Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Abstract

كتلة يستخدم الخلوي الأجسام المضادة مترافق مع تسميات المعادن الثقيلة، وهو النهج الذي زاد بشكل كبير من عدد من المعلمات والفرص المتاحة لتحليل عميق إلى ما وراء ما هو ممكن مع تدفق القائم على مضان التقليدية الخلوي. كما هو الحال مع أي تكنولوجيا جديدة، وهناك خطوات الهامة التي تساعد على ضمان الجيل موثوق للبيانات عالية الجودة. المقدمة هنا هو بروتوكول الأمثل الذي يشتمل على تقنيات متعددة لتجهيز عينات من الخلايا لتحليل الخلوي الجماعي. سوف الأساليب المذكورة هنا تساعد المستخدم تجنب المخاطر المشتركة وتحقيق نتائج متسقة عن طريق تقليل التباين، مما قد يؤدي إلى عدم دقة البيانات. لإعلام التصميم التجريبي، وتغطي الأساس المنطقي وراء الخطوات الاختيارية أو بديلة في البروتوكول وفعاليتها في كشف نتائج جديدة في علم الأحياء من نظام يجري التحقيق فيها. وأخيرا، يتم تقديم بيانات تمثيلية لتوضيح النتائج المتوقعة من PRESENTE تقنياتد هنا.

Introduction

الخلوي تمكن من قياس وقت واحد من الأهداف الأجسام المضادة متعددة على مستوى خلية واحدة عبر أعداد كبيرة من الخلايا. في التقليدية التدفق الخلوي القائم على مضان، وعدد من المعلمات التي يمكن قياسها كميا محدودة بسبب التداخل الطيفي بين طيف الانبعاث من fluorophores متعددة، الأمر الذي يتطلب حسابات التعويضات التي تزداد تعقيدا كما يزيد عدد المعلمات. وتعالج هذه القيود من قبل كتلة الخلوي، حيث تم الكشف عن الأجسام المضادة المعادن مترافق الثقيلة وكميا من قبل وقت الرحلة (TOF) مطياف الكتلة لتوسيع كبيرة في عدد من المعلمات التي تم جمعها في وقت واحد وتسفر عن الأبعاد الشخصية نسبة عالية من البروتين وفرة لكل خلية على حدة.

فهم أساسي للعمل من كتلة الخلوي الصك هو مفيد للمستخدم، وربما تكون ضرورية لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. للحصول على وصف أكثر دقة من ضبط وتشغيل الجهاز الخلوي الجماعي،انظر المخطوطة ذات الصلة 1. لفترة وجيزة، وصفت عينة الخلية مع لجنة من الأجسام المضادة مترافق المعدنية تستهدف علامات سطح الخلية والبروتينات حشوية، والبروتينات النووية والبروتينات محددة لونين أو غيرها الحواتم الفائدة (الشكل 1I). يتم تحميل الخلايا المسمى على الجهاز، إما في وقت واحد عن طريق الحقن اليدوي أو استخدام الاوتوماتيكى أن عينات من لوحة 96-جيدا. يتم حقن الخلايا تحميلها من خلال البخاخات، والذي يولد رذاذ من قطرات سائلة التغليف الخلايا (الشكل 1ii). يتم وضع هذا الرش بحيث يتم المتأينة الخلايا عن طريق الشعلة الأرجون البلازما. هذا التأين يولد سحابة الجسيمات التي تتألف من جميع الذرات المكونة من كل خلية (الشكل 1iii). كما تنتقل هذه السحابة الجسيمات إلى كاشف، يتم فصل ذرات منخفضة الكتلة الذرية من الأيونات الشامل عالية من قبل مرشح الشامل رباعي. استمرت المتبقية أيونات جماعية عالية لكاشف، حيث abund وكميا تعصب كل النظائر (الشكل 1iv). البيانات الخام التي تم جمعها من قبل كاشف، وتحليلها من قبل كتلة البرنامج الخلوي أداة لتحديد الأحداث الخلية. لكل حدث الخلية التي تم تحديدها، وكميا إشارة الكشف في كل قناة وحفظها إلى ملف ناتج .fcs. القنوات كتلة تستخدم للكشف عن الأجسام المضادة المعادن الثقيلة مترافق يحمل الحد الأدنى من التداخل الطيفي، والتي تتراوح 0-4٪ مع معظم المساهمات أقل من 1٪. وبسبب هذا المنخفض عبر الحديث بين القنوات، وليس من الضروري عموما لتحويل البيانات مع مصفوفة التعويض أمام تحليل 2. ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر أثناء تصميم لوحة التجريبية من الأجسام المضادة للتأكد من أن الأجسام المضادة مع حاتمة عالية وفرة-لم يتم تعيين إلى قناة الجماهيرية التي تساهم إشارة إلى قناة المسندة إلى الأجسام المضادة وفرة منخفضة، لأن هذا قد خلق السكاني المرتفع بشكل مصطنع في القناة تلقي مساهمة إشارة.

الحمار = "jove_content"> إعداد الدقيق للعينات لكتلة تحليل الخلوي تعتمد اعتمادا كبيرا على أنواع العينات التي يتم جمعها والفرضية التجريبية التي يجري اختبارها. نحن نقدم أمثلة على بروتوكولين لحصاد أنواع مختلفة من الخلايا (خلايا جذعية جنينية بشرية) والخلايا الأولية (الماوس ورم الثدي الخلايا الظهارية عزل). عند بداية دراسة الخلوي الجماعي، فإنه من المستحسن أن أولا بتنفيذ تجربة رائدة صغيرة للتأكد من أن جميع البروتوكولات والأجسام المضادة ليتم الاستفادة منها تعمل بشكل جيد في يد المحقق. وهذا أمر ضروري وخصوصا عندما تكون لاستخدامها الأجسام المضادة مترافق العرف، كرد فعل تخفيض جزئي خلال تصريف الأجسام المضادة لديه القدرة على تعطيل الجسم المضاد تقارب. لذلك، يحتاج كل الأجسام المضادة مخصصة ليتم التحقق من صحتها تجريبيا لضمان دقة البيانات. وتشمل الاعتبارات الأخرى تحديد ما إذا كانت الأجسام المضادة سطح الخلية لاستخدامها في فحص ستعترف الحواتم الخاصة بهم بعد تثبيت أو إذا كانت NEإد ليتم تطبيقها على العيش الخلايا. بعض التثبيت قد منع تلطيخ السليم مع الأجسام المضادة سطح الخلية كما هو معروف أن تحدث مع الببتيد MHC تلطيخ 3 و 4. أداء سطح الخلية تلوين الأجسام المضادة على الخلايا الحية قد يكون من الضروري بالنسبة لبعض الأجسام المضادة، ولكن هذا يحول دون خيار المتوازية قبل وضع العلامات الأجسام المضادة كما يتم تنفيذ معظم الطرق المتوازية بعد تثبيت 5 على الرغم من أن القائم على الأجسام المضادة المتوازية 6 و 7 استثناء.

عند تحديد عدد الخلايا لتكون على استعداد لتحليل، فمن المهم أن نعرف أنه ليس هناك سوى جزء صغير من الخلايا تحميلها على الجهاز سوف يتم الكشف عن وإنتاج البيانات. ومن المقرر في المقام الأول إلى عدم فعالية هذه الخسارة عندما يرش على البخاخات العينة في الشعلة. فقدان في المئة الدقيقة تعتمد على كتلة الخلوي إعداد الجهاز ونوع من الخلايا ولكن يمكن أن تتراوح 50-85٪ ويجب أن تكونفي الاعتبار عند تصميم التجربة. وقد تم تحسين هذا البروتوكول لالخلايا 2x10 6 لكل عينة ولكن يمكن تكييفها لمعالجة أحجام أصغر أو أكبر عينة. هذا البروتوكول يمكن استخدامها مع الحد الأدنى من التعديلات لأحجام عينة من 1 × 06-04 أكتوبر × 10 6، ومع ذلك فمن الأهمية بمكان أن تظل حجم العينة بما يتفق ضمن التجربة. التغيرات في عدد الخلايا يمكن أن تؤثر على شدة المتوازية وتلوين الأجسام المضادة ويجب أن تبقى متسقة تقريبا عبر عينات لمقارنة مباشرة.

، ينبغي إجراء بعض الإجراءات، مثل وضع العلامات خلية ميتة ووضع العلامات DNA في الغالبية العظمى، إن لم يكن جميع التصاميم التجريبية. وضع العلامات على الخلايا الميتة في التجارب تحليل فقط علامات سطح يمكن تحقيقه باستخدام Rh103، ولكن Rh103 ينبغي تجنبها للتجارب التي تتطلب permeabilization كما أنه يؤدي إلى فقدان تلطيخ. لالتجارب التي تنطوي permeabilization، فإنه من المستحسن للاستفادة سيسبلاتين 8، وعندما يكون ذلك ممكنا، والأجسام المضادة الاعتراف PARP المشقوق أو المشقوق كاسباس للكشف عن خلايا أفكارك والميتة.

يمكن عينات المتوازية خفض استهلاك الأجسام المضادة، وانخفاض اكتساب الوقت والقضاء على عينة إلى عينة تقلب 9. عملية المتوازية ينطوي على تطبيق نموذج التعليمات البرمجية الخاصة فريدة من نوعها لجميع الخلايا، والذي يستخدم لتعيين كل خلية لنموذج المنشأ. بعد المتوازية العينات قد تكون مجمعة قبل تلوين الأجسام المضادة، وهي العملية التي تضمن ملطخة جميع العينات على حد سواء. لتقليل الخطأ التجريبي، فإنه من الحكمة أن الباركود وتجميع أي عينات التي سيتم مقارنة مباشرة مع بعضها البعض. حاليا توجد عدة طرق لالمتوازية عينات للكتلة تحليل الخلوي 5، 6، 7، يتم عرض اثنين منها هنا (انظر أدناه).

مع reagen متاح حاليانهاية الخبر أنه من الممكن تحديد وفرة من 38 أهداف الأجسام المضادة، وتحديد الخلايا في مرحلة S-10، تمييز الخلايا الحية والميتة 8 وقياس مستويات الخلايا من نقص الأكسجين 11 في تجربة المضاعفة من عينات متعددة. هذه القدرة على جمع البيانات خلية واحدة عالية المعلمة للسكان خلية كبيرة تمكن التنميط محسنة من السكان الخلية غير متجانسة للغاية وأنتجت بالفعل عددا من الأفكار البيولوجية الجديدة 12 و 13 و 14 و 15 و 16. تقطير البيانات المعقدة الناتجة على المعلومات التأويل قد يتطلب استخدام الخوارزميات الحسابية بما في ذلك شجرة الامتداد التقدم من كثافة الأحداث تطبيع (SPADE) 17 و 18 viSNE.

تقدم هذه المقالة الوصولنظرة عامة عن كيفية تصميم وتنفيذ كتلة الخلوي التجربة ويقدم التحليل الأساسي للكتلة الخلوي البيانات.

Protocol

حصاد 1. خلية

  1. حصاد الخلايا من الأنسجة الابتدائية
    ملاحظة: عملية وصفها للخلايا الحصاد من الأنسجة الأساسية هي منطبقة خصيصا على نسيج الورم الماوس الثدي وقد لا تكون قابلة للتطبيق كما هو إلى الأنسجة الأولية من مصادر أخرى.
    1. إعداد العازلة الهضم عن طريق إذابة 5 هيالورونيداز ملغ و 30 ملغ كولاجيناز في 10 مل DMEM وسائل الإعلام / F12 في كل غرام من الأنسجة لتتم معالجتها. تصفية تعقيم العازلة الهضم.
    2. عزل ورم الغدة الثديية الأساسي من الماوس وورم سجل الوزن.
    3. اللحم المفروم مع الأنسجة # 10 مشرط لمدة 5 دقائق على الأقل.
    4. إضافة الأنسجة المفروم إلى حجم مناسب من العازلة الهضم (10 مل عازلة في كل غرام من الأنسجة).
    5. هزة الأنسجة المفروم في المخزن الهضم عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 1-3 ساعة عند 37 ° C.
    6. الحصول على تعليق خلية واحدة عن طريق تمرير الخلايا من خلال 0.4 ميكرون مرشح في أنبوب 50 مل.
    7. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات. C. صب أو نضح بعناية طاف دون الإخلال بيليه.
    8. Resuspend بيليه في 4 مل DMEM / F12 ونقل إلى 5 مل أنبوب أسفل جولة.
  2. حصاد الخلايا من زراعة الأنسجة
    1. غسل لوحة أو قارورة من الخلايا الملتصقة مع الكالسيوم والمغنيسيوم فوسفات الحرة مخزنة المالحة (PBS) في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: تقنية وصفها للخلايا الحصاد غير منطبقة خصيصا على متمسكا خلايا ثقافة الإنسان الخلايا الجذعية الجنينية (HESC). ومع ذلك، فإن ما تبقى من بروتوكول صفها قابلة للتطبيق على نطاق واسع إلى خطوط أخرى مثقف الخلايا، وخطوط غير ملتصقة والخلايا الأولية.
    2. إضافة تحسنت (37 ° C) التربسين أو غيرها كاشف الهضم الأنزيمي الأمثل لتحقيق تعليق خلية واحدة من الخلايا الملتصقة. اتبع بروتوكول الشركة الصانعة.
      ملاحظة: التربسين وغيرها من الكواشف تفارق الأنزيمية لديها القدرة على التأثير في علامات الخلوية.
    3. احتضان لوحة في 37° C لمدة 2-5 دقيقة لفصل الخلايا. للثقافات confluency عالية، اضغط بلطف لوحة للمساعدة في فصل الخلايا.
    4. نقل خلايا منفصلة تماما عن لوحة في 5 مل أنبوب الجولة القاع والماصة بلطف باستخدام الماصة 1 مل لفصل الخلايا.
      ملاحظة: للحصول على تجهيز عدد كبير من العينات يمكن بدلا من ذلك أن يقوم جميع الخطوات في 96 جولة جيدا لوحة أسفل. لتجهيز العينات في شكل جيد 96 جميع يغسل لا يمكن أن يؤديها في وحدة من 250 ميكرولتر. أحجام هو موضح في الخطوات الأخرى يمكن تعديلها بحيث لا يتجاوز إجمالي حجم 300 ميكرولتر.
    5. إخماد كاشف الهضم الأنزيمي مع وجود مخزن مؤقت المساواة غسل حجم (0.5٪ BSA و 0.02٪ أزيد الصوديوم في PBS).
      ملاحظة: أزيد الصوديوم هو مادة كيميائية خطرة. يجب مراعاة احتياطات السلامة المناسبة لإعداده والتعامل معها.
    6. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. صب أو نضح بعناية طاف دون الإخلال بيليه.
    7. إعادة تعليقالخلايا في وسائل الإعلام الحرة 1 مل مصل.
    8. عدد الخلايا عن طريق نقل 10 ميكرولتر من تعليق خلية إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. تمييع قسامة إلى نسبة معروفة باللون الأزرق التريبان ونقل إلى عدادة الكريات أو النظام الآلي عد الخلايا.
  3. وضع العلامات من سكان S-المرحلة
    ملاحظة: إذا S-مرحلة وضع العلامات ليست التي يتعين القيام بها المضي قدما لوقف 1.4.
    1. إعداد 1 مل من 10 ميكرومتر 5-يودو-2'-deoxyuridine (إيدو) في المصل F12 DMEM الحرة أو غيرها من وسائل الإعلام المناسبة لكل 2 × 10 6 خلايا ليتم تحليلها.
    2. إضافة 500 ميكرولتر من 10 ميكرومتر تعاطي المخدرات بالحقن في وسائل الإعلام الحرة المصل لكل 2 × 10 6 خلايا.
      ملاحظة: على الرغم من إيدو وضع العلامات لا يمكن أن يؤديها في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل الدم، والبروتين مجانا تتفاعل مع سيسبلاتين، ومنع وضع العلامات المناسبة من الخلايا الميتة. إذا تم استخدام وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل خلال تعاطي المخدرات بالحقن وصفها خطوة غسيل إضافية هي وسائل الإعلام الحرة في الدم ضروري لإزالة بروتينات مصل قبل سيسبلاتين الحية / ستا الميتining.
    3. إعادة تعليق بلطف الكريات مع 1 مل الماصة.
    4. احتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع هزاز لطيف.
  4. الحي / الميت الوسم
    1. لكل عينة إعداد 500 ميكرولتر من 50 ميكرومتر سيسبلاتين في المصل خالية DMEM-F12 أو نوع من الخلايا وسائل الإعلام المناسبة.
      ملاحظة: إذا وضع العلامات من السكان S-مرحلة من الوحدة الداخلية ليست التي يتعين القيام بها، وعينات إعادة تعليق بتركيز 4 × 10 6 خلية / مل. إعادة التعليق الخلايا قبل أن يضيف سيسبلاتين يمكن خلط أسرع من الحلول لزي العيش / وضع العلامات ميتا.
    2. إضافة 500 ميكرولتر من 50 ميكرومتر سيسبلاتين في 2 × 10 6 خلايا لعينات.
    3. يحضن في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 دقيقة على شاكر المداري مع الخلط المستمر.
    4. إخماد سيسبلاتين مع حجم مساو من غسل العازلة.
    5. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في RT. صب أو نضح بعناية طاف دون الإخلال بيليه.
    6. غسل العينات مرتينمع 500 ميكرولتر غسل العازلة لإزالة سيسبلاتين الزائدة.
    7. غسل العينات مرتين مع 500 ميكرولتر PBS لإزالة البروتين الزائد.
  5. تثبيت عينة
    1. عينة resuspend في 500 ميكرولتر PBS.
    2. إضافة حجم مساو من 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني لتركيز النهائي من 2٪، ماصة لخلط.
      ملاحظة: إعداد 4٪ PFA جديدة من مسحوق، وضبط درجة الحموضة إلى 6.9 ويمر عبر مرشح 0.44 ميكرون. 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. تجنب الفورمالين ولم يضف المتوفرة في أمبولات، ما لم يتم اختباره بوجه خاص، لأنها غالبا ما تحتوي على ملوثات المعادن التي قد تتداخل مع قنوات كتلة محسوبة. تركيز أقل من PFA قد تكون كافية وتساعد على تقليل تأثير تثبيت على الضد ملزمة ولكن يجب اختبار تجريبيا.
    3. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT على شاكر المداري مع الخلط المستمر.
    4. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. صب أو نضح بعناية واي طافthout إزعاج بيليه.
    5. غسل العينات مع PBS لإزالة الحل PFA.
      ملاحظة: في هذه الخطوة يمكن تخزين العينات لفترة وجيزة في 4 درجات مئوية. تخزين لفترات طويلة في 4 درجات مئوية قد يؤدي إلى تدهور العينة وانخفض تلطيخ.

2. المتوازية

ملاحظة: في حين يتم تقديم منهجية لاستخدام monoisotopic المتوازية سيسبلاتين والبلاديوم المتوازية في وقت واحد، إما يمكن استخدامها بشكل مستقل أو تجنبها تماما إذا لم يكن مطلوبا من قبل التجربة.

  1. Monoisotopic سيسبلاتين المتوازية
    ملاحظة: بما ينبغي أن تؤخذ المتوازية سيسبلاتين وسيسبلاتين لايف / تلطيخ الميت تعتمد على تداخل الرعاية القنوات لضمان الخلفية سيسبلاتين لايف / تلطيخ الميت في الخلايا الحية تم تصغير لأن ذلك قد تتداخل مع دقة الباركود سيسبلاتين.
    1. تمييع 1 ملم سيسبلاتين monoisotopic الحلول الأسهم إلى 200 ميكرومتر في برنامج تلفزيوني.
    2. للبريدمنظمة العمل ضد الجوع سيسبلاتين فريدة الباركود إعداد أنبوب 1.5 مل مع 500 ميكرولتر PBS لكل 2 × 10 6 خلايا المستقبلة التي الباركود.
    3. لإعداد كل الباركود فريدة من نوعها إضافة كل سيسبلاتين monoisotopic تنطبق على تركيز النهائي من 200 نانومتر.
    4. Resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في 2 × 10 6 خلايا.
    5. إضافة حجم مساو من الحل الباركود المقابلة لكل عينة.
    6. احتضان العينات عند RT لمدة 5 دقائق على شاكر المداري مع الخلط المستمر.
    7. إخماد سيسبلاتين مع حجم مساو من غسل العازلة.
    8. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. صب أو نضح بعناية طاف دون الإخلال بيليه.
    9. غسل العينات مرتين مع العازلة غسل 500 ميكرولتر لإزالة سيسبلاتين الزائدة.
  2. البلاديوم المتوازية
    ملاحظة: البلاديوم الكواشف المتوازية يمكن أن تكون مستعدا 5 أو شراؤها تجاريا.
    1. عابرة جزئيةpermeabilization 19
      ملاحظة: البلاديوم عملية إزالة معدن ثقيل المتوازية تتطلب permeabilization الجزئي للالكواشف بالمرور عبر غشاء الخلية، وتسمية بقوة الخلية.
      1. غسل العينات مع 500 ميكرولتر PBS.
      2. غسل العينات مع 500 ميكرولتر PBS زائد 0.02٪ سابونين.
      3. بيليه resuspend في حجم المتبقية.
    2. تطبيق البلاديوم المتوازية.
      1. تمييع الأسهم 100X من البلاديوم المتوازية كاشف في 1 مل من الجليد الباردة PBS زائد 0.02٪ سابونين.
      2. بسرعة إضافة كاشف المتوازية المخفف لنموذج معلق.
      3. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT على شاكر المداري في مع الخلط المستمر.
      4. غسل العينات مرتين مع 500 ميكرولتر غسل العازلة.

3. خلية تلطيخ السطح

ملاحظة: الخلية تلطيخ السطح يمكن القيام بها على الخلايا الحية قبل التثبيت. قد يكون هذا ضروريا للأجسام المضادة التي تفقد تقارب للtheiحاتمة ص بعد التثبيت. قد يستفيد بعض عينات من الخلايا من حجب إضافية، مثل حجب التيسير لكريات الدم البيضاء، وذلك قبل وضع العلامات الأجسام المضادة للحد من الخلفية. حجب الأمثل ينبغي أن تحدد تجريبيا لنوع عينة محددة.

  1. إعداد سطح الخلية لوحة تلوين الأجسام المضادة.
    1. الجمع بين 0.5 ميكرولتر، أو العزم تجريبيا كمية من كل 0.5 ملغ / مل الأجسام المضادة سطح الخلية لكل عينة في أنبوب 1.5 مل. إضافة العازلة غسل إذا لزم الأمر لجعل حجم ما يصل الى 10 ميكرولتر لكل عينة. مزيج من قبل pipetting.
      ملاحظة: تحديد تخفيف العمل لكل الأجسام المضادة قبل تجربة تجريبيا من تجربة المعايرة.
    2. تقسيم سطح الخلية تجمع الأضداد على قدم المساواة في واحدة أنبوب 1.5 مل لكل عينة لتكون ملطخة.
    3. إعداد 500 ميكرولتر من غسل العازلة في أنبوب 1.5 مل لكل عينة.
  2. تطبيق الخلية تلطيخ السطح لعينات في حجم تطبيع لجميع العينات.
    ملاحظة: لENSلدى عودتهم الأجسام المضادة ثابت الوسم عبر عينات متعددة أنه أمر حيوي للسيطرة بعناية حجم العينة وتركيز الأجسام المضادة. وتهدف الخطوات التالية لتحقيق هذا الاتساق عن طريق ضمان أن أحجام العينة النهائية بعد تمت إضافة الجسم المضاد موحدة.
    1. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. صب أو نضح بعناية طاف دون الإخلال بيليه.
    2. مع مجموعة ماصة 200 ميكرولتر إلى 50 ميكرولتر، وإزالة حل ما تبقى من عينة بيليه ونقل إلى أنبوب تجمع الأضداد سطح الخلية aliquoted.
    3. ماصة لكافة السائل في أنبوب قسامة دون سحب الهواء في تلميح ماصة.
    4. في حين عقد المكبس ماصة لتجنب سحب الهواء نقل معلومات سرية إلى أنبوب المعدة من 500 ميكرولتر غسل العازلة والافراج عن المكبس.
    5. إضافة إلى الوراء محتويات طرف ماصة للعينة و resuspend العينة في السائل مع pipetting لطيف.
    6. احتضان هذه العينات ل1ساعة عند RT على شاكر المداري مع الخلط المستمر.
    7. غسل العينات مرتين مع العازلة غسل 500 ميكرولتر لضمان أن جميع الأجسام المضادة الحرة وجرفت.
    8. غسل العينات مع 500 ميكرولتر PBS.
    9. إعادة تعليق بيليه خلية في 500 ميكرولتر PBS.
    10. إضافة حجم مساو من 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني. ماصة لخلط.
    11. احتضان لمدة 10 دقيقة على شاكر المداري.

4. خلية Permeabilization وبين الخلايا تلطيخ

  1. permeabilization الخلية
    1. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. صب أو نضح بعناية طاف دون الإخلال بيليه.
    2. إعادة تعليق الخلايا في حجم المتبقية قبل vortexing بلطف حتى يتم فصلها بيليه.
      ملاحظة: عدم فصل الخلايا قبل مضيفا أن MeOH ينتج في الخلايا الانضمام معا وإنتاج طبقة رقيقة الأمر الذي سيؤدي إلى فقدان عينة جزئية.
    3. على الفور إضافة 1 مل من٪ MeOH 100 في 2 × 10 6 </ sup> في الخلايا وبلطف ماصة للمزيج.
      ملاحظة: طرق permeabilization أخرى يمكن أن تكون بديلا عن MeOH وقد يكون ضروريا لتحقيق permeabilization الأمثل لبعض أنواع الخلايا. لبعض المصادر خلية 0.1٪ تريتون X-100، 0.2٪ توين-20 أو 0.1٪ سابونين في حل PBS لpermeabilization قد حفاظ على سلامة الخلايا بشكل أفضل حين لا يزال توفير permeabilization ثابت.
    4. احتضان عينات لا يقل عن 1 ساعة أو حتى مدة أقصاها 24 ساعة عند 4 درجة مئوية لمدة permeabilization.
      ملاحظة: في هذه الخطوة العينات في MeOH يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 1 في الشهر في -80 ° C.
    5. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. صب أو نضح بعناية طاف دون الإخلال بيليه.
    6. إضافة 1 مل من غسل العازلة لكل مل MeOH تستخدم لpermeabilize العينة. إعادة تعليق بلطف بيليه الخلية.
    7. غسل العينة مرتين مع 500 ميكرولتر غسل العازلة.
  2. إعداد الخلايا لوحة تلوين الأجسام المضادة.
    1. الجمع بين 0.5 ميكرولتر، أو العزم تجريبيا كمية من كل 0.5 ملغ / مل الأجسام المضادة الخلايا في العينة إلى أنبوب 1.5 مل. إضافة العازلة غسل إذا لزم الأمر لجعل حجم ما يصل الى 10 ميكرولتر لكل عينة. مزيج من قبل pipetting.
    2. تقسيم تجمع الأجسام المضادة الخلايا على قدم المساواة في واحدة أنبوب 1.5 مل لكل عينة.
    3. إعداد 500 ميكرولتر من غسل العازلة في أنبوب 1.5 مل لكل عينة.
  3. تطبيق تلطيخ الخلايا لعينات في حجم تطبيع لجميع العينات.
    ملاحظة: لضمان وضع العلامات الأجسام المضادة متناسقة عبر عينات متعددة من المهم جدا للسيطرة بعناية حجم العينة وتركيز الأجسام المضادة.
    1. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. صب أو نضح بعناية طاف دون الإخلال بيليه.
    2. مع 200 ميكرولتر ماصة لتعيين 50 ميكرولتر إزالة ما تبقى من الحل عينة بيليه ونقل إلى أنبوب تجمع الأضداد سطح الخلية aliquoted.
    3. ماصةفوق كل السائل في أنبوب قسامة دون سحب الهواء في تلميح ماصة.
    4. في حين عقد المكبس ماصة لتجنب سحب الهواء نقل معلومات سرية إلى أنبوب المعدة من 500 ميكرولتر غسل العازلة والافراج عن المكبس، ووضع غسل العازلة لحجم العينة ما مجموعه 50 ميكرولتر.
    5. إضافة إلى الوراء محتويات طرف ماصة للعينة و resuspend العينة في السائل مع pipetting لطيف.
    6. احتضان هذه العينات لمدة 1 ساعة على RT على شاكر المداري مع الخلط المستمر.
    7. غسل العينات مرتين مع 500 ميكرولتر غسل العازلة.
    8. غسل العينات مع 500 ميكرولتر PBS.

5. إيريديوم وسم

  1. عينات الإصلاح
    1. عينات resuspend في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
    2. إضافة 500 ميكرولتر من 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني.
    3. احتضان لمدة لا تقل عن 15 دقيقة في RT على شاكر المداري مع الخلط المستمر.
  2. تطبيق وضع العلامات إيريديوم من DNA
    1. تمييع 125 ميكرومتر 500X الايريديوم الإقحام كاشف في 4٪ PFA في برنامج تلفزيوني إلى تركيز 62.5 نانومتر.
    2. إضافة 500 ميكرولتر 62.5 نانومتر إيريديوم PFA حل لعينات.
      ملاحظة: للحصول على التجارب باستخدام الخلايا permeabilized، يخفف من 500X الأسهم Ir191 / 193 لتخفيف النهائي من 1: 2000 لتجنب overstaining.
    3. احتضان لمدة 15 دقيقة في RT على شاكر المداري مع الخلط المستمر.
      ملاحظة: إذا كان أداء monoisotopic المتوازية سيسبلاتين لا احتضان عينات مع الايريديوم لمدة أطول من 15 دقيقة منذ إشارات Ir193 قوية يمكن أن تسهم في قناة الجماهيرية Pt194 وتؤثر سلبا على نوعية المتوازية.
    4. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. صب أو نضح بعناية طاف دون الإخلال بيليه.
    5. غسل العينات مرتين مع 500 ميكرولتر 0.1٪ BSA في الماء منزوع الأيونات تصفيتها.
      ملاحظة: بمجرد إعداد نوصي تشغيل العينات في غضون 24 ساعة إن أمكن. قد يتم تخزين العينات المعدة على المدى القصير عند 4 درجات مئوية،ولكن ينبغي الحرص على تجنب تدهور. إذا كان ذلك ممكنا يجب أن يتم تنفيذ يغسل النهائية في الماء منزوع الأيونات تصفيتها دون BSA حيث سيؤدي ذلك إلى تقليل ترسب على غرفة الرش والعينات المخاريط الجهاز الذي سيقلل التنظيف الصك. لhESCs من الضروري لتنفيذ هذه يغسل في حين بما في ذلك BSA لتجنب فقدان عينة من الالتصاق على سطح الأنبوب.

6. إعداد عينات لاكتساب

  1. عدد الخلايا
    1. Resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر 0.1٪ BSA في الماء منزوع الأيونات تصفيتها وتصفية في أنبوب جديد من خلال سقف مصفاة 35 ميكرومتر الخلية.
      ملاحظة: تخفيض مستوى BSA ليغسل النهائية يقلل من بقايا اليسار على الخلوي البخاخات الشامل. الخلايا غير ملتصقة يمكن غسلها ومعلق في الماء منزوع الأيونات تصفيتها.
    2. عدد الخلايا عن طريق نقل 10 ميكرولتر من تعليق خلية إلى أنبوب microcentrifuge. تمييع قسامة إلى نسبة معروفة فيالتريبان الأزرق (للمساعدة مع التصور الخلية) ونقل إلى عدادة الكريات أو النظام الآلي عد الخلايا.
    3. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. صب أو نضح بعناية طاف دون الإخلال بيليه.
  2. إعداد وعينات الحمل
    1. لإعداد حبات معايرة إزالة من الثلاجة ويهز بقوة لإعادة تعليق.
    2. في حالة تشغيل العينات باستخدام كتلة الخلوي الاوتوماتيكى، إضافة 50 ميكرولتر من الخرز المعايرة إلى كل بئر من لوحة عينة ثم إضافة العدد المطلوب من الخلايا لتحليلها. في حالة تشغيل عينات عن طريق الحقن اليدوي إضافة 50 ميكرولتر من الخرز المعايرة لعينة، وتمييع العينة في الماء منزوع الأيونات تصفيتها، وتخلط جيدا وعينة الحمل في القداس عينة الخلوي ميناء الحقن. قد تختلف العينة التخفيف المناسبة تبعا لنوع الخلية التي يجري تحليلها، ولكن التخفيف من 10 6 عموما المناسب 1.

النتائج

بروتوكول المعروضة هنا يمكن تطبيقها على نطاق واسع لمجموعة متنوعة واسعة من عينات خلايا مستنبتة والابتدائية مع تعديلات طفيفة فقط. تبعا لمتطلبات التجربة، فإنه لا يمكن أن يؤديها بطريقة نموذجية عند بعض العناصر، مثل المتوازية أو سطح الخلية تلطيخ، ليست ض?...

Discussion

بروتوكول المقدمة هنا قد استخدمت بنجاح لمعالجة مختلف خطوط مثقف الخلايا (H1 و H9 hESCs، mESCs، MCF7، HEK 293، KBM5، HMEC، MCF10a) وعينات الأنسجة الابتدائية (الماوس نخاع العظام، والماوس الكبد الجنينية، والكبار الماوس الكبد والورم الماوس). بغض النظر عن المصدر، أي نوع من الأنسجة التي يمكن فص...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Work in the Barton lab was supported by a grant from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP110471). This research was supported in part, by a training grant fellowship for Ryan L. McCarthy from the National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299. The core facility that maintains and runs the mass cytometry machine is supported by CPRIT grant (RP121010) and NIH core grant (CA016672).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
mTeSR1 medium kitStem Cell technologies05850Warm at room temperature before use
DMEM F-12ThermoFisher11330-032Warm at 37°C before use
AccutaseStem Cell technologies07920Warm at 37°C before use
Bovine serum albuminEquitechBAH62
phosphate buffered salineHycloneSH30256.01
SaponinSigma-Aldrich47036
Cell ID Pt194FluidigmProvided at 1mM
Cell ID Pt195FluidigmProvided at 1mM
Cell ID Pt196FluidigmProvided at 1mM
CisplatinEnzo Life SciencesALX-400-040-M250Soluble to 25mg/ml in DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Barcoding KitFluidigm201060
5-Iodo-2'-deoxyuridineSigma-AldrichI7125Soluble to 74mg/ml in 0.2N NaOH
Rhodium 103 intercelating agentFluidigm201103A
MethanolFisherBP1105-4Chill at -20°C before use
Sodium AzideSigma-AldrichS2002
5ml round bottom tubesFalcon352058
5ml 35um filter cap tubesFalcon352235
EQ four element calibration beadsFluidigm201078
Hyaluronidase Type I-SSigma-AldrichH3506
Collagenase from Clostridium histolyticumSigma-AldrichC9891
Disposable Scalpel #10Sigma-AldrichZ69239

References

  1. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. J Vis Exp. , e4398 (2012).
  2. Leipold, M. D. Another step on the path to mass cytometry standardization. Cytometry A. 87, 380-382 (2015).
  3. Newell, E. W., et al. Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization. Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).
  4. Leong, M. L., Newell, E. W. Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).
  5. Zunder, E. R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).
  6. Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry A. 87, 369-374 (2015).
  7. Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).
  8. Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry A. 81, 467-475 (2012).
  9. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3, 361-368 (2006).
  10. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81, 552-566 (2012).
  11. Edgar, L. J., et al. Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry. Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).
  12. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
  13. Horowitz, A., et al. Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry. Sci Transl Med. 5, 208ra145 (2013).
  14. Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).
  15. Han, L., et al. Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells. Cytometry A. 87, 346-356 (2015).
  16. Bendall, S. C., et al. Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development. Cell. 157, 714-725 (2014).
  17. Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).
  18. Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).
  19. Behbehani, G. K., et al. Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining. Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).
  20. Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83, 483-494 (2013).
  21. Chester, C., Maecker, H. T. Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data. J Immunol. 195, 773-779 (2015).
  22. Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data. Methods. 82, 55-63 (2015).
  23. Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).
  24. van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizaing Data using t-SNE. J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).
  25. Kling, J. Cytometry: Measure for measure. Nature. 518, 439-443 (2015).
  26. Gregori, G., et al. Hyperspectral cytometry. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).
  27. Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry A. 81, 456-466 (2012).
  28. Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).
  29. Frei, A. P., et al. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nat Methods. 13, 269-275 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

122 multiparametric

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved