JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

كتلة phyloproteomics القائم على الطيف (MSPP) كانت تستخدم لكتابة مجموعة من العطيفة SSP الصائمية. doylei يعزل على مستوى السلالة بالمقارنة مع multilocus تسلسل الكتابة (MLST).

Abstract

تقدم MALDI-TOF MS إمكانية للتمييز بعض البكتيريا ليس فقط على مستوى الأنواع والسلالات ولكن حتى أدناه، على مستوى الضغط. الإسوية أليلية من أيونات العلامات البيولوجية للكشف تؤدي إلى تحولات الشامل عزل محدد. phyloproteomics القائم على الطيف الكتلي (MSPP) هو أسلوب الرواية التي تجمع بين الطيفي الشامل الجماهير العلامات البيولوجية التي يمكن اكتشافها في مخطط يسمح خصم العلاقات phyloproteomic من التحولات كتلة محددة عزل مقارنة الجينوم التسلسل سلالة المرجعية. ثم يتم استخدام تسلسل الأحماض الأمينية استنتاجها لحساب dendrograms أساس MSPP.

نحن هنا وصف سير العمل MSPP عن طريق كتابة SSP العطيفة الصائمية. doylei جمع العزلة من سبع سلالات. وكانت جميع سلالات سبعة من أصل بشري وmultilocus تسلسل الكتابة (MLST) أظهرت تنوعها الوراثي. أسفرت MSPP-الكتابة في سبعة أنواع مختلفة من تسلسل MSPP، تعكس بصورة كافية فيز بهمالعلاقات logenetic.

وC. الصائمية SSP. doylei يتضمن مخطط MSPP 14 أيونات العلامات البيولوجية المختلفة، والبروتينات في الغالب الريباسي في نطاق كتلة من 2 إلى 11 كيلو دالتون. MSPP يمكن من حيث المبدأ، أن تتكيف مع منصات الطيفي الشامل الأخرى مع مجموعة الشامل الموسعة. لذلك، هذه التقنية لديها القدرة على أن تصبح أداة مفيدة لكتابة الميكروبية مستوى التوتر.

Introduction

خلال العقد الماضي، مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز التأين مطياف زمن الطيران (MALDI-TOF MS) وقد تقدمت لتكون طريقة موحدة ذات قيمة عالية لجنس الجراثيم وتحديد الأنواع في علم الأحياء الدقيقة السريرية 1 و 2. ويستند تحديد الأنواع على تسجيل بصمات بروتين صغيرة من خلايا سليمة أو الخلية لست]. مجموعة كتلة نموذجي لمطياف الكتلة المستخدمة في علم الأحياء الدقيقة السريري الروتيني هو 2-20 كيلو دالتون. بالإضافة إلى ذلك، الأطياف الناتجة يمكن أن تستخدم لتمييز سلالات في الأنواع التالية وتحت سلالات مستوى 3. وقد حددت الدراسات الرائدة الأولى أيونات العلامات البيولوجية المحددة لمجموعة فرعية معينة من سلالات في العطيفة الصائمية 4، المطثية العسيرة 5، السالمونيلا الملهبة للSSP. الملهبة للضرب مصلي التيفية 6، المكورات العنقودية الذهبية 7-9، وEscherichia القولونية 10-12.

مزيج من عدة كتل العلامات البيولوجية متغير الموافق الإسوية أليلية يوفر خيار لتصنيف الفرعي أعمق. سابقا، نفذنا بنجاح طريقة لتحويل هذه الاختلافات في الشخصية الجماعية في علاقات phyloproteomic هادفة وقابلة للتكرار دعت كتلة phyloproteomics الطيف القائم (MSPP) على C. الصائمية SSP. جمع عزل الصائمية 13. MSPP يمكن استخدام أي ما يعادل الطيفي الشامل لتقنيات التصنيف الفرعي أساس تسلسل الحمض النووي مثل تسلسل multilocus الكتابة (MLST).

أنواع التسمم الغذائي هي السبب الرئيسي لالتهاب المعدة والأمعاء البكتيرية في جميع أنحاء العالم 14 و 15. ونتيجة لذلك الناجمة عن هذا المرض عقبول آخر المعدية، وهي غيان باريه متلازمة، التهاب المفاصل التفاعلي ومرض التهاب الأمعاء يمكن أن تنشأ 16. المصادر الرئيسية للعدوى هياللحوم الحيوانية الملوثة من الدجاج والديك الرومي والخنازير والأبقار والأغنام والبط والحليب والمياه السطحية 15 و 17. لذلك، دراسات المراقبة الوبائية العادية في سياق سلامة المواد الغذائية الضرورية. MLST هو "المعيار الذهبي" في الكتابة الجزيئية للأنواع العطيفة 18. لأن سانجر التسلسل طريقة MLST استنادا إلى عمالة كثيفة، مضيعة للوقت ومكلفة نسبيا، يقتصر MLST الكتابة إلى الأفواج عزل صغيرة نسبيا. لذلك، هناك حاجة لطرق أرخص وأسرع التصنيف الفرعي. يمكن تلبية هذه الحاجة عن طريق وسائل لقياس الطيف الكتلوي مثل MSPP.

تقدم هذه الورقة بروتوكول مفصلة لMSPP-الكتابة باستخدام مجموعة من العطيفة SSP الصائمية. doylei العزلات والمقارنة إمكاناته مع MLST.

Protocol

1. إعداد بيئة عمل آمنة من خلال النظر في شروط السلامة الأحيائية

  1. تعرف على لوائح المختبرات والسلامة التي هي ذات الصلة للعمل مع الكائنات الحية الدقيقة. يجب أن يتم التعامل مع معظم الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض البشرية على مستوى السلامة الحيوية 2 الظروف ولكن بعضها، مثل السالمونيلا الملهبة للضرب مصلي التيفية، تتطلب مستوى السلامة الحيوية 3. معلومات على مستوى التعامل مع كل مسببات المرض يمكن الحصول عليه من www.cdc.gov/biosafety.
  2. بغض النظر عن تصنيف واقية من الكائنات الحية الدقيقة معين، تعتبر جميع المواد التي جاءت في اتصال مع وكيل المعدية مثل النفايات المعدية التي يجب تعقيمها قبل التخلص منها. احترام إرشادات السلامة الإقليمية للمواد الخطرة والمواد البيولوجية. التأكد من أن الحاويات المناسبة للتخلص منها فورا والسليم للمواد يحتمل أن تكون ملوثة (خطورتها) متاحة.
  3. تأكد من أن الأدوات المعقمة (الحلقات التلقيح) والحلول وسائل الإعلام والثقافة (تتوفر قبل البدء ثقافة البكتيرية لوحات أجار).
  4. غسل اليدين بالماء والصابون المطهر والماء الدافئ على الفور بعد التعامل مع الكائنات الحية الدقيقة المعدية.

2. حدد المرجعية ومجموعة عزلات

  1. اختيار والحصول القياسية إشارة واحدة متسلسلة الجينوم عزل جنبا إلى جنب مع تسلسل للبروتيوم المشفرة، من الناحية المثالية في شكل FASTA. إذا هي أكثر سلالات تسلسل الجينوم المتاحة، وتشمل هذه في التحليل.
    ملاحظة: هذه العزلة / وفي وقت لاحق أن تستخدم هذه العزلات على التنبؤ بهوية قمم كتلة لوحظ في قياس الطيف الكتلي (انظر القسم 7).
  2. تحديد والحصول على مجموعة متنوعة من العزلات يحتمل أن تكون متنوعة في مثل هذه الطريقة التي تغطي نسالة من الأنواع أو سلالات من الفائدة.
    ملاحظة: سيتم في وقت لاحق أن تستخدم هذه العزلات لإثبات تباين المؤشرات الحيوية في عدد السكان (انظر القسم 8).
  3. تأكد من أن المجموعة بأكملها وعزل المرجعية (ق) هي المؤيدةكتبته بيرلي من قبل معيار الذهب منها لمعين هذا الكائن الحي 18-20.
    ملاحظة: هذا قد تشمل مجموعة متنوعة من (الفرعية) طرق -typing، ولكن من المرجح أن تلجأ إلى MLST، التي لا تزال هي الطريقة المعتادة لإظهار التنوع الجيني لمعظم الأنواع الميكروبية.
  4. للاستدلال على نسالة في جمع وحساب phylogram من البيانات في الكتابة، على سبيل المثال، وذلك باستخدام طريقة مجموعة الزوج غير المرجح بمتوسط حسابي (UPGMA) في برنامج MEGA6 للبيانات MLST 21. للحصول على بيانات MLST، أيضا استشارة قاعدة بيانات MLST وتعيين أنواع تسلسل والمجمعات نسيلي منها 22.
    ملاحظة: سيتم في وقت لاحق أن تستخدم هذه لتحليل التطابق من MSPP مع الذهب في وقت سابق طريقة الكتابة القياسية (انظر القسم 9).

3. إعداد لوحة MALDI الهدف

تنبيه: TFA هو حمض قوي. الاستخدام غير السليم من TFA يحمل خطر حروق جلدية خطيرة، الأضرار التي تصيب العين وشديدة تهيج سو الجهاز التنفسي العلوي في حالة استنشاقه. ولذلك، يجب أن تحترم إجراءات السلامة الصارمة وهناك حاجة إلى معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) بما في ذلك نظارات السلامة ودروع لحماية الوجه، والقفازات المناسبة، والأحذية، أو حتى بدلة واقية كاملة، في حين أن التعامل TFA. يجب السيطرة على احتمال التعرض للTFA عن طريق التعامل مع المادة تحت التهوية الكافية مع نظام العادم التهوية فعال. في حالة عدم كفاية التهوية، وجهاز للتنفس الصناعي مع فلتر وافقت يجب أن تستخدم. بالإضافة إلى ذلك، TFA هو ضار للحياة المائية مع تأثيرات طويلة الأمد. ويجب تجنب أي تسرب للTFA في مياه الصرف الصحي على البيئة.

ملاحظة: قبل اكتشاف العينات على هدف MALDI، وتنظيف لوحة الهدف بدقة إذا تم استخدام لوحة سابقا.

  1. إعداد 100 مل 70٪ محلول الإيثانول المائي باستخدام 30 مل من الماء منزوع الأيونات و 70 مل الإيثانول النقي.
  2. إعداد 250 ميكرولتر من 80٪ حمض trifluoroacetic مائي (TFA) حل عن طريق خلط 50ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات و 200 ميكرولتر 100٪ TFA في أنبوب رد فعل وvortexing لأنبوب لمدة 1 دقيقة.
  3. تنظيف الهدف MALDI من خلال وضعه في طبق زجاج والغمر في الإيثانول المائي 70٪ لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. شطف الهدف تحت الماء الساخن.
  5. باستخدام المناديل الورقية، ومسح لوحة الهدف بشكل مكثف مع 70٪ من محلول الإيثانول المائي لإزالة جميع العينات السابقة وغيرها من الحطام المحتملين.
  6. إذا كنت بحاجة إلى المزيد من التنظيف، وشطف تحت الماء الساخن في حين يمسح بمنديل ورق.
  7. إزالة الملوثات المتبقية، ويحتمل أن تكون غير مرئية، و، التي تغطي سطح الهدف مع طبقة رقيقة من 80٪ مائي TFA (~ 100 ميكرولتر في 96 نقاط) والقضاء على جميع المناصب الهدف نظيفة مع المناديل الورقية.
  8. أخيرا، شطف الهدف لإزالة حامض، والقضاء عليها تجف باستخدام المناديل الورقية، وتترك لمدة 15 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة لتتبخر السوائل المتبقية.

4. إعداد ل45؛ -Cyano-4-هيدروكسي-السيناميك حمض مصفوفة محلول يحتوي على Calibrant الداخلية

  1. يعد حل مصفوفة مشبعة عن طريق إذابة 10 ملغ α-cyano-4-هيدروكسي-السيناميك حمض (HCCA) في 1 مل من خليط من 50٪ الأسيتونتريل والمياه 47.5٪، و 2.5٪ TFA. سيبقى المتبقية غير منحل HCCA إذا مشبعة الحل.
  2. إضافة الأنسولين البشري المؤتلف باعتبارها calibrant الداخلي. لهذا، يعد حل الأسهم إلى التركيز النهائي من 10 جزء من الغرام / ميكرولتر في 50٪ المائية الأسيتونتريل، قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية لاستخدامها مرة أخرى.

5. MALDI-TOF الطيف الكتلي

ملاحظة: الشروط ثقافة محددة للكائنات من الفائدة يجب أن تستخدم. عينات لMALDI-TOF MS يمكن إعداد إما عن طريق إعداد تشويه أو استخراج، اعتمادا على الكائن الحي (انظر القسم 8.4.1). في حين أن طريقة استخراج حمض الفورميك الإيثانول يوفر تعطيل كاف من مسببات الأمراض، وإعداد تشويه يجب أن تتم تحت الإكتفاءشروط السلامة الأحيائية icient على النحو المطلوب (انظر القسم 1). عادة، لا يوجد أي خطر من الإصابة بعد تطبيق مصفوفة، ولكن لمسببات الأمراض محددة مطلوبة بروتوكولات تعطيل محددة. وهكذا، على سبيل المثال MALDI-TOF MS الأنواع النوكارديا يتطلب تحلل السابق من البكتيريا في الماء المغلي، وبعد عن طريق الترسيب الايثانول من البروتينات 23. EI Khéchine وآخرون. وضعت إجراءات لتثبيط مايكوباكتيريا، تسخين المستعمرات البكتيرية في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في أنابيب المسمار الحد الأقصى تحتوي على المياه و 0.5٪ توين 20 24.

  1. تحضير لطخة
    1. توزيع كمية بحجم رأس الدبوس من مستعمرة بكتيرية مباشرة على طبق من ذهب الموقف الهدف MALDI ( 'بقعة').
    2. تراكب كل بقعة مع 1 ميكرولتر من HCCA المصفوفة العادية أو مصفوفة تحتوي على calibrant الداخلي وتترك لcrystalize في درجة حرارة الغرفة. لتحديد كتلة بالضبط من ذروة المعايرة، تراكب س السيطرةبعد التمديد مع 1 ميكرولتر الاختبار القياسية و 1 ميكرولتر من HCCA مصفوفة تحتوي على calibrant الداخلي.
      ملاحظة: هنا، كما الاختبار القياسية يتم استخدام مستخرج من الإشريكية القولونية DH5 ألفا يوضح بصمة البروتين مميزة في MALDI-TOF MS. وارتفعت انها مع اثنين من البروتينات التي تمتد الحد الأعلى للنطاق كتلة اكتشافها.
  2. طريقة استخراج
    1. حصاد ما يقرب من خمس مستعمرات من ثقافة لوحة أجار مع حلقة التلقيح وتعليق جيدا في 300 ميكرولتر الماء المقطر المزدوج في أنبوب 1.5 مل التفاعل. إضافة 900 ميكرولتر الايثانول المطلق وتخلط جيدا من قبل pipetting المتكررة حتى يتم تعليق المستعمرات البكتيرية تماما.
      ملاحظة: في هذه الخطوة فمن الممكن وراسخة لتخزين العينات في -20 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك، تثبيط الجراثيم يمكن اختبارها من قبل تسليط الضوء على 1-10 ميكرولتر من استخراج على لوحة أجار المناسبة التالية الحضانة في ظروف النمو المثلى. ناجح فييشار إلى تفعيل بسبب عدم وجود نمو الجراثيم.
    2. أجهزة الطرد المركزي في العينة 13000 x ج لمدة 1 دقيقة، ونبذ طاف، وتجفيف بيليه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. resuspend الكرية بشكل دقيق من قبل pipetting صعودا ونزولا في 50 ميكرولتر من حمض الفورميك 70٪.
    3. إضافة 50 ميكرولتر من الأسيتونتريل وتخلط. إزالة الأنقاض عن طريق الطرد المركزي في 13000 x ج لمدة 2 دقيقة. نقل 1 ميكرولتر من طاف على وضع عينة على طبق من ذهب الهدف MALDI وتترك لتجف لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. تراكب كل بقعة مع 1 ميكرولتر من HCCA مصفوفة تحتوي على calibrant الداخلي وتترك لcrystalize في درجة حرارة الغرفة.
  3. تسجيل قداس الأطياف
    ملاحظة: يتم الذروة قطف من أطياف الشامل باستخدام الإجراءات القياسية الموصى به (خوارزمية النقطة الوسطى، S / N نسبة: 2، يختلط عتبة كثافة: 2٪، ذروة عرض 3 م / ض، الطرح الأساسي: TopHat)
    1. معايرة الصك وفقا لprotoc الصانعينرأ.
    2. لكل بقعة، وجمع 600 الأطياف في 100 لقطات الخطوات.
      1. انتقل إلى "AutoXecute" علامة التبويب برامج التكوين من مطياف الكتلة. فتح "الطريقة" التي اليسار النقر على الزر "الطريقة" واختيار طريقة وعلى سبيل المثال، "MBT_AutoX" من القائمة المنسدلة.
      2. اليسار انقر على زر "تحرير ..." يمين القائمة "أسلوب" لفتح "AutoXecute محرر أسلوب". انتقل إلى علامة التبويب "تراكم". تعيين "تلخيص" القيمة إلى "600" و "طلقات مرضية في" قيمة _x_ "خطوات النار" إلى "100".
  4. إجراء معايرة الطيف الداخلي
    ملاحظة: أخطاء القياس دقيقة متأصلة لقياس الطيف الكتلي. اعتمادا على استخدام أداة متقطعة، ودرجة الحرارة وأداة لإعادة معايرة، قد تختلف قيم القياس التي تم الحصول عليها بين التجارب. التالية قبل قياس معايرة الأدوات و بعد قياس المعايرة الطيف إلى calibrant الداخلي هي الطريقة الأكثر دقة لضمان إمكانية المقارنة بين الطيف.
    1. تنفيذ الإجراءات التالية لكل قائمة المعايرة الذروة:
      1. بدء تشغيل مستعرض الطيف (على سبيل المثال، flexAnalysis والطيف المفتوح: القائمة "ملف" → "فتح ...")
      2. إنشاء قائمة التحكم الشامل مع ذروة calibrant: القائمة "الطريقة" → "فتح ...".
      3. اختيار الأسلوب: MBT_Standard.FAMSMethod → ​​"فتح".
      4. تحرير قداس قائمة التحكم: قم بإلغاء كل Calibrants.
      5. إضافة Calibrant الذروة في أسفل: قمة التصنيف: "Insulin_HIStag [M + H] + _ متوسط". m_z: "5808.29". التسامح [المليون]: "50". تحقق مربع Calibrant.
      6. باستثناء ما، على سبيل المثال، "قائمة calibrant MSPP".
    2. لكل الطيف، واختيار ذروة calibrant من القائمة، انقر فوق "تعيين تلقائي" ثم اضغط على "موافق".
ove_title "> 6. تحقق من إجراء المعايرة الداخلية

  1. تجريبيا تحديد كتلة بالضبط من الذروة المعايرة.
    1. إعداد مركزين مع 1 ميكرولتر الاختبار القياسية كل (الخطوة 5.1.1). تراكب الأول مع 1 ميكرولتر العادية HCCA مصفوفة، والثاني مع 1 ميكرولتر مصفوفة ارتفعت calibrant.
    2. الحصول على أطياف الشامل من (القسم 5.3) في كل بقعة، ومعايرة داخليا إلى القمم الاختبار القياسية (القسم 5.4).
    3. تراكب كل من الأطياف التي فتحها مع متصفح الطيف (على سبيل المثال، flexAnalysis والطيف المفتوح: القائمة "ملف" → "فتح ...") وإيجاد الذروة في كتلة المتوقع (الأنسولين م / ض = 5،808.29)، والتي يجب أن تكون موجودة في طيف ارتفعت calibrant، ولكن ليس في الطيف تم الحصول عليها مع المصفوفة العادية.
  2. تأكد من أن Calibrant بيك لا يتم حجبها بواسطة أي العلامات البيولوجية الأخرى للالكائن الاهتمام.
    1. إعداد مركزين (القسم 5.1) مع سلالة إشارة واوفه rlay الأول مع 1 ميكرولتر المصفوفة العادية، والثانية مع 1 ميكرولتر مصفوفة ارتفعت calibrant.
    2. الحصول على أطياف الشامل من كل المواقع (القسم 5.3) وتراكب أطياف الناجم عن فتحها مع متصفح الطيف (على سبيل المثال، flexAnalysis ومفتوحة الطيف: القائمة "ملف" → "فتح ..."). تأكد من أن ذروة calibrant واضحة للعيان في الطيف تم الحصول عليها مع مصفوفة ارتفعت ولا تحجب إشارة المتاخمة آخر. إذا لم تكن هذه هي الحالة، واختيار calibrant آخر لهذا كائن معين.
      ملاحظة: استخدام calibrant الداخلي ارتفعت يزيد بشكل كبير من الدقة لتحديد الاختلافات من الجماهير العلامات البيولوجية. باستخدام هذا الأسلوب، والفروق الجماعية وصولا الى 1 دا يمكن الكشف عنها. بدلا من ذلك، الجماهير أيضا ثابتة القادمة من الكائنات الحية يمكن أن تستخدم كما calibrants. ومع ذلك، من حيث التعريف، لا بد من النظر في جميع الجماهير المستمدة من الكائنات الحية يحتمل المتغير، ما لم يثبت خلاف ذلك.

"jove_title"> 7. تحديد العلامات البيولوجية الأيونات في سلالة المرجعي

  1. قياس الطيف الكتلي من سلالة المرجعي، وذلك باستخدام مصفوفة مسنبل مع Calibrant الداخلية.
    1. توزيع كمية بحجم رأس الدبوس من مستعمرة بكتيرية (القسم 5.1) أو 1 ميكرولتر من استخراج البروتين البكتيري (القسم 5.2) مباشرة على طبق من ذهب الموقف الهدف MALDI ( 'بقعة').
    2. تراكب كل بقعة مع 1 ميكرولتر من HCCA مصفوفة تحتوي على calibrant الداخلي وترك لوحة الهدف crystalize في درجة حرارة الغرفة (القسم 5.1.2 / 5.2.4).
    3. أطياف قياسي الشامل من سلالة المرجعية (القسم 5.3).
  2. معايرة داخليا الطيف إشارة إلى كتلة calibrant (هنا: الأنسولين في م / ض = 5،806.29)، وبعد ذلك قبل عملية الطرح الأساسي (TopHat) وتمهيد (معلمات: SavitzkyGolay، العرض: 2 م / ض، 10 دورات).
    1. بدء تشغيل مستعرض الطيف (على سبيل المثال، flexAnalysis ومفتوحة الطيف: القائمة "ملف" → "فتح .... ").
    2. اختيار الأسلوب: المنسدلة القائمة "الطريقة" → "فتح ..."، انقر بزر الماوس الأيسر على طريقة الاختيار، على سبيل المثال، "MBT_Standard.FAMSMethod" → "فتح".
    3. معايرة الطيف عن طريق اختيار "الداخلية ..." من القائمة المنسدلة "معايرة". نافذة يفتح سرد ذروة calibrant (ق) (القسم 5.4). اليسار فوق ذروة calibrant (الأنسولين) → اليسار فوق "موافق". اختيار "أطياف العملية" من "عملية" القائمة المنسدلة.
    4. لالطرح الأساسي تفعيل الطيف في قائمة الطيف في الجانب الأيمن. اختيار "طرح الطيف الكتلي الأساس" من "عملية" القائمة المنسدلة.
    5. لضمان سلاسة الطيف، وتفعيل طيف في قائمة الطيف في الجانب الأيمن. اختيار "السلس الطيف الكتلي الأساس" من "عملية" القائمة المنسدلة.
  3. من البيانات تسلسل الجينوم من سلالة مرجعية، وحساب theoreticaل monoisotopic الوزن الجزيئي من كل من البروتينات المشفرة بواسطة ترجمة تسلسل الحمض النووي في تسلسل الأحماض الأمينية المقابلة باستخدام محرر تسلسل المحاذاة. نسخ لصق هذا التسلسل البروتين في مربع الإدخال في بوابة إكسباسي المعلوماتية الحيوية الموارد (http://web.expasy.org/compute_pi/). ثم اضغط على "اضغط هنا" لحساب بي / ميغاواط. في حالة C. الصائمية SSP. doylei حساب كتلة من 14 المؤشرات الحيوية للكشف.
  4. نسخ النتائج في جدول بيانات، مع عمود واحد يحتوي على معرف الجينات والقادم الوزن الجزيئي. ترتيب الصفوف من حيث الوزن الجزيئي حساب لتسهيل أسهل بحث الجماهير. ملاحظة: أعمدة أخرى اختيارية. قد يكون الشرح وظيفية مفيدة بشكل خاص في وقت لاحق للتفسير.
  5. إدراج العمود الثاني في جدول البيانات عن الوزن الجزيئي للشكل methioninated دي، طرح 135 دا من الوزن الجزيئي monoisotopic. ملاحظة: وذلك لأن بعض البروتينات تخضع آخرالتعديل متعدية عن طريق إزالة بروتين من الميثيونين -terminal N.
  6. تعيين كل الكبرى كتلة العلامات البيولوجية المقاسة للجماهير تحسب من سلالة إشارة عن طريق البحث عن كتلة تقاس من الجدول الجينوم أعد فوق (الجدول 1).
  7. إذا لا يمكن تعيين أيونات العلامات البيولوجية لمنتجات الجين توقع، والنظر في التعديلات posttranslational الأخرى (مثيلة، أستلة، prenylation، وما إلى ذلك؛ نرى http://www.abrf.org/delta-mass لمجموعة من التعديلات والتغييرات كتلة المرتبطة ). عن أي تعديل posttranslational المعروفة الأخرى التي كثيرا ما لوحظ في الكائنات الحية من الفائدة إضافة عمود آخر إلى طاولة المفاوضات وإعادة حساب الوزن الجزيئي مماثل لعملية لشكل methioninated دي.
  8. إعداد التبويب جدول آخر، وتسجيل كل العلامات البيولوجية أيون كتلة ومعرف في عمود جدول منفصل.

8. تقييم العلامات البيولوجية التغيرفي السكان

  1. معايرة أطياف الشامل التي تم الحصول عليها من جمع يعزل، كما فعلت بالنسبة للسلالة المرجعية (ق) (القسم 5.4.2).
  2. تحديد المؤشرات الحيوية متفاوتة في أطياف الشامل. يتميز كتلة البديل بسبب عدم وجود كتلة معروفة من الطيف المرجعية وظهور كتلة جديدة غير موجودة في المرجع. الفرق الجماعية يجب أن تتفق مع تبادل حمض أميني واحد (الجدول 2)، أو مزيج منهما.
  3. في عزلة واحدة لكل صف، تسجيل كتلة تقاس لكل العلامات البيولوجية والإسوي المتوقع في أعمدة الجدول منهما.
    ملاحظة: نادرا ما، قد تكون بعض التحولات كتلة يعزى إلى عدة بورصات الأحماض الأمينية المختلفة، على سبيل المثال، على حد سواء، وتبادل N التي كتبها D و Q تبادل عن طريق البريد، والعكس بالعكس، يؤدي إلى التحول الشامل من 0.985 دا (الجدول 2). لا يمكن حل هذه المشكلة الجوهرية التي كتبها الطيف الكتلي وحدها. لذلك، الإسوية المختلفة على مستوى تسلسل البروتين ذات نفس الكتلةيجب أن تعامل على أنها نوع MSPP واحد. وأكد مواز سانجر تسلسل الجينات أيون العلامات البيولوجية الخاصة التي لا تحدث هذه المشكلة في حين MSPP-كتابة C. الصائمية SSP. doylei عزل جمع المستخدمة في هذه الدراسة.
  4. تأكيد أنواع MSPP جديدة من PCR تضخيم وتسلسل الجينات العلامات البيولوجية منها. وهذا بدوره يعمل أيضا تأكيدا أنه قد تم تعيين هوية العلامات البيولوجية بشكل صحيح.
    1. ثقافة بكتيريا يعزل في ظل ظروف النمو المثلى. ثقافة C. الصائمية SSP. doylei الضغوط على كولومبيا أجار تستكمل مع 5٪ الدم الأغنام عند 37 درجة مئوية تحت ظروف microaerophilic (5٪ O 2، 10٪ CO 2، 85٪ N 2). احتضان لكاليفورنيا. 48 ساعة. استخدام لوحة أجار منفصلة لكل عزل لتجنب انتقال التلوث.
    2. استخراج الحمض النووي الجيني من العزلات البكتيرية باستخدام المناسبة عدة استخراج الحمض النووي / الماكينات الآلية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      3. <لى> تضخيم الجينات العلامات البيولوجية منها باستخدام بادئات المدرجة في الجدول 3 تنفيذ جميع ردود الفعل PCR فقا للشروط التالية: تمسخ في 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ الصلب عند 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ استطالة عند 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
    3. تحديد تسلسل الحمض النووي من كل amplicon بواسطة سانجر تسلسل باستخدام كمية مناسبة من الحمض النووي الجيني (عادة 600-700 نانوغرام من الحمض النووي هو كاف في تركيز كاليفورنيا 100 نانوغرام / ميكرولتر) واحدة من الاشعال التضخيم (عادة ما يتم ذلك عن طريق استخدام مزود الخدمة).
  5. في جدول منفصل (انظر الجدول 4)، تسجيل تسلسل البروتين بالضد لكل الإسوي رواية باستخدام أداة الترجمة المناسبة (على سبيل المثال، Transseq: http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/) 25.

9. احسب التأريخ العرقي القائم MSPP ومقارنة لمعيار الذهب

  1. سلسلة تسلسل العلامات البيولوجية الأحماض الأمينية خاصة تابعة لرنوع كان MSPP من العزلات في تسلسل مستمر واحدة باستخدام محرر محاذاة تسلسل، مثل BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) 26 أو جدول بيانات العلامات البيولوجية.
  2. حساب نسالة التي تجمع كما حدث للبيانات الكتابة معيار الذهب، على سبيل المثال، UPGMA تجميع 21.
  3. مقارنة نسالة على أساس MSPP إلى واحد تم الحصول عليها مع معيار الذهب 4، 13.

النتائج

سابقا، أنشأنا بنجاح خطة MSPP لC. الصائمية SSP. الصائمية 13. هنا، نحن تهدف إلى توسيع الأسلوب إلى الأخوة سلالات C. الصائمية SSP. doylei. في هذا الإطار تحديدا، سبعة C. الصائمية SSP. doylei العزلات تم الحصول عليها من مجموعة من الكائنات ?...

Discussion

الخطوة الأكثر أهمية في إنشاء مخطط MSPP هي تحديد الجيني لا لبس فيه الهويات العلامات البيولوجية أيون. إذا لم يكن من الممكن تحديد العلامات البيولوجية مما لا شك فيه، ومن ثم ينبغي أن تستبعد من مخطط 13.

وC. ويشمل الصائمية SSP. ...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We are grateful to Hannah Kleinschmidt for excellent technical support. This paper was funded by the Open Access support program of the Deutsche Forschungsgemeinschaft and the publication fund of the Georg August Universität Göttingen.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
acetonitrileSigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany34967
Autoflex III TOF/TOF 200 systemBruker Daltonics, Bremen, GermanyGT02554 G201Mass spectrometer
bacterial test standard BTSBruker Daltonics, Bremen, Germany604537
BioTools 3.2 SR1Bruker Daltonics, Bremen, Germany263564Software Package
Bruker IVD Bakterial Test StandardBruker Daltonics, Bremen, Germany82901905 tubes
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, BelgiumLMG8843ATCC 49349;IMVS 1141;NCTC 11951;strain 093
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, BelgiumLMG9143Goossens Z90
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, BelgiumLMG7790ATCC 49350;CCUG 18265;Kasper 71;LMG 8219;NCTC 11847
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, BelgiumLMG9243Goossens N130
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, BelgiumLMG8871NCTC A603/87
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, BelgiumLMG9255Goossens B538
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Belgium coordinated collection of microorganisms/Laboratory of Microbiology UGent BCCM/LMG Ghent, BelgiumLMG8870NCTC A613/87
Columbia agar base Merck, Darmstadt, Germany1.10455 .0500500 g
Compass for FlexSeries 1.2 SR1Bruker Daltonics, Bremen, Germany251419Software Package
defibrinated sheep blood Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, GermanySR0051
ethanolSigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany02854 Fluka
formic acidSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyF0507
HCCA matrixBruker Daltonics, Bremen, Germany604531
Kimwipes paper tissueKimtech Science via Sigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyZ188956
MALDI Biotyper 2.0Bruker Daltonics, Bremen, Germany259935Software Package
Mast Cryobank vialsMast Diagnostica, Reinfeld, GermanyCRYO/B
MSP 96 polished steel targetBruker Daltonics, Bremen, Germany224989
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany51304
recombinant human insulinSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyI2643
trifluoroacetic acidSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyT6508
water, molecular biology-gradeSigma-Aldrich, Taufkirchen, GermanyW4502

References

  1. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  2. Bader, O. MALDI-TOF-MS-based species identification and typing approaches in medical mycology. Proteomics. 13 (5), 788-799 (2013).
  3. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
  4. Zautner, A. E., et al. Discrimination of multilocus sequence typing-based Campylobacter jejuni subgroups by MALDI-TOF mass spectrometry. BMC Microbiol. 13, 247 (2013).
  5. Reil, M., et al. Recognition of Clostridium difficile PCR-ribotypes 001, 027 and 126/078 using an extended MALDI-TOF MS system. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 30 (11), 1431-1436 (2011).
  6. Kuhns, M., Zautner, A. E., et al. Rapid discrimination of Salmonella enterica serovar Typhi from other serovars by MALDI-TOF mass spectrometry. PLoS One. 7 (6), e40004 (2012).
  7. Wolters, M., et al. MALDI-TOF MS fingerprinting allows for discrimination of major methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineages. Int J Med Microbiol. 301 (1), 64-68 (2011).
  8. Josten, M., et al. Analysis of the matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrum of Staphylococcus aureus identifies mutations that allow differentiation of the main clonal lineages. J Clin Microbiol. 51 (6), 1809-1817 (2013).
  9. Lu, J. J., Tsai, F. J., Ho, C. M., Liu, Y. C., Chen, C. J. Peptide biomarker discovery for identification of methicillin-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains by MALDI-TOF. Anal Chem. 84 (13), 5685-5692 (2012).
  10. Novais, A., et al. MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for the discrimination of high-risk Escherichia coli clones from phylogenetic groups B2 (ST131) and D (ST69, ST405, ST393). Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2014).
  11. Matsumura, Y., et al. Detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli ST131 and ST405 clonal groups by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 52 (4), 1034-1040 (2014).
  12. Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF Mass Spectrometry Strain Typing during a Large Outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), e101924 (2014).
  13. Zautner, A. E., Masanta, W. O., Weig, M., Groß, U., Bader, O. Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP): A novel microbial typing Method. Scientific Reports. 5, (2015).
  14. Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
  15. Zautner, A. E., et al. Seroprevalence of campylobacteriosis and relevant post-infectious sequelae. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (6), 1019-1027 (2014).
  16. Zautner, A. E., Herrmann, S., Groß, U. Campylobacter jejuni - The Search for virulence-associated factors. Archiv Fur Lebensmittelhygiene. 61 (3), 91-101 (2010).
  17. Dingle, K. E., et al. Multilocus sequence typing system for Campylobacter jejuni. J Clin Microbiol. 39 (1), 14-23 (2001).
  18. Dingle, K. E., et al. Molecular characterization of Campylobacter jejuni clones: a basis for epidemiologic investigation. Emerg Infect Dis. 8 (9), 949-955 (2002).
  19. Cody, A. J., et al. Real-time genomic epidemiological evaluation of human Campylobacter isolates by use of whole-genome multilocus sequence typing. J Clin Microbiol. 51 (8), 2526-2534 (2013).
  20. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol. 30 (12), 2725-2729 (2013).
  21. Jolley, K. A., Chan, M. S., Maiden, M. C. mlstdbNet - distributed multi-locus sequence typing (MLST) databases. BMC Bioinformatics. 5, 86 (2004).
  22. Verroken, A., et al. Evaluation of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Nocardia Species. J Clinl Microbiol. 48 (11), 4015-4021 (2010).
  23. El Khéchine, A., Couderc, C., Flaudrops, C., Raoult, D., Drancourt, M. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification of Mycobacteria in Routine Clinical Practice. PLoS ONE. 6 (9), e24720 (2011).
  24. Goujon, M., et al. A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI. Nucleic Acids Research. 38, 695-699 (2010).
  25. Hall, T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series. 41, 95-98 (1999).
  26. Jolley, K. A., et al. Ribosomal multilocus sequence typing: universal characterization of bacteria from domain to strain. Microbiology. 158, 1005-1015 (2012).
  27. Suarez, S., et al. Ribosomal proteins as biomarkers for bacterial identification by mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. J Microbiol Methods. 94 (3), 390-396 (2013).
  28. Teramoto, K., et al. Phylogenetic classification of Pseudomonas putida strains by MALDI-MS using ribosomal subunit proteins as biomarkers. Anal Chem. 79 (22), 8712-8719 (2007).
  29. Teramoto, K., Kitagawa, W., Sato, H., Torimura, M., Tamura, T., Tao, H. Phylogenetic analysis of Rhodococcus erythropolis based on the variation of ribosomal proteins as observed by matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry without using genome information. J Biosci Bioeng. 108 (4), 348-353 (2009).
  30. Bernhard, M., Weig, M., Zautner, A. E., Gross, U., Bader, O. Yeast on-target lysis (YOTL), a procedure for making auxiliary mass spectrum data sets for clinical routine identification of yeasts. J Clin Microbiol. 52 (12), 4163-4167 (2014).
  31. Stark, T., et al. Mass spectrometric profiling of Bacillus cereus strains and quantitation of the emetic toxin cereulide by means of stable isotope dilution analysis and HEp-2 bioassay. Anal Bioanal Chem. 405 (1), 191-201 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

116 MALDI TOF phyloproteomics ICMS SSP doylei MSPP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved