحص بالمجهر الإلكتروني.

Introduction

اميلويد Aβ تشكيل اللوحة هو السمة المميزة عصبية مرضية الرئيسية لمرض الزهايمر (AD). ومع ذلك أدلة متزايدة تشير إلى الأدوار المهمة للنظام المناعي في ^1،2 تطور المرض. على وجه الخصوص، أنشأت بيانات جديدة من الدراسات قبل السريرية والسريرية الخلل المناعي كمحرك أساسي ومساهم في AD علم الأمراض. مع هذه النتائج، ظهرت الخلايا المناعية المركزية والطرفية الأهداف العلاجية بأنها واعدة لمدة ³ م. بروتوكول التالي يجمع بين الضوء والمجهر الإلكتروني (EM) لتوليد رؤى جديدة في العلاقة بين Aβ ترسب البلاك والتعديلات المظهرية دبقية في م. يسمح هذا البروتوكول وصفها لويحات Aβ في نماذج الفئران ميلادي استخدام في حقن الجسم الحي من صبغة الفلورسنت ميثوكسي-X04. ميثوكسي-X04 هو مشتق الكونغو الأحمر التي يمكن بسهولة عبور حاجز الدم في الدماغ لدخول حمة الدماغ وربط صحائف β-مطوي مع ارتفاعffinity. منذ صبغ فلوري، يمكن استخدامه في الجسم الحي الكشف عن Aβ وحة ترسب مع اثنين من الفوتون المجهري ^4. مرة واحدة متجهة إلى Aβ، ميثوكسي-X04 لا فصل أو إعادة توزيع بعيدا من لويحات، وأنه يحتفظ مضان على مر الزمن. يدار بشكل عام محيطيا للسماح للتصوير غير الغازية للديناميات الدماغ ^5. يبقى مضان أيضا بعد تثبيت ألدهيد، والسماح لتحليل المتلازم بعد الوفاة، بما في ذلك التحقيق في وفاة الخلايا العصبية في المنطقة المجاورة لويحات Aβ ^6.

يأخذ هذا البروتوكول الاستفادة من خصائص ميثوكسي-X04 لتحديد أقسام الدماغ من APP _SWE / PS1A _246E الفئران (APP-PS1، coexpressing طفرة مزدوجة في APP الجينات Lys670Asn / Met671Leu، والإنسان presenilin PS1-A264E البديل) ⁷ الذي يحمل Aβ لويحات في مناطق معينة من الفائدة (CA1 الحصين، المشععة طبقات، والجوبية-moleculare) قبل إلى ما قبل تضمين المناعية ضد علامة دبقية المتأينة ملزم الكالسيوم محول جزيء 1 (IBA1) لتصور أجسام الخلايا الدبقية والعمليات مع EM. أعطيت الفئران حقن داخل الصفاق من حل ميثوكسي-X04، 24 ساعة قبل تثبيت الدماغ من خلال نضح transcardial. ويتم الحصول على أقسام الدماغ الاكليلية باستخدام vibratome. يتم فحص الأجزاء التي تحتوي على CA1 الحصين تحت المجهر الفلورسنت لوجود لويحات Aβ في المشععة لطبقات والجوبية-moleculare. المناعية لIBA1، ثم يتم إجراء رباعي أكسيد الأوزميوم بعد التثبيت، والبلاستيك الراتنج التضمين على أقسام الدماغ المحدد. في نهاية هذا البروتوكول، وأقسام يمكن أرشفة دون مزيد من التدهور التركيبية، وعلى استعداد لباجتزاء سامسونج وفحص التركيبية. الأهم من ذلك، لويحات لا تزال فلوري بعد المناعية مع الأجسام المضادة مختلفة، على سبيل المثال IBA1 كما هو الحال في هذا البروتوكول. فإنها تصبح أكثر قتامة رهان neuropil من المحيط التالية رباعي أكسيد الأوزميوم بعد التثبيت، بشكل مستقل عن ميثوكسي-X04 تلطيخ، مما يساعد على تحديد دقيق للمناطق الفائدة، بشكل عام ليصل إلى بضعة مليمترات مربعة، لفحصها بالمجهر الإلكتروني النافذ.

ويوفر هذا النهج مترابط وسيلة فعالة لتحديد أقسام الدماغ محددة لفحص على مستوى التركيبية. وهذا مفيد بشكل خاص عند دراسة علم الأمراض الميلادي في وقت مبكر، في مناطق محددة في الدماغ أو الطبقات التي قد تحتوي سوى عدد قليل من لويحات Aβ، موجودة في جزء صغير فقط من أقسام الأنسجة. خلال هذه الأوقات خاصة، فإنه سيكون غير فعال لاستخدام المناعية لAβ (ووضع العلامات مزدوج للعلامات الخلوية الأخرى مثل IBA1) على عدة أقسام الدماغ ببساطة أن تسفر عن جزء صغير يحتوي على لويحات Aβ في الموقع المناسب. وبالإضافة إلى ذلك، حقن الفئران حية مع ميثوكسي-X04 قبل أن يضحي ومعالجة الأنسجة لا التراضيالبريد الحفاظ التركيبية. الطرق البديلة مثل تلطيخ بعد الوفاة مع الكونغو الأحمر، Thioflavin S، Thioflavin تي أو ميثوكسي-X04 على أقسام الأنسجة الثابتة تتطلب التفريق تلطيخ في الإيثانول، ^11/08 الذي يسبب الضغط الاسموزي ويعطل التركيب الدقيق. الكونغو الأحمر هو أيضا مادة مسرطنة معروفة الإنسان ^12.

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع التجارب وتنفيذها في إطار المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية، بما يتفق مع المجلس الكندي بشأن المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان كما تدار من قبل لجنة رعاية الحيوان من جامعة لافال. واستخدمت APP-PS1 الفئران الذكور ما بين 4 و 21 شهرا من العمر. وتم إيواء هذه الحيوانات في إطار دورة ضوء الظلام 12 ساعة في 22-25 درجة مئوية مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء.

1. إعداد الحل ميثوكسي-X04

1. إعداد 5 ملغ / مل حل من ميثوكسي-X04 ⁹ عن طريق إذابة ميثوكسي-X04 في محلول يحتوي على 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، و 45٪ بروبيلين غليكول، و 45٪ فوسفات الصوديوم مخزنة المالحة (0.9٪ كلوريد الصوديوم في 100 ملي العازلة الفوسفات ، ودرجة الحموضة 7.4).
   1. باستخدام توازن دقيق، تزن 5 ملغ من مجمع ميثوكسي-X04. تحت غطاء الدخان، حل ميثوكسي-X04 في DMSO ويحرك حتى يتم الحصول على حل مخضر واضح. تباعا إضافة غليكول البروبيلين وفتاهosphate العازلة المالحة مع التحريك مع كل إضافة.
   2. تحريك الحل في 4 درجات مئوية على محور دوار O / N. الحصول على مستحلب الأخضر المصفر. يمكن تخزين الحل في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين دون تدهور.

2. ميثوكسي-X04 الحل حقن

1. 24 ساعة قبل التروية، وتزن الفئران وإعطاء كل فأر حقنة داخل الصفاق من ميثوكسي-X04 بجرعة 10 ملغم / كغم من وزن الجسم باستخدام إبرة 27 ½ G.

3. Transcardial الإرواء من الفئران المحقونة

1. في اليوم قبل التروية، وإعداد كميات مناسبة من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، 3.5٪ الأكرولين، والحلول 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) ¹³ وتخزينها في 4 درجات CO / N.
   ملاحظة: سيتم استخدام هذه الحلول على حد سواء نضح وقبل تضمينها المناعية. عناية خاصة عند العمل مع الأكرولين، كما هو تآكل والسامة على حد سواءالباحثون والبيئة. وبالإضافة إلى ذلك، منذ الأكرولين هو تآكل إلى البلاستيك، دائما استخدام الأواني الزجاجية مناسبة لإعداد حلول الأكرولين.
2. في يوم التروية، تصفية PFA والأكرولين باستخدام ورق الترشيح الخشنة من 25 ميكرون الاحتفاظ الجسيمات.
3. خلال التروية، واستخدام مضخة تحوي على تسليم 15 مل من برنامج تلفزيوني، 75 مل من الأكرولين، و 150 مل من PFA تباعا إلى الدورة الدموية الماوس، بمعدل تدفق 25 مل / دقيقة.
   توخي الحذر. أداء نضح بدقة داخل غطاء الدخان لتجنب أبخرة ضارة من منهاج العمل والأكرولين.
   1. لإعداد مضخة، أدخل أحد طرفيه في حل برنامج تلفزيوني، وملء الأنبوب (عقد حوالي 15 مل) مع برنامج تلفزيوني، وإصلاح 25 G المجنحة إبرة جمع الدم إلى الطرف الآخر. في جميع الأوقات، تأكد من أن أنابيب خالية من أي فقاعات الهواء المحاصرين.
   2. وضع أنبوب مباشرة في زجاجة الأكرولين بعد وضع مضخة نضح مع أنابيب مليئة برنامج تلفزيوني.
4. لaesthetize الماوس في وقت واحد مع 90 ملغم / كغم من وزن الجسم جرعة من الصوديوم بنتوباربيتال حقن داخل الصفاق باستخدام 27 ½ G إبرة. تقييم الاستجابات لالقرصات الذيل / اصبع القدم. المضي قدما إلا إذا كان الماوس لا يستجيب لمثل هذه مكره، المحفزات المؤلمة.
5. تأمين الماوس في موقف ضعيف (مستلقيا على ظهره ووجهه لأعلى) عن طريق تسجيل في الأرجل الأمامية وhindpaws إلى سطح العمل وفضح بعناية قلب دون أن تسبب تلفا للأعضاء أخرى. مما لا شك فيه للعمل بسرعة بعد ثقب الحجاب الحاجز.
   1. إجراء شق طريق الجلد مع مقص جراحي على طول خط الوسط الصدري ابتداء الذيلية إلى القفص الصدري والمضي قدما منقاري إلى الترقوة.
   2. جعل اثنين من الشقوق الجانبية إضافية على طول قاعدة القفص الصدري البطني. تحرك بلطف ويعلقون اللوحات اثنين من الجلد، مما لا شك فيه أن كشف التجويف الصدري بأكمله.
   3. عقد عملية الخنجري مع ملقط حادة لفضح تجويف الصدري وتحقيق استقرار مقص أشارالصورة. قطع طريق الحجاب الحاجز والقفص الصدري، والحرص على تجنب ثقب الرئتين، والاستمرار في منقاري شق إلى الترقوة. مما لا شك فيه للعمل بسرعة بعد ثقب الحجاب الحاجز.
6. المسيل للدموع بلطف كيس التامور مع ملقط حادة. عقد قلب ثابت مع ملقط حادة، وقطع الأذين الأيمن، وبدء ضخ PBS. إدراج الفور الإبرة جمع الدم إلى البطين الأيسر.
7. يروي الماوس مع برنامج تلفزيوني (في الأنبوب)، يليه الأكرولين لمدة 3 دقائق (الموافق 75 مل) ثم التبديل إلى منهاج العمل لمدة 6 دقائق (الموافق 150 مل). تأكد من إيقاف تدفق المضخة قبل ان ينتقل الحل لمنع الفقاعات من دخول الأنبوب.
8. قطع رأس الماوس واستخراج الدماغ ثابتة ووضعه مباشرة في قارورة زجاجية تحتوي على 4٪ PFA لا يقل عن 2 ساعة في 4 درجات مئوية.
   1. لاستخراج المخ، استخدم مقص وملاقط لقطع طريق الجلد لفضح الجمجمة. بعناية كسر المرجع الجمجمةأون بين العينين، ورقاقة قطع صغيرة منه لفضح الدماغ الكامنة.
   2. إزالة بعناية يتعرض الدماغ وظيفة الإصلاح مع PFA 4٪ لمدة 2 ساعة إضافية قبل الانتقال لvibratome باجتزاء.

4. الدماغ باجتزاء باستخدام vibratome

1. غسل الدماغ ثابت 3 مرات مع المبردة برنامج تلفزيوني. باستخدام شفرة حلاقة حادة، وإزالة البصلة الشمية (ما لم تكن هذه المنطقة قيد التحقيق) وقطع الدماغ عرضيا إلى 2-3 قطع من يساوي تقريبا الارتفاع، والتي يمكن مقطوع في وقت واحد من أجل تسريع العملية.
2. الغراء قطعة من نسيج الدماغ عموديا على لوحة عينة المضمون في الدرج. تأكد من أن قطع سطح أملس تتمسك بحزم إلى لوحة العينة ولا يحصل طردت أثناء إجراء باجتزاء. إضافة ما يكفي من حل PBS في الدرج حتى غمرت سطح الدماغ بأكمله تماما. فمن المهم للحفاظ على عشرقطع المخ الإلكترونية وأقسام لاحقة مغمورة تماما في برنامج تلفزيوني في جميع أنحاء هذه الخطوة.
3. وضع صينية في vibratome، وضبط سرعة باجتزاء إلى 0.5 ملم / ثانية، وتواتر باجتزاء إلى 90 هرتز، وسمك تغذية إلى 50 ميكرون من أجل تسفر عن 50 ميكرون أبواب سميكة. ثم نقل المقاطع في قوارير الزجاج 20 مل تحتوي على حل cryoprotectant (40٪ في برنامج تلفزيوني، و 30٪ جلايكول الإثيلين، و 30٪ الجلسرين) باستخدام الفرشاة الجميلة. تخزين قوارير في -20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. بدلا من ذلك، والحفاظ على المقاطع في برنامج تلفزيوني لفحص فوري كما هو موضح في الخطوات التالية.

5. القسم فحص للوجود لويحات الملون ميثوكسي-X04-

1. مع المعونة من مخ الفأر التجسيمي أطلس ^14، مقاطع مختارة الدماغ الذي يحتوي على منطقة الفائدة، على سبيل المثال، CA1 الحصين المستخدمة في المثال الحالي. وضع كل قسم في بئر في لوحة الثقافة 24 أيضا تحتوي على حل cryoprotectant يكفيوذلك لمنع المقاطع من الجفاف.
2. دراسة كل قسم على التوالي، لتجنب الجفاف الأقسام، وذلك باستخدام الإجراء التالي:
   1. إضافة قطرات من برنامج تلفزيوني على شريحة المجهر مع ماصة للتصرف، ووضع القسم الخاص الحبرية.
   2. دراسة قسم تحت المجهر الفلورسنت لتحديد المناطق التي تحتوي على ميثوكسي-X04 المسمى لويحات Aβ.
      ملاحظة: ميثوكسي-X04 يمكن تصور بسهولة باستخدام مضان الأشعة فوق البنفسجية (UV) مرشح (الإثارة 340-380 نانومتر).
3. التقاط الصور من المناطق ذات الاهتمام (ROI) في حقل مشرق وكذلك في وضع مضان دون تحريك المسرح المجهر، لأن كل صورة يجب أن تظهر نفس المنطقة في كل المجالات من أجل ربط وجود لويحات مباشرة إلى المنطقة الهيكلية لل قسم الأنسجة.
4. حفظ وتسمية الصور الملتقطة وفقا لعدد الحيوانات. سجل أيضا عدد جيد في لوحة ومجال الصور تاكين. على سبيل المثال، مثال: 9978A1B. عدد الحيوانات: 9978. حسنا رقم: A1؛ الملعب: مشرق. وضع القسم الخلفي في المعينة بشكل جيد بمجرد الانتهاء من التصوير.
   ملاحظة: في النهاية، لكل قسم فحص، ويتم الحصول على صورتين، واحدة في مشرق الميدان وآخر في مجال الأشعة فوق البنفسجية.
5. فتح الصورتين من نفس العائد على الاستثمار (واحد في مجال مشرق والآخر في مجال الأشعة فوق البنفسجية) في صورة ياء، واستخدام البرنامج المساعد MosaicJ، محاذاة حواف الصورتين وحفظ الصورة الانحياز ومجتمعة وفقا لعدد جيدا جاءت.
6. حفظ الصورة في مجلد منفصل مع عدد من الحيوان معين. الجمع بين الصور لتحديد وحصر لويحات في قسم الأنسجة، ولها مرأى ومسمع من قسم كامل في اثنين من مجالات مختلفة (مشرق والأشعة فوق البنفسجية).
7. بعد الانتهاء من عملية الفرز، وتخزين أقسام فحص عند درجة حرارة -20 درجة مئوية في لوحة الثقافة 24 أيضا تحتوي على cryoprotectant حتى المناعية أو مزيد من المعالجة هو كاليفورنياrried بها.

6. قبل تضمين المناعية للIBA1

ملاحظة: إجراء المناعية للIBA1 على أقسام عائمة بحرية اختيار عن طريق وضع لوحة على الكرسي الهزاز تتحرك ببطء في RT.

1. اغسل الأقسام 3 مرات مع ما يقرب من 1 مل برنامج تلفزيوني، كل غسل دائم لمدة 10 دقيقة.
2. إخماد بيروكسيديزات الذاتية مع 0.3٪ بيروكسيد الهيدروجين في محلول برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة. هذه الخطوة يمنع النشاط البيروكسيديز غير محددة، وهو أمر مهم لتجنب تلطيخ الخلفية.
3. غسل الأنسجة في برنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
4. احتضان المقاطع في 0.1٪ بوروهيدريد الصوديوم في محلول برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة. هذه الخطوة مهمة للحد من أي الألدهيدات المتبقية من الخطوة التثبيت، وأهمية خاصة إذا تم استخدام الأكرولين في تثبيت الأنسجة.
5. غسل الأنسجة في برنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 10 دقيقة في كل مرة، وتأكد من إزالة جميع الفقاعات.
6. منع المقاطع لمدة 1 ساعة.قد تتطلب الأجسام المضادة المختلفة مرات الحجب المختلفة والحلول. لIBA1، وإعداد عازلة تمنع تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني، 3٪ زلال المصل البقري، و 0.01٪ تريتون X-100 في 50 المالحة ملي تريس مخزنة (TBS، ودرجة الحموضة 7.4).
   ملاحظة: الخطوة الحجب هو منع انوعي ملزمة من الأجسام المضادة الأولية. على تركيز منخفض من تريتون X-100 يسمح permeabilization طفيف من الأغشية لتحسين تلطيخ، ومنخفض بما فيه الكفاية للحفاظ على معظم ملامح التركيبية من الأنسجة تحت EM.
7. إزالة المنطقة العازلة حظر من الأنسجة، واحتضان في حل الأجسام المضادة الأولية (أرنب مكافحة IBA1، مخففة [1: 1000] في المخزن حجب) في 4 درجات CO / N.
8. يغسل في TBS 3 مرات لمدة 10 دقيقة في كل مرة.
9. احتضان في الضد الثانوية (الماعز المضادة للأرنب مترافق لالبيوتين) [1: 200] في 0.05 M TBS لمدة 90 دقيقة.
10. يغسل في TBS 5 مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة.
11. احتضان في أفيدين-البيوتين حل معقد (أفيدين [1: 100]، البيوتين [1: 100]) في TBSالحل لمدة 1 ساعة.
12. يغسل في TBS 5 مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة.
13. الكشف عن تلطيخ IBA1 مع 0.05٪ diaminobenzidine (DAB) و0.015٪ بيروكسيد الهيدروجين في TBS لمدة 8 دقائق.
    ملاحظة: توقيت التنمية DAB قد تختلف من بروتوكول للبروتوكول وينبغي أن تحدد من خلال دراسة بسرعة الأقسام الملون تحت المجهر الضوئي.
    ملاحظة: للحصول على IBA1، ينبغي للمرء أن يكون قادرا على تصور واضح للأجسام الخلايا والعمليات في الخلايا الدبقية الصغيرة ملطخة IBA1 في 20X (انظر الشكل 2 على سبيل المثال تمثيلي). كن حذرا باستخدام DAB، كما هو مادة مسرطنة معروفة.
14. تجنب الإفراط في وضع من خلال رصد دقيق لأقسام (كما هو موضح أعلاه) خلال هذه الخطوة. وقف رد فعل عن طريق غسل المقاطع في الجريدة الرسمية المبردة 5 مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة.

7. معالجة المجهري للإلكترون

1. إعداد 1٪ حل رباعي أكسيد الأوزميوم في برنامج تلفزيوني في قارورة زجاجية. رباعي أكسيد الأوزميوم هو حساس. تغطية زقارورة معشوقة مع رقائق الألومنيوم لحماية الحل بعيدا عن الضوء.
   كن حذرا باستخدام رباعي أكسيد الأوزميوم، كما هو مادة كيميائية خطرة جدا. تنفيذ هذه والخطوات التالية داخل غطاء الدخان.
2. إزالة برنامج تلفزيوني من الأقسام ونشرها شقة باستخدام الفرشاة الجميلة. تنفيذ هذه الخطوة بشكل جيد في وقت واحد للحفاظ على أقسام من الجفاف. تأكد لشد الأجزاء على الفور قبل أن يضيف رباعي أكسيد الأوزميوم، لأن أي طيات في الأقسام سيصبح دائما ومحاولة لشد الأنسجة آخر الأوسيميوم التثبيت سوف فقط كسر الفروع.
3. تزج المقاطع في رباعي أكسيد الأوزميوم لمدة 30 دقيقة في RT، مضيفا قطرة واحدة من رباعي أكسيد الأوزميوم في وقت واحد مع ماصة نقل، لمنع المقاطع من للطي. تغطية البئر مع رقائق الألومنيوم لحماية أقسام من الضوء.
   ملاحظة: هذه الخطوة على إصلاح الدهون داخل الأقسام. سوف تظهر الأنسجة مظلمة جدا بعد الأوسيميوم بعد التثبيت.
4. في حين أقسام هي في tetro الأوسيميومشي ده، وإعداد راتنج البلاستيك في دورق المتاح عن طريق خلط 20 غراما مكون A، 20 ز مكون B، 0.6 غرام مكون C، و 0.4 مكون ز د الجمع بين المكونات معا في الترتيب المذكور أعلاه ومزجها جيدا باستخدام 10 مل ماصة المصلية حتى يتم الحصول على لون موحد.
5. نقل الخليط على استعداد للأطباق الألومنيوم وزنها. سيحصلون على أقسام الأنسجة بمجرد أن يتم المجففة.
6. يذوى المقاطع في زيادة تركيزات الإيثانول لمدة 2 دقيقة في الترتيب التالي: 35٪، 35٪، 50٪، 70٪، 80٪، 90٪، 100٪، 100٪، 100٪.
7. لإزالة الإيثانول المتبقية، وتزج المقاطع في أكسيد البروبيلين 3 مرات لمدة 2 دقيقة في كل مرة. إزالة المقاطع المجففة من لوحة الثقافة 24 بشكل جيد في 20 مل قارورة من الزجاج. دائما استخدام قوارير زجاجية عند العمل مع أكسيد البروبيلين كما يذوب البلاستيك، والحفاظ على الحذر، كما هو الحال الخطرة.
8. استخدام عازمة طرف زجاج ماصة أو الفرشاة الجميلة لنقل أقسام من soluti أكسيد البروبيلينعلى في الراتنج وترك O / N للتسلل في RT. يجب الحرص على عدم تمييع الراتنج مع أكسيد البروبيلين.
9. تضمين المقطع مع الراتنج على بولي كلورو ثلاثي فلورو الإيثيلين (PCTFE) filmsheets:
   1. وضع أطباق الألومنيوم وزنها تحتوي على عينات إلى 50 - 60 درجة مئوية الفرن لمدة 10-15 دقيقة قبل تضمين المقاطع على filmsheets PCTFE.
   2. عند تضمين أقسام، والعمل مع واحدة من الألمنيوم تزن الطبق في وقت واحد. باستخدام الفرشاة الجميلة، والطلاء بطبقة رقيقة من راتنج على ورقة فيلم PCTFE واحد.
   3. نقل قسم واحد من الأنسجة في وقت من الألومنيوم وزنها الطبق إلى ورقة فيلم PCTFE. إزالة الراتنج الزائدة من جميع أنحاء الأنسجة، والحرص على عدم تعكير صفو ذلك.
   4. بعد نقل جميع الأقسام عن بعضها وزنها الطبق إلى ورقة فيلم PCTFE، ضع ورقة PCTFE الثانية على الأولى، وخلق شطيرة من الأنسجة والراتنج في الفترة ما بين 2 ورقة.
10. بلمرة الراتنج في حاضنة لمدة 3 أيام في 55-60 درجة مئوية.
11. والمواد هي الآن جاهزة للباجتزاء سامسونج وفحص التركيبية والتقنيات المتخصصة والتي غالبا ما يتم تنفيذها من قبل المرافق الأساسية EM. تخزين العينات بين الصفائح الرقيقة PCTFE بسلام في RT دون تدهور التركيبية.
    ملاحظة: يتم شرح الخطوات اللاحقة لسامسونج باجتزاء ونقل الفحص المجهري إلكترون في بروتوكول منفصل ^13.

النتائج

يوضح هذا القسم النتائج التي يمكن الحصول عليها في المراحل الحرجة مختلفة من البروتوكول. على وجه الخصوص أظهرت النتائج أمثلة من أقسام الدماغ التي تحتوي على ميثوكسي-X04 لويحات الملون في منطقة محددة وطبقات من الفائدة: وCA1 الحصين، المشععة طبقات، والجوبية-mol...

Discussion

يشرح هذا البروتوكول نهج مترابط لاستهداف ويحات Aβ نواة كثيفة مع EM. ميثوكسي-X04 في حقن الجسم الحي يسمح اختيار السريع لأقسام الدماغ التي تحتوي على لويحات Aβ في مناطق معينة وطبقات من الفائدة، وعلى سبيل المثال CA1 الحصين، المشععة طبقات، والجوبية-moleculare. في المثال الح...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methoxy-X04	Tocris Bioscience	4920	10 mg substrate per tablet
Propylene glycol	Sigma Aldrich	W294004
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher BioReagents	BP231-1	Caution: toxic
Sodium Chloride NaCl	Sigma	S9625
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma	S9638
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S0876
Tris Hydrochloride	Fisher BioReagents	BP153500
Acrolein	Sigma	110221	Caution: Toxic
Paraformaldehyde Granular	Electron Microscopy Sciences	19210	Caution: Toxic
Filter paper	Fisher	09-790-14F
Peristaltic Pump with Tubing	ColeParmer	cp.78023-00
Excel Winged blood Collection Set Needles 25 G	Becton Dickinson	367341
Extrafine Forceps	F.S.T	11152-10	Tip shape: curved
Scissors	F.S.T	14090-09	Tip shape: straight
Hartman Hemostats	F.S.T	13003-10	Tip shape: curved
Surgical Scissors	F.S.T	14004-16	Tip shape: straight
Micro Dissecting Scissors	ROBOZ surgical store	5818
Glass scintillation vials	Fisher Scientific	74515-20
Vibrating Blade Microtome Leica VT1000 S	Leica Biosystems	14047235612
Vibratome blades	Electron microscopy Sciences	71990
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
24-well Tissue Culture Plates	Fisher Scientific	353047
Ethylene Glycol	Fisher BioReagents	BP230-4
Glycerol	Fisher BioReagents	BP229-4
Hydrogen Peroxide, 30%	J.T.BAKER	cat: 2186-01
Sodium borohydride	Sigma	480886
Tris HCl	Fisher	BP153-500ML
Fetal bovine Serum (FBS)	Sigma Aldrich	F1051
Bovine serum albumin (BSA), fraction V	Thomas Scientific	C001H24
Triton X-100	Sigma	T8787
Anti IBA1, Rabbit	WAKO	019-19741
Goat Anti-Rabbit IgG	Jackson Immunoresearch	111066046
VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard)	Vector Labs	PK-6100
3.3'-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB)	Sigma	D5905-50TAB	Caution: toxic
Osmium tetroxide, 4% solution	Electron Microscopy Sciences	19150	Caution: toxic
Durcupan™ ACM single component A	Sigma	44611	Resin Caution: Toxic
Durcupan™ ACM single component B	Sigma	44612	Hardener Caution: Toxic
Durcupan™ ACM single component C	Sigma	44613	Plasticizer Caution: Toxic
Durcupan™ ACM single component D	Sigma	44614	Accelerator Caution: Toxic
Ethanol	LesAlcoolsdeComerce	151-01-15N
Propylene oxide	Sigma	110205	Caution: corrosive
Aluminum weigh dishes	Electron Microscopy Sciences	70048-01
ACLAR®–Fluoropolymer Films	Electron Microscopy Sciences	50425
Oven/Incubator	VWR