JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

Abstract

والسؤال الأساسي في بيولوجيا الخلية هو كيف يتم تنظيم أحجام الخلية وعضية. منذ فترة طويلة كان من المسلم به أن حجم النواة جداول عموما مع حجم الخلية، لا سيما خلال مرحلة التطور الجنيني عندما تحدث تخفيضات كبيرة في كل خلية والأحجام النووية. آليات تنظيم حجم النووي غير معروفة إلى حد كبير ويمكن أن تكون ذات صلة السرطان حيث حجم النووي غيرت معلمة التشخيص والنذير الرئيسية. المجراة النهج لتحديد المنظمين حجم النووية تعقيدا بسبب الطبيعة الأساسية والمعقدة من وظيفة النووية. النهج المتبع في المختبر الموصوفة هنا لدراسة مراقبة حجم النووية يستفيد من التخفيضات طبيعية في حجم النووي التي تحدث أثناء تطور المورق القيطم. أولا، يتم تجميع نوى في اكس. المورق استخراج البيض. ثم، يتم عزل هذه النوى ومعلق في السيتوبلازم من الأجنة مرحلة متأخرة. بعد 30 - فترة الحضانة 90 دقيقة، مساحة النووييقلل من 20-60٪، وتوفير الفحص المفيد تحديد مكونات هيولية الموجودة في الأجنة المرحلة المتأخرة التي تساهم في تنموي حجم النووي التحجيم. والميزة الرئيسية لهذا النهج هو مرفق النسبي الذي مقتطفات البيض والجنين يمكن التلاعب بها كيميائيا، مما يسمح للتعرف على البروتينات والأنشطة الجديدة التي تنظم حجم النووي. كما هو الحال مع أي في نهج المختبر، التحقق من النتائج في نظام في الجسم الحي هو المهم، وMicroinjection من X. الأجنة المورق مناسبة بشكل خاص لهذه الدراسات.

Introduction

أحجام العضيات الخلوية تحجيم عادة مع حجم الخلية، وهذا قد ربما أفضل موثقة لتدرج حجم النووي مع حجم الخلية 1-10. هذا صحيح بشكل خاص خلال مرحلة التطور الجنيني وتمايز الخلايا، عندما غالبا ما يلاحظ تخفيضات كبيرة في كل خلية وحجم النووي 11،12 هذا. وعلاوة على ذلك، تغيير حجم النووي معلمة رئيسية في تشخيص السرطان والتشخيص 13-17. الآليات التي تساهم في تنظيم حجم النووي غير معروفة إلى حد كبير، ويرجع ذلك جزئيا إلى التعقيد والطبيعة الأساسية للبنية النووي وظيفة. وقد تم تطوير هذا الأسلوب هو موضح هنا بمثابة فحص في المختبر لحجم النووي التحجيم التي هي قابلة للتلاعب البيوكيميائية وتوضيح آليات التنظيم حجم النووي.

القيطم المورق البيض استخراج هو نظام راسخ أن ألخص ودراسة العمليات الخلوية المعقدة في في المختبر السياق. وقد كشفت هذه مقتطفات المعلومات الأساسية الجديدة عن العديد من العمليات الخلوية بما في ذلك تجميع ووظيفة المغزل الإنقسامية، الشبكة الإندوبلازمية، ونواة 18-22. واحد الميزة الرئيسية لنظام استخراج هي أن اكس. تمثل المورق مقتطفات بيضة السيتوبلازم مخفف تقريبا التي يمكن تغييرها بسهولة، على سبيل المثال من خلال إضافة بروتينات المؤتلف أو immunodepletion التكوين. وعلاوة على ذلك، هو واحد قادرا على التعامل مع العمليات الأساسية عن طريق استخدام العلاجات التي قد تكون على خلاف ذلك قاتلة في سياق في الجسم الحي. إدخال تعديلات على إجراءات استخراج البيض تسمح لعزل مقتطفات من X. الأجنة المورق بدلا من البيض، وهذه مقتطفات الجنين قابلة بالتساوي للتلاعب البيوكيميائية 23. خلال X. المورق التنمية، والمخصبة جنين وحيدة الخلية (~ مم 1) يخضع لسلسلة من اثني عشر الانقسامات الخلوية السريعة (المراحل 1-8) لتوليد عدة آلاف من 50 μم وقطرها أصغر الخلايا وصلت إلى مرحلة تنموية يطلق الانتقال midblastula (MBT) أو مرحلة 24-26 أغسطس. تتميز الدبابة مع بداية النسخ اقحي، الهجرة الخلية، الانقسامات الخلوية غير متزامن، واقتناء مراحل الفجوة، وإنشاء أحجام ثابتة للدولة نووية بدلا من التوسع النووي المستمر كما هو الحال في الجنين قبل الدبابة. من المرحلة 4 إلى المعيدة (مراحل 10،5 حتي 12)، وحجم النواة الفردية ينخفض ​​بأكثر من 10 أضعاف (11).

هنا، فإن الهدف هو تحديد الآليات المسؤولة عن هذه التخفيضات في حجم النووي خلال التقدم التنموي. هذا النهج هو لتجميع أول نواة في اكس. المورق استخراج البيض وعزل تلك النواة من بويضة السيتوبلازم / استخراج. ثم يتم معلق هذه النوى في السيتوبلازم من الأجنة مرحلة متأخرة المعيدة. بعد فترة الحضانة، ونوى من استخراج البيض تصبح أصغر في أواخر استخراج مرحلة الجنين. نحن مسبب أن هذا عواد يكون فحص مفيدة لتحديد مكونات هيولية الموجودة في الأجنة المرحلة المتأخرة التي تساهم في تنموي حجم النووي التحجيم. باستخدام هذا الاختبار، بالإضافة إلى التحقق من صحة في الجسم الحي، أثبتنا أن بروتين كيناز C (بي كي سي) يساهم في خفض النمو في حجم النووي في اكس. المورق 23.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وأجريت كافة الإجراءات والدراسات القيطم وفقا لدليل NRC لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية 8 طبعة. تمت الموافقة على البروتوكولات من جامعة وايومنغ المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (ضمان # A-3216-01).

1. إعداد اكس. استخراج المورق البيض (مقتبس من 27،28)

  1. عاشرا الإناث رئيس المورق الضفادع لا تقل عن ثلاثة أيام ولا تزيد عن أسبوعين قبل جمع البيض مع واحد 100 وحدة دولية من حقن الحوامل موجهة الغدد التناسلية مصل الفرس (PMSG).
  2. قبل يوم واحد من التجربة، حقن الضفادع معبي مع 800 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (HCG) ومكان في 16 درجة مئوية في 1 لتر لكل ضفدع من 1 / 3X قارعو الأجراس مارك لتعديل (MMR). انظر الجدول رقم 1 لجميع التراكيب العازلة.
    ملاحظة: بعض الضفادع لا تضع بيضها أو سوف تضع بيضها نوعية رديئة. عادة 2 - يتم حقن 3 الضفادع لضمان ضفدع واحد على الأقل سيضع sufficienأرقام طن من البيض ذات نوعية جيدة. فإن متوسط ​​ضفدع وضع ما يكفي من البيض لإنتاج لا يقل عن 1 مل من استخراج البيض.
  3. إعداد 1 L 1 / 3X MMR مع الماء منزوع الأيونات المقطر البارد ([ده 2 O)، 500 مل العازلة B، 1 لتر عازلة C، 500 مل العازلة D، و 100 مل العازلة E.
  4. نقل وضع البيض إلى وعاء زجاجي بلورة (150 × 75 ملم). استخدام البلاستيك باستور الماصة مع طرف قطع، مزرعة خارج البيضاء منتفخ تنشيط البيض أو البيض هي lysed. الاحتفاظ فقط البيض مع أقطاب الحيوان الظلام متميزة ومتساوية وأعمدة نباتية بيضاء.
  5. إعداد 13 × 51 ملم أنابيب الطرد المركزي مع 1 مل من الاحتياطي E تستكمل مع 355 ميكرومتر مثبط حركة الخلايا D أضاف فقط قبل استخدامها في الخطوة 1.7.
  6. Dejelly وغسل البيض.
    1. غسل البيض لفترة وجيزة مع الباردة 1 / 3X معدل وفيات الأمهات في كوب بحجم مناسب، وتغيير المخزن المؤقت 3-4 مرات.
    2. إزالة المعاطف هلام من البيض بنسبة الحضانة مع الواق باء وهذا سوف تتخذ في أي مكان 3-10 دقيقة. كما يتم الإفراج المعاطف هلام غائم من البيضةالصورة، تغيير المخزن المؤقت.
      ملاحظة: Dejellying اكتمال عندما تظهر البيض معبأة بإحكام في زاوية الطبق عند إمالة وموجهة أعمدة نباتية أسفل. البيض أكثر هشاشة بكثير بعد dejellying، لذلك لا احتضان البيض مع B الاحتياطي لمدة أطول من يغسل اللازمة واللاحقة في حاجة إلى أن يقوم بعناية فائقة.
    3. غسل البيض لفترة وجيزة مع 3-4 التغييرات من الاحتياطي C.
    4. غسل البيض لفترة وجيزة مع 2 التغييرات من الاحتياطي د.
    5. غسل البيض لفترة وجيزة مع 2 التغييرات من الاحتياطي E.
  7. ملء أنابيب الطرد المركزي مع البيض باستخدام ماصة تتحمل الزجاج واسعة أو قطارة بلاستيكية. نضح قبالة العازلة الزائد. لتعبئة البيض وإزالة أكبر قدر ممكن عازلة، الطرد المركزي في يتأرجح دلو الدوار في 212 x ج لمدة 60 ثانية، ثم في 478 x ج لمدة 30 ثانية. نضح قبالة العازلة الزائد.
    ملاحظة: من المهم لإزالة أكبر قدر عازلة الزائد ممكن في هذه الخطوة لضمان يتم تخفيف استخراج البيض الحد الأدنى.
  8. في يتأرجح دلو الدوار، نابذة في ظل فراغ لمدة 15 دقيقة في 12000 x ج و 4 درجات مئوية لسحق البيض مفتوحة وفصل إلى طبقات مختلفة، مع السيتوبلازم يجري طبقة بلون الكهرمان في الوسط. إزالة أنابيب الطرد المركزي ومكان على الفور على الجليد.
  9. جمع استخراج.
    1. باستخدام إبرة قياس 18 و المحاقن، وثقب أنبوب الطرد المركزي فقط فوق طبقة اللون الغامق في الجزء السفلي من الأنبوب وإزالة الطبقة الوسطى هيولي بلون الكهرمان. لا نجمع أي من أعلى طبقة الدهون. جمع السيتوبلازم في أنبوب بحجم مناسب.
      ملاحظة: عموما، 1 الضفدع تنتج 1 مل على الأقل من استخراج.
    2. الملحق السيتوبلازم مع 1/1000 حجم 19.7 ملي مثبط حركة الخلايا D، 1/1000 يبلغ حجم المخزون مجلس السلام الليبيري، و1/50 حجم مزيج الطاقة 50X. عكس بلطف أنبوب إلى المزيج. لا الماصة مفرط للاستخراج.
    3. الحفاظ على استخراج على الجليد واستخدامه خلال 3 ساعة إعداد حصول على أفضل النتائج.
_title "> 2. إعداد Demembranated عاشرا المورق الحيوانات المنوية (مقتبس من 29)

ملاحظة: وحدات التخزين الداخلي المعروضة هنا هي لمدة تصل إلى 8 الخصيتين.

  1. إزالة 0.05٪ بنزوكاين (10٪ الأسهم البنزوكائين أعدت في الإيثانول والمخفف إلى 0.05٪ في خزان المياه الضفدع) من 4 درجات مئوية ودافئة لدرجة حرارة الغرفة. تخدير والتضحية من الذكور اكس. المورق الضفادع في حل البنزوكائين في درجة حرارة الغرفة ل20-30 دقيقة. ضمان الموت غياب نبضات القلب من خلال دراسة والشعور منطقة الصدر، من خلال عدم الاستجابة لالتحفيز الميكانيكي، و / أو عن طريق قطع الرأس.
  2. جعل شق على شكل حرف U على طول البطن. إزالة كتلة tubulated الهيئات الدهون الصفراء. في الجزء العلوي من الكليتين، حدد موقع الخصيتين، وهي بيضاوية الشكل الجماهير وردي شاحب حوالي 1 سم في الطول 29. استئصال الخصيتين ولفة لهم على ورقة نشاف لإزالة الدم والأنسجة الأخرى.
  3. غسل الخصيتين في الواق T. استخدام مدقة تركيبها مشددة لتخطر على الخصيتين مع 1 مل من الاحتياطيتي في أنبوب 1.5 مل حتى المتجانسة (10 السكتات الدماغية أو أكثر). الطرد المركزي 5-10 ثانية في جهاز للطرد المركزي مصغرة وجمع طاف، وإزالة قطع كبيرة من الأنسجة. كرر الطرد المركزي مرة أخرى وجمع طاف.
  4. نقل الحل التي تحتوي على الحيوانات المنوية إلى أنبوب بلاستيكي 15 مل. زيادة حجم ما مجموعه 2 مل مع الواق T. الطرد المركزي في 1411 x ج لمدة 10 دقيقة في 16 درجة مئوية لتكوير الحيوانات المنوية.
  5. إزالة طاف و resuspend بيليه في 500 ميكرولتر من الاحتياطي T. الطرد المركزي في 1411 x ج لمدة 10 دقيقة في 16 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة أو مرتين حسب الحاجة لتنظيف بيليه خلايا الدم الجسدية والأحمر.
  6. Resuspend وبيليه في 100 ميكرولتر العازلة T و 300 ميكرولتر الواق س احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: الواق S يحتوي على ليزوليسيتين، وهي المسؤولة عن demembranation.
  7. إضافة ثلاثة مجلدات من الاحتياطي R (أعدت طازجة قبل الاستخدام). عكس أنبوب تماما مرة واحدة. أجهزة الطرد المركزي في 1411 x ج لمدة 15 دقيقة في 16 و# 176؛ ج.
  8. Resuspend وبيليه في 400 ميكرولتر العازلة R ثم إضافة مبلغ إضافي 2 مل من الاحتياطي ر الطرد المركزي في 1411 x ج لمدة 15 دقيقة في 16 درجة مئوية.
  9. Resuspend وبيليه في 50 ميكرولتر العازلة T.
  10. تمييع 1 ميكرولتر demembranated نواة الحيوان المنوي مع 9 ميكرولتر العازلة T. تطبيق هذا التخفيف إلى عدادة الكريات. حساب عدد رقيقة نواة الحيوان المنوي على شكل S في كبيرة 4 × 4 شبكة واحدة، واضرب هذا الرقم في 100 للحصول على تركيز الأسهم في نواة الحيوان المنوي في ميكرولتر.
  11. تمييع الأسهم إلى 100،000 نواة الحيوان المنوي في ميكرولتر مع العازلة تي، مما أدى إلى الأسهم 200X. إعداد 3-5 مكل. تجميد فلاش في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية.

3. الجمعية النووية

  1. تكملة 100 ميكرولتر من استخراج البيض مع 1.5 ميكرولتر 35.5 ملي سيكلوهيكسيميد (تركيز نهائي ~ 0.5 ملم)، 6 ميكرولتر 20X حل سهم الكالسيوم (تركيز نهائي ~ 0.6 ملم)، و 0.7 ميكرولتر 200X الحيوانات المنوية (تركيز نهائي ~ 700الحيوانات المنوية نوى / ميكرولتر). تحجيم حجم رد الفعل صعودا أو هبوطا حسب الضرورة. عكس أو اضغط برفق لمزج.
    ملاحظة: استخراج تدوير من الطورية في الطور البيني يوفر منصة أكثر قوة وموثوق بها لتجميع النووي.
  2. احتضان في حمام مائي عند 16-20 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. مزيج من خلال استغلال بلطف كل 15 دقيقة لضمان بقاء نوى معلقة في استخراج.
  3. رصد التقدم المحرز في التجمع النووي في 45 دقيقة عن طريق إعداد الاسكواش على النحو التالي.
    1. الماصة 2 ميكرولتر من استخراج على شريحة زجاجية وإضافة 2 ميكرولتر نواة الإصلاح.
    2. تراكب مع ساترة 22 مم 2. صورة على مجهر epifluorescence استخدام المياه، والنفط، أو الهواء 20 - أهداف 100X ومرشح دابي.
      ملاحظة: الأنوية يمكن تصور بواسطة التصوير مشرق الميدان، ولكن أسهل بكثير لتصور من قبل مضان.
    3. استخدام نوى مباشرة أو قسامات فلاش التجميد في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: إضافة 4٪ الجلسرين إلى العلاقات العامة النوىIOR إلى تجميد يمكن أن تساعد على المحافظة على سلامتها. نوى المجمدة لا تزال عموما قابلة للحياة وقادرة على استيراد النووي، إلا أن عملية تجميد يمكن أن يؤدي إلى نوى الهشة تعطلت أو أكثر هيكليا. نوى مدة تصل الى عام بعد تجميد يمكن استخدامها.

4. إعداد اكس. المورق استخراج الجنين

  1. حمل اكس الإناث المورق الضفادع لوضع البيض كما هو موضح في 1.1 و 1.2.
  2. عزل الخصيتين من العاشر من الرجال المورق الضفادع كما هو موضح في 2.2. غمر الخصيتين في وسائل الاعلام L15 تستكمل مع 50 وحدة دولية / مل من البنسلين والستربتومايسين في كوب 35 طبق × 10 ملم بيتري. تخزين عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
  3. جمع وإخصاب البويضات.
    1. جمع البيض الذي تضعه حديثا من خلال عقد الضفادع على كوب قابلة لإعادة الاستخدام طبق بتري وتعزيز وضع البيض من خلال تطبيق ضغط لطيف على أسفل الظهر بالقرب من مجرور. الضغط على ضفدع من الصعب جدا يمكن أن يؤدي إلى الإصابة، مما أدى إلى البطن المنتفخ ومساuiring القتل الرحيم 29.
    2. دعم الطبق في تقريبي زاوية 45 درجة، والسماح البيض لجمع في حافة الطبق، وإزالة كافة عازلة الزائد، وإضافة ما يكفي من 1 / 3X MMR لتغطية بالكاد البيض. إخصاب البويضات خلال 15 دقيقة من جمع.
    3. استخدام مدقة تركيبها بإحكام للنقع والتجانس 1/4 من الخصية في أنبوب 1.5 مل مع 500 ميكرولتر من الملح العالية التعديل المالحة بارت (عالية الملح MBS). إضافة الخصيتين متعطنة إلى البيض ويسمح للإخصاب أن يحدث في درجة حرارة الغرفة ل15-20 دقيقة، ثم إغراق البيض مع 1 / 3X معدل وفيات الأمهات.
      ملاحظة: فعالية الخصيتين تتناقص مع مرور الزمن التخزين، وبالتالي قد تكون هناك حاجة إلى المزيد من الأنسجة الخصيتين للإخصاب ناجحة عند استخدام الخصيتين التي تم تخزينها لأكثر من أسبوع واحد.
    4. تأكيد الإخصاب عن طريق التحقق من انكماش القطب الحيواني المصطبغة الظلام ودوران الأجنة مع أقطاب حيواناتهم مواجهة، عادة حوالي 20 - 30 دقيقة بعد إضافة بصدد إجراء تجارب المجروشالصورة. نتوقع أول انشقاق الخلية تحدث في غضون 90 دقيقة.
    5. باستخدام ماصة تتحمل الزجاج واسعة بجد إزالة الميت (أبيض ومنتفخ أو التوزيع غير المتكافئ للصفار والصباغ)، هي lysed، أو بويضة غير مخصبة (أي ليس المشقوق)، لأنها من شأنها أن تحفز بسرعة الموت في الأجنة المجاورة.
    6. في أي مكان 1-2،5 ساعة بعد الإخصاب، dejelly الأجنة في 2-3٪ السيستين حلت في 1/3 س معدل وفيات الأمهات وتعدل لدرجة الحموضة 7.9 مع 10 N KOH. أداء تغييرين عازلة التي هي كل 3-4 دقائق. اغسل الأجنة مع 6-10 التغيرات وجيزة من 1 / 3X MMR لإزالة كل آثار السيستين.
      ملاحظة: الأجنة Dejellied لها الغشاء المحي وليست هشة مثل البيض dejellied.
  4. باستخدام ماصة تتحمل الزجاج واسعة، ونقل صحي المخصبة (أي المشقوق) الأجنة إلى طبق بتري تحتوي جديدة 1 / 3X معدل وفيات الأمهات والسماح لهم بتطوير إلى المرحلة المطلوبة في RT، أو إذا كان يفضل أبطأ التنمية، 16 ° C. تواصل لإزالة القتلى أو لايالأجنة سد أشارت من قبل قلة من الدرجة الأولى أو أبيض مظهر منتفخ.
  5. تحقق من مرحلة الأجنة عن طريق التحقق من الإغلاق التام تقريبا للمسم الأريمة وبمقارنة إلى رسومات من أجنة نظموا المتاحة في المواد المرجعية 24.
    ملاحظة: مثقف الأجنة في 16 درجة مئوية وتصل إلى مرحلة 11،5 حتي 12 في حوالي 12 ساعة.
  6. احتضان مرحلة 11،5 حتي 12 الأجنة في طازجة 1 / 3X MMR تستكمل مع 0.5 ملي سيكلوهيكسيميد لمدة 1 ساعة على RT، لإلقاء القبض على الأجنة في أواخر الطور البيني.
  7. نقل مع الزجاج واسعة تتحمل أو ماصة بلاستيكية لا يقل عن 15 (ويفضل أن يكون 30 أو أكثر) الأجنة القبض البيني لأنبوب microcentrifuge.
    ملاحظة: 15 الأجنة كافية لإنتاج ما يقرب من 20 ميكرولتر من استخراج. تصعيد حسب الحاجة.
  8. إضافة 1 مل العازلة البيض تحلل (ELB) تستكمل مع 1 ميكرولتر من الأسهم LPC. عكس بلطف لغسل الأجنة، تسمح الأجنة لتسقط إلى أسفل الأنبوب، وإزالة العازلة. كرر هذه الخطوة غسل مرتين أخريين.
  9. الأجنة resuspend في 500 ميكرولتر من ELB بالإضافة إلى 0.5 ميكرولتر من الأسهم LPC، 5 ميكرولتر من 19.7 ملي سيكلوهيكسيميد، و 5 ميكرولتر من 35.5 ملي مثبط حركة الخلايا D (لكبح الأكتين البلمرة). أجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 1 دقيقة في microcentrifuge الطاولة.
  10. إزالة عازلة الزائدة واستخدام مدقة لسحق تماما الأجنة. أجهزة الطرد المركزي في الدوار دلو يتأرجح لمدة 10 دقيقة في 10000 x ج و 16 درجة مئوية.
  11. ثقب طبقة الدهن من أعلى مع 200 ميكرولتر طرف الماصة. مع 200 ميكرولتر طرف الماصة نظيفة، وإزالة هيولي طبقة بلون العنبر المتوسطة إلى أنبوب الحجم المناسب.
  12. الملحق استخراج الجنين مع 1/50 حجم مزيج الطاقة 50X (لتوفير نظام تجديد ATP)، 1/100 حجم 35.5 ملم cyclohexamide، 1/500 حجم 19.7 ملي مثبط حركة الخلايا D، و 1/1000 حجم الأسهم LPC.
  13. إعداد الاسكواش كما هو موضح في 3.3 لتصور نواة الجنينية الذاتية في استخراج.
    ملاحظة: استخراج الجنين يمكن تجميد مع نوى الذاتية في هذه المرحلة. قسامة للحد من تجميد / دورات ذوبان الجليد ومخزن في -80 درجة مئوية.
  14. لإزالة النوى من استخراج الجنين، يخفف من استخراج مع حجم مساو من ELB تحتوي على 1/50 من حجم مزيج الطاقة 50X، 1/100 حجم 35.5 ملم cyclohexamide، 1/500 حجم 19.7 ملي مثبط حركة الخلايا D، و 1/1000 يبلغ حجم المخزون مجلس السلام الليبيري. أجهزة الطرد المركزي في الدوار دلو يتأرجح في 17000 x ج لمدة 15 دقيقة في 16 درجة مئوية.
  15. جمع طاف والحرص على تجنب أي الدهون المتبقية في الأعلى. لا تخل نوى مكعبات في الجزء السفلي من الأنبوب. إعداد الاسكواش كما هو موضح في 3.3 لضمان أنه تمت إزالة معظم النوى. استخدام استخراج الطازجة أو قسامة ومخزن في -80 درجة مئوية.
  16. لتسخين تعطيل استخراج الجنين لتجارب السيطرة، حرارة 30-100 مكل من استخراج عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة باستخدام cycler الحرارية. السماح للحرارة المعطل استخراج بالعودة إلى درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها.
_title "> 5. النووية تقلص الفحص والمناعي

  1. عزل نواة تجميعها في استخراج البيض عن طريق تمييع 25-150 ميكرولتر من نوى تجميعها مسبقا في 1 مل ELB في أنبوب 1.5 مل. أجهزة الطرد المركزي في 1600 x ج لمدة 3 دقائق على 4 درجات مئوية في microcentrifuge الطاولة. إزالة العازلة، والحرص على عدم تعكير صفو بيليه الهش للنواة في الجزء السفلي من الأنبوب.
  2. و resuspend نوى في حجم استخراج الجنين مساويا لحجم الأصلي للاستخراج البيض المستخدمة في 5.1. استخدام ELB أو الحرارة استخراج المعطل لردود الفعل السيطرة، حسب الاقتضاء.
  3. اضغط برفق على أنبوب لتفريق بيليه و resuspend نوى. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة، والتنصت بلطف أنبوب لخلط كل 15-30 دقيقة. ملاحظة: معظم تقلص النووي يحدث داخل 30 دقيقة الأولى.
  4. رصد التقدم المحرز في تقلص النووي من خلال إعداد والاسكواش.
    1. الماصة 2 ميكرولتر من استخراج على شريحة زجاجية وإضافة 2 ميكرولتر نواة الإصلاح.
    2. تراكب مع 22 ملم 2 ساترة. صورة على مجهر epifluorescence.
  5. اضغط على أنبوب ل resuspend نوى فقط قبل إضافة 500 ميكرولتر من تثبيتي تتكون من ELB، 15٪ الجلسرين، و 2.6٪ لامتصاص العرق. عكس فورا، ووضع أنبوب على محور دوار لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. إعداد تدور باستمرار أنابيب من تجهيز 15 مل أنابيب أسفل الزجاج جولة مع تدرج أسفل البلاستيك جولة (تصميم والخطط المتاحة عند الطلب). إضافة 5 مل من العازلة وسادة النووي. إسقاط ساترة دائرية 12 ملم في أنبوب، ويجري التأكد فإنه يضع شقة على رأس إدراج البلاستيك.
  7. طبقة بلطف محلول يحتوي على نواة ثابتة على رأس وسادة النووية باستخدام نطاق تتحمل طرف الماصة. أجهزة الطرد المركزي في الدوار دلو يتأرجح لمدة 15 دقيقة في 1000 x ج و 16 درجة مئوية.
  8. استخدام الشافطة لإزالة كافة العازلة وسحب إدراج البلاستيك إلى أعلى الأنبوب. إزالة ساترة مع زوج من ملقط غرامة، والحرص على الإشارة إلى جانب غطاءينزلق على التي كانت تغزل نوى. ما بعد الإصلاح في الميثانول البارد (المخزنة في -20 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق على RT.
  9. نقل الجانب ساترة نواة حتى على ورقة من فيلم البارافين البلاستيك بطانة طبق كبير بتري البلاستيك. وضع مناديل مبللة للتصرف على جانب الطبق لمنع الجفاف.
  10. ترطيب نوى على ساترة مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-NP40 (برنامج تلفزيوني 1X بالإضافة إلى 0.1٪ NP40) ونضح بعد 5-10 ثانية.
  11. طبقة بعناية 75 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 3٪ الأبقار مصل الزلال (BSA) على ساترة. السماح لمنع 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  12. إزالة عرقلة الحل، واحتضان مع الأجسام المضادة الأولية (على سبيل المثال، mAb414 ضد مجمع المسام النووي، 1: 1000) المخفف في برنامج تلفزيوني-3٪ BSA لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تغسل مع خمسة تغييرات فورية من برنامج تلفزيوني-NP40.
  13. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المخفف في برنامج تلفزيوني-3٪ BSA لمدة 1 ساعة على RT. تغسل مع خمسة تغييرات فورية من برنامج تلفزيوني-NP40.
  14. احتضانمع 10 ميكروغرام المخفف / مل هويشت في برنامج تلفزيوني-3٪ BSA لمدة 5 دقائق على RT. غسل خمس مرات مع برنامج تلفزيوني NP40. إزالة جميع عازلة الزائد.
  15. جبل ساترة على شريحة مع 5 ميكرولتر antifade المتوسطة المتزايدة. ختم مع طلاء الأظافر واضحة. صورة فورا باستخدام المجهر epifluorescence مع 20 - 100X أهداف أو تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة التصوير في وقت لاحق.
    ملاحظة: إجراء تقدير كما هو موضح سابقا 23.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

جمعية نوى في استخراج البيض

الخطوات الأولى من هذا البروتوكول هي لإعداد اكس. المورق استخراج البيض (بروتوكول 1) ونوى الحيوانات المنوية demembranated (بروتوكول 2). ثم يتم استخدام هذه الكواشف ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Here is presented a novel method to study mechanisms of nuclear size regulation during X. laevis development. Developmental progression is associated with dramatic changes in cell physiology, metabolism, division rates, and migration, as well as alterations in the sizes of cells and intracellular structures. These varied processes are complex and essential, so it is difficult to study just one of these aspects of development in an in vivo setting. The X. laevis embryo extract and nuclear shrink...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Members of the Levy and Gatlin labs as well as colleagues in the Department of Molecular Biology offered helpful advice and discussions. Rebecca Heald provided support in the early stages of developing this protocol. This work was supported by the NIH/NIGMS (R15GM106318) and the American Cancer Society (RSG-15-035-01-DDC).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgGMolecular ProbesA10037
ATP disodium saltSigma AldrichA2383
BenzocaineSigma AldrichE1501
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA3059
CaCl2Sigma AldrichC3306
CentrifugeBeckmanJ2-21M
Centrifuge rotorBeckmanJS 13.1
chymostatinSigma AldrichC7268
creatine phosphate disodiumCalbiochem2380
cycloheximideSigma AldrichC6255
cytochalasin DSigma AldrichC8273
disposable wipes (kimwipes)Sigma AldrichZ188956
L-cysteineSigma AldrichW326306
EGTASigma AldrichE4378
FormaldehydeSigma AldrichF8775
Glass crystallizing dish (150 x 75 mm)VWR89090-662
GlycerolMacron5094-16
HEPESSigma AldrichH4034
Hoechst - bisBenzimide H 33342 trihydrochlorideSigma AldrichB2261
HCG - Human Chorionic Gonadotropin Prospechor-250-c
L15 MediaSigma AldrichL4386
leupeptinSigma AldrichL2884
LysolecithinSigma AldrichL1381
mAb414Abcamab24609
MgCl2EMDMX0045-2
MgSO4Sigma AldrichM9397
MaltoseSigma AldrichM5885
NP40BDH56009
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710
Penicillin + StreptomycinSigma AldrichPp0781
pepstatinSigma AldrichP5318
PIPESSigma AldrichP6757
Plastic paraffin film (parafilm)Sigma AldrichP7793
KClSigma AldrichP9541
KH2PO4Mallinckrodt70100
KOHBaker5 3140
PMSG - Pregnant Mare Serum GonadotropinProspechor-272-a
NaClSigma AldrichS3014
NaHCO3FisherBP328
Na2HPO4EMDSX0720-1
NaOHEMDSX0590
PestleThomas Scientific3411D56
Round bottom glass tubes, 15 mlCorex8441
Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG)ThermoFisherA10037
sucroseCalbiochem8550
thermal cyclerBio-RadT100
UltracentrifugeBeckmanL8-80M
Ultracentrifuge rotorBeckmanSW 50.1
Vectashield (anti-fade mounting medium)VectorH-1000

References

  1. Conklin, E. Cell size and nuclear size. J. Exp. Embryol. 12, 1-98 (1912).
  2. Wilson, E. B. The Cell in Development and Heredity. , The Macmillan Company. 727-733 (1925).
  3. Levy, D. L., Heald, R. Nuclear size is regulated by importin alpha and Ntf2 in Xenopus. Cell. 143 (2), 288-298 (2010).
  4. Chan, Y. H., Marshall, W. F. Scaling properties of cell and organelle size. Organogenesis. 6 (2), 88-96 (2010).
  5. Walters, A. D., Bommakanti, A., Cohen-Fix, O. Shaping the nucleus: Factors and forces. J Cell Biochem. 113 (9), 2813-2821 (2012).
  6. Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly. J Cell Sci. 122 (Pt 10), 1477-1486 (2009).
  7. Edens, L. J., White, K. H., Jevtic, P., Li, X., Levy, D. L. Nuclear size regulation: from single cells to development and disease. Trends Cell Biol. 23 (4), 151-159 (2013).
  8. Jevtic, P., Edens, L. J., Vukovic, L. D., Levy, D. L. Sizing and shaping the nucleus: mechanisms and significance. Curr Opin Cell Biol. 28, 16-27 (2014).
  9. Levy, D. L., Heald, R. Mechanisms of intracellular scaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 113-135 (2012).
  10. Vukovic, L. D., Jevtic, P., Edens, L. J., Levy, D. L. New insights into the mechanisms and functions of nuclear size regulation. Int Rev Cell Mol Biol. 322, 1-59 (2016).
  11. Jevtic, P., Levy, D. L. Nuclear size scaling during Xenopus early development contributes to midblastula transition timing. Curr Biol. 25 (1), 45-52 (2015).
  12. Hara, Y., Iwabuchi, M., Ohsumi, K., Kimura, A. Intranuclear DNA density affects chromosome condensation in metazoans. Mol Biol Cell. 24 (15), 2442-2453 (2013).
  13. Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nat Rev Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
  14. Jevtic, P., Levy, D. L. Mechanisms of nuclear size regulation in model systems and cancer. Adv Exp Med Biol. 773, 537-569 (2014).
  15. Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
  16. Blom, J. H., Ten Kate, F. J., Schroeder, F. H., van der Heul, R. O. Morphometrically estimated variation in nuclear size. A useful tool in grading prostatic cancer. Urol Res. 18 (2), 93-99 (1990).
  17. Dey, P. Cancer nucleus: morphology and beyond. Diagn Cytopathol. 38 (5), 382-390 (2010).
  18. Cross, M. K., Powers, M. A. Learning about cancer from frogs: analysis of mitotic spindles in Xenopus egg extracts. Dis Model Mech. 2 (11-12), 541-547 (2009).
  19. Voeltz, G. K., Prinz, W. A., Shibata, Y., Rist, J. M., Rapoport, T. A. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
  20. Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
  21. Edens, L. J., Levy, D. L. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , John Wiley & Sons, Inc. 325-345 (2014).
  22. Levy, D. L., Heald, R. Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (1), a019166(2016).
  23. Edens, L. J., Levy, D. L. cPKC regulates interphase nuclear size during Xenopus development. J Cell Biol. 206 (4), 473-483 (2014).
  24. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , 2nd edn, North-Holland Publishing Company. (1967).
  25. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
  26. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
  27. Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
  28. Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nat Protoc. 1 (5), 2305-2314 (2006).
  29. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).
  30. Khan, M. A., et al. Quantitative alterations in nuclear structure predict prostate carcinoma distant metastasis and death in men with biochemical recurrence after radical prostatectomy. Cancer. 98 (12), 2583-2591 (2003).
  31. Tan, P. H., Goh, B. B., Chiang, G., Bay, B. H. Correlation of nuclear morphometry with pathologic parameters in ductal carcinoma in situ of the breast. Mod Pathol. 14 (10), 937-941 (2001).
  32. Zeimet, A. G., et al. DNA ploidy, nuclear size, proliferation index and DNA-hypomethylation in ovarian cancer. Gynecol Oncol. 121 (1), 24-31 (2011).
  33. Theerthagiri, G., Eisenhardt, N., Schwarz, H., Antonin, W. The nucleoporin Nup188 controls passage of membrane proteins across the nuclear pore complex. J Cell Biol. 189 (7), 1129-1142 (2010).
  34. Wuhr, M., et al. Evidence for an upper limit to mitotic spindle length. Curr Biol. 18 (16), 1256-1261 (2008).
  35. Loughlin, R., Wilbur, J. D., McNally, F. J., Nedelec, F. J., Heald, R. Katanin contributes to interspecies spindle length scaling in Xenopus. Cell. 147 (6), 1397-1407 (2011).
  36. Wilbur, J. D., Heald, R. Mitotic spindle scaling during Xenopus development by kif2a and importin. eLife. 2, e00290(2013).
  37. Kieserman, E. K., Heald, R. Mitotic chromosome size scaling in Xenopus. Cell Cycle. 10 (22), 3863-3870 (2011).
  38. Maresca, T. J., Freedman, B. S., Heald, R. Histone H1 is essential for mitotic chromosome architecture and segregation in Xenopus laevis egg extracts. J Cell Biol. 169 (6), 859-869 (2005).
  39. MacCallum, D. E., Losada, A., Kobayashi, R., Hirano, T. ISWI remodeling complexes in Xenopus egg extracts: identification as major chromosomal components that are regulated by INCENP-aurora B. Mol Biol Cell. 13 (1), 25-39 (2002).
  40. Goehring, N. W., Hyman, A. A. Organelle growth control through limiting pools of cytoplasmic components. Curr Biol. 22 (9), R330-R339 (2012).
  41. Du Toit, A. Development: Honey, I shrunk the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 633(2014).
  42. Buchner, K. The role of protein kinase C in the regulation of cell growth and in signalling to the cell nucleus. J Cancer Res Clin Oncol. 126 (1), 1-11 (2000).
  43. Mochly-Rosen, D., Das, K., Grimes, K. V. Protein kinase C, an elusive therapeutic target. Nat Rev Drug Discov. 11 (12), 937-957 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

114

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved