JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ذبابة الفاكهة والنظم المكونة للدم الثدييات تشترك في العديد من السمات المشتركة، مما يجعل ذبابة الفاكهة نموذجا جذابا الجيني لدراسة تكون الدم. نحن هنا لشرح تشريح والتركيب من الجهاز المكونة للدم اليرقات كبيرا لالمناعية. وصفنا أيضا أساليب لفحص مختلف الأجزاء المكونة للدم اليرقات بما في ذلك تعميم hemocytes وخلايا الكريستال اطئة.

Abstract

وجود العديد من أوجه الشبه بين ذبابة الفاكهة والنظم المكونة للدم الثدييات، على الرغم من ذبابة الفاكهة تفتقر إلى النسب اللمفاوية التي تميز مناعة التكيف الثدييات. ذبابة الفاكهة وتكون الدم الثدييات تحدث في مراحل متميزة مكانيا وزمانيا لإنتاج العديد من الأنساب خلايا الدم. كلا النظامين الحفاظ على خزانات الأسلاف خلايا الدم التي لتوسيع أو استبدال الأنساب ناضجة. ويسمح هذا النظام للدم ذبابة الفاكهة والثدييات للرد على والتكيف مع التحديات المناعية. الأهم من ذلك، هي الحفاظ على المنظمين النسخي ومسارات إشارات التي تتحكم في توليد والصيانة وظيفة من وظائف نظام المكونة للدم من الذباب إلى الثدييات. هذه التشابهات تسمح ذبابة الفاكهة لاستخدامها في التنمية المكونة للدم نموذجية وراثيا والمرض.

نحن المقايسات التفاصيل هنا لدراسة نظام المكونة للدم من يرقات ذبابة الفاكهة. فيعلى وجه الخصوص، ونحن الخطوط العريضة أساليب لقياس أعداد خلايا الدم وتركيز، تصور النسب ناضجة محددة في الجسم الحي، وتنفيذ المناعية على خلايا الدم في الدورة الدموية وفي الجهاز المكونة للدم. ويمكن لهذه المقايسات تكشف التغيرات في التعبير الجيني والعمليات الخلوية بما في ذلك إشارات والبقاء والانتشار، والتمايز، ويمكن استخدامها لتحقيق مجموعة متنوعة من الأسئلة المتعلقة تكون الدم. جنبا إلى جنب مع الأدوات الوراثية المتاحة في ذبابة الفاكهة، هذه المقايسات يمكن استخدامها لتقييم نظام المكونة للدم على تغيرات جينية محددة. في حين لم المبينة على وجه التحديد هنا، يمكن لهذه المقايسات أن تستخدم أيضا لدراسة تأثير التغيرات البيئية، مثل العدوى أو النظام الغذائي، وعلى نظام المكونة للدم.

Introduction

تبقى الآليات المعقدة التي تنظم عوامل النسخ ومسارات إشارات التي تنسق تطوير نظام المكونة للدم والتي عطل في الأمراض الدموية غير مفهومة. هذه عوامل النسخ ومسارات إشارات، فضلا عن تنظيمها، وحفظها للغاية بين ذبابة الفاكهة وتكون الدم في الثدييات 1-5. وهكذا يمثل نظام المكونة للدم ذبابة الفاكهة نموذجا الجيني ممتازة لتحديد الآليات الجزيئية التي تتحكم تكون الدم والأمراض الدموية الكامنة.

على غرار الثدييات، ذبابة الفاكهة توليد خلايا الدم، وتسمى hemocytes، في مراحل متميزة مكانيا وزمانيا تكون الدم. تقليديا، كان يعتقد ذبابة الفاكهة تكون الدم أن يقتصر على مراحل في الأديم المتوسط الجنينية وفي الغدة الليمفاوية اليرقات. توفر الدراسات التي أجريت مؤخرا أدلة على أن يحدث تكون الدم أيضا في CLU اطئة اليرقاتsters والكبار البطن 6-8. جميع المراحل المكونة للدم تنتج نوعين من hemocytes ناضجة: plasmatocytes والخلايا وضوح الشمس. Plasmatocytes هي مثل بلعم الخلايا المشاركة في البلعمة، والحصانة الفطرية، والتئام الجروح. خلايا الكريستال تحتوي الموالية للphenoloxidases اللازمة لالتصبغ، وهو رد فعل المستخدمة في الاستجابات المناعية الحشرات والتئام الجروح. تكون الدم اليرقات يمكن أن تولد الثالث ناضجة نوع كرية دموية، ودعا lamellocyte، ردا على بعض التحديات المناعة مثل طفيل العدوى دبور 9،10. Lamellocytes هي كبيرة، الخلايا الملتصقة التي تعمل بالتعاون مع plasmatocytes والخلايا وضوح الشمس، لتغليف وتحييد البيض دبور ضعت في يرقات ذبابة الفاكهة. في غياب التطفل، لم يتم العثور lamellocytes في البرية من نوع اليرقات. الجماهير الميلانية تشبه melanized والبيض دبور مغلفة. العديد من سلالات ذبابة الفاكهة متحولة تطوير الجماهير الميلانية في غياب التطفل. وجود lamellocytes و / أو الجماهير الميلانية يمكن أن يكون مؤشرا على التشوهات الجنينية. في الواقع، لقد تم استخدام النمط الظاهري الشامل الميلاني لتحديد الجينات والممرات المشتركة في تكون الدم 11-14.

نظام المكونة للدم اليرقات هو درس أكثر على نطاق واسع حتى الآن. وهي تتألف من hemocytes المتداولة في الدملمف، مجموعات كرية دموية اطئة نمط تحت إهاب، وhemocytes المقيمين في الغدة الليمفاوية. الغدة الليمفاوية هو عبارة عن سلسلة من الفصوص الثنائية تعلق على سفينة الظهرية. وينقسم كل فص الرئيسي للغدة الليمفاوية إلى ثلاث مناطق رئيسية. ومن المعروف أن منطقة الأبعد كما في منطقة القشرية ويحتوي بتاريخ استحقاق hemocytes. ويطلق على منطقة أعمق في منطقة النخاع وتتألف من السلائف كرية دموية هادئة. المنطقة الثالثة، وسط الخلفي يشير، هي مجموعة صغيرة من الخلايا الموجودة في قاعدة للغدة الليمفاوية والتي تكون بمثابة الجذعية تشبه الخلايا المتخصصة. العمل في وقت مبكر إنشاء الوظائف الحيوية للالشق 15-18 ، القنفذ 19،20، JAK-STAT 18، والنشاط مجنح 21 لتنظيم تطوير الغدة الليمفاوية اليرقات. وقد أثبتت الدراسات الحديثة أن BMP 22، جمعية جيل المستقبل الراس 23، وفرس النهر 24،25 إشارات تعمل أيضا في الغدة الليمفاوية اليرقات.

أربعة فحوصات للدم اليرقات المذكورة هنا تصف 1) قياس تعميم تركيز كرية دموية، الذي يعرف بأنه عدد من الخلايا لكل وحدة حجم، 2) عزل وتحديد تعميم hemocytes لالمناعية، 3) تصور خلايا الكريستال في الجسم الحي، و4) تشريح، وتحديد، وتصاعد الغدد الليمفاوية المناعية. هذه المقايسات ويمكن استخدام قراءات للدم لتقييم الوظائف وأنظمة مسارات الإشارات في نظام المكونة للدم اليرقات. في حين استخدمت هذه الأساليب في السابق في هذا المجال، وقد بدأت وثائق بصرية من هذه المقايسات إلا في الآونة الأخيرة 8،26-30. العديد من المنشورات المذكورة هنا هي مساعدةالموارد فول تصف أساليب مماثلة وعلامات المكونة للدم 26،31-33. بالإضافة إلى ذلك، عجلا وفايكنغ هي علامات مفيدة للغشاء الليمفاوية الغدة الطابق السفلي.

Protocol

1. تعميم تركيز كرية دموية

  1. للحصول على يرقات تقريبا المرحلة التنموية نفسها لهذا الاختبار، وتقييد جمع البيض من خلال السماح للإناث لوضع البيض لفترة زمنية محددة من 2-6 ساعة.
  2. جمع اليرقات في تشريح الآبار طبق مليئة 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، الجدول 1).
  3. لكل يرقة، ضع 10 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X في أنبوب microcentrifuge على الجليد و 10 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X على وسادة تشريح نظيفة. وضع لوحة تشريح على قاعدة مجهر تشريحي مضيئة.
  4. تجف يرقة الفردية عن طريق وضعها على أنسجة مسح قبل نقله إلى انخفاض في برنامج تلفزيوني على لوحة التشريح.
  5. باستخدام زوج من الملقط، المسيل للدموع بلطف فتح وبعناية عكس بشرة للافراج عن الدملمف.
    ملاحظة: احرص على عدم كشط أو طعن في إهاب لأن هذا الأمر قد تفرج hemocytes اطئة 29.
  6. باستخدام الماصة، وجمع الدملمف من لوحة تشريح. تجنب شاركllecting الحطام اليرقات مثل الدهون في الجسم.
  7. إضافة الدملمف إلى أنبوب microcentrifuge ومزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
    ملاحظة: عدة عينات يمكن جمعها في وقت واحد، وأبقى على الجليد لمدة تصل إلى ساعة واحدة.
  8. اختياري: مزيج التريبان الأزرق مع عينة الدملمف بمقادير متساوية لصبغ واستبعاد الخلايا الميتة. عدد الخلايا داخل 3 دقائق إضافة التريبان الأزرق لأنها سامة للخلايا.
  9. خلط عينة من pipetting صعودا وهبوطا قبل تحميل 10 ميكرولتر في غرفة عدادة الكريات.
  10. في حالة استخدام عداد خلية الآلي، ووضع معايير مناسبة لحجم الخلية ودائرية. على سبيل المثال، وضع حد أدنى للحجم الخلية من 2 ميكرون، والحد الأقصى لحجم الخلية من 22 ميكرون، والدوران في حلقة مفرغة من 75-80٪ استدارة للكشف عن العادية، hemocytes الجولة 34. تجربة مع معايير مختلفة للكشف عن hemocytes أكبر وعلى شكل مغزل، مثل lamellocytes. بدلا من ذلك، استخدم عدادة الكريات لحساب hemocytes يدويا.

2. سي آي آرculating كرية دموية المناعية

  1. للحصول على يرقات تقريبا المرحلة التنموية نفسها لهذا الاختبار، وتقييد جمع البيض من خلال السماح للإناث لوضع البيض لفترة زمنية محددة من 2-6 ساعة.
  2. وضع ساترة واحد في كل بئر من لوحة 6- أو 12 أيضا.
    ملاحظة: coverslips مربع (22 ملم) يصلح في 6 لوحات جيدا وcoverslips الجولة (18 مم) يصلح في لوحات ال 12 أيضا.
  3. جمع اليرقات في تشريح الآبار طبق مليئة برنامج تلفزيوني 1X.
  4. ضع 5 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X في وسط كل ساترة.
  5. وضع لوحة على قاعدة مجهر تشريحي مضيئة.
  6. تجف يرقة الفردية على أنسجة مسح ثم ضع في برنامج تلفزيوني على ساترة.
  7. باستخدام زوج من الملقط، المسيل للدموع بلطف وعكس بعناية بشرة. قبل إزالة الذبيحة اليرقات، واستخدامها لنشر الدملمف بالتساوي.
    ملاحظة: احرص على عدم كشط أو طعن في إهاب لأن هذا الأمر قد تفرج hemocytes اطئة 29.
  8. Repeaر لجميع اليرقات، وجمع الدملمف من يرقة واحدة في ساترة. السماح hemocytes التمسك لل coverslips لمدة 5 - 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة RT لا تتجاوز 30 دقيقة قبل التثبيت.
  9. إصلاح hemocytes بإضافة 5 ميكرولتر من 7.5٪ الفورمالديهايد (الجدول 1) إلى كل ساترة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  10. غسل coverslips ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1X. تلميح لوحة ونضح برنامج تلفزيوني بعد كل غسل. لمنع الاعادة من حل permeabilization في الخطوة التالية، استخدام الشافطة لإزالة الزائدة برنامج تلفزيوني من محيط لل coverslips.
  11. إضافة 100 permeabilization ميكرولتر حل (الجدول 1) إلى كل ساترة لمدة 20 دقيقة في RT.
  12. تلميح والاستفادة بلطف لوحة لنضح حل permeabilization.
  13. تمييع الأجسام المضادة الأولية مع حل الأجسام المضادة (الجدول 1) وفقا لمواصفات مقدم الخدمة. إضافة ما لا يقل عن 500 ميكرولتر حل الأجسام المضادة الأولية لcoverslips في لوحات 12-جيدا.إضافة 1.5 مل على الأقل في 6 لوحات جيدا. احتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
  14. إزالة حل الأجسام المضادة الأولية وغسل coverslips مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 10 دقيقة على شاكر المداري، ثلاث مرات.
  15. تمييع الضد الثانوية مع حل الأجسام المضادة وفقا لمواصفات مقدم الخدمة. إضافة 500 على الأقل حل الضد الثانوية ميكرولتر إلى coverslips في لوحات 12-جيدا. إضافة 1.5 مل على الأقل ل6 لوحات جيدا. احتضان لمدة لا تقل عن 2 ساعة على RT.
  16. إزالة حل الأجسام المضادة الثانوية وغسل coverslips مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 10 دقيقة على شاكر المداري كما في الخطوة 2.10، ثلاث مرات.
  17. خلال خطوات غسل، ميكروسكوب نظيفة الشرائح مع 70٪ من الإيثانول (الجدول 1) باستخدام مناديل الأنسجة. لكل ساترة، ومكان 5 ميكرولتر تصاعد عازلة (الجدول 1) على شريحة زجاجية.
    ملاحظة: اثنان coverslips احتواءه على شريحة واحدة.
  18. نضح غسل برنامج تلفزيوني النهائي.
  19. استخدام الملقط لإزالة بعناية لل coverslips من لوحات ومكان، الجردerted، على رأس المخزن المؤقت في تصاعد مستمر.
    ويمكن تخزين الشرائح المجهر في 4 درجات مئوية قبل التصوير: مذكرة. الوقت الأقصى للتخزين يعتمد على استقرار الأجسام المضادة المستخدمة. 6- و12-جيدا لوحات يمكن أن تشطف وإعادة استخدامها.

3. في فيفو كريستال التصبغ خلية

  1. للحصول على يرقات تقريبا المرحلة التنموية نفسها لهذا الاختبار، وتقييد جمع البيض من خلال السماح للإناث لوضع البيض لفترة زمنية محددة من 2-6 ساعات.
  2. قبل البداية، وضع مصدر التدفئة في 60 درجة مئوية.
    ملاحظة: برنامج cycler الحرارية من 60 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة (تليها 25 درجة مئوية الانتظار) يعمل بشكل أفضل، ولكن حمام مائي أو غيرها من مصدر التدفئة غير كاف طالما يتم توزيع الحرارة باستمرار وبشكل متساو على كل يرقة.
  3. جمع اليرقات في تشريح الآبار طبق مليئة برنامج تلفزيوني 1X (الجدول 1).
  4. في وقت واحد، تجف اليرقة على الأنسجة مسح ومكان في الجزء السفلي من أنبوب PCR. ضع كل يرقةفي أنبوب PCR منفصل. (انظر الشكل 3A).
  5. للحصول على نتائج متسقة، وضمان بقاء اليرقات في الجزء السفلي من الأنابيب PCR التي تقشعر لها الأبدان اليرقات في الأنابيب عند 4 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة و / أو بلطف التنصت الأنابيب قبل التدفئة.
  6. وضع أنابيب PCR في cycler الحرارية (أو حمام مائي). الحرارة عند 60 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  7. إزالة بعناية اليرقات من الأنابيب PCR في تشريح الآبار طبق مليئة 1X جديدة برنامج تلفزيوني.
  8. اليرقات الجافة على الأنسجة مسح وترتيب على سطح مستو للتصوير تحت مجهر تشريحي.
  9. تسجيل الصور من اليرقات عمياء من قبل الأفراد متعددة.

4. اليرقات الليمفاوية الغدة المناعية

ملاحظة: يقع الغدة الليمفاوية طول ثلث تقريبا من نهاية الأمامي من يرقة أقل قليلا من الدماغ على الجانب الظهري. (انظر السهم في الشكل 3B). والغدة الليمفاوية الأجنحة السفينة الظهرية وتشريح أكثر سهولة تعلق على هوو الفمكانساس أو إلى الدماغ. النوع البري والغدد الليمفاوية الطور الثالث هي هياكل صغيرة للغاية. فصوص الأولية ما يقرب من 100-200 ميكرون في الطول. (انظر الشكل 4A).

  1. للحصول على يرقات تقريبا المرحلة التنموية نفسها لهذا الاختبار، وتقييد جمع البيض من خلال السماح للإناث لوضع البيض لفترة زمنية محددة من 2-6 ساعة.
  2. الليمفاوية الغدة تشريح
    1. لكل حالة تجريبية، إضافة 1 مل برنامج تلفزيوني 1X (الجدول 1) إلى جانب واحد من 24 لوحة جيدا.
    2. إضافة 1 قطرة من 0.1٪ PBST (الجدول 1) إلى كل بئر باستخدام الماصة نقل المتاح.
      ملاحظة: يتم إضافة المنظفات مثل توين 20، لخفض التوتر السطحي، والسماح للأنسجة لتنزل الى قاع البئر.
    3. وضع لوحة مسطحة على الجليد.
    4. جمع اليرقات في تشريح الآبار طبق مليئة برنامج تلفزيوني 1X.
    5. وضع وسادة تشريح نظيفة على قاعدة مجهر تشريحي مضيئة. استخدام الماصة نقل المتاح لوضع األصغرل يسقط بنسبة 0.01٪ PBST (الجدول 1) على لوحة. نقل يرقة واحدة إلى انخفاض PBST للتشريح.
    6. عقد اليرقة مع زوج واحد من الملقط ما يقرب من طول ربع من نهاية الخلفي، الظهري حتى الجانب.
    7. استخدام زوج آخر من ملقط للاستيلاء على بشرة الأمامية فورا إلى ملقط التي يتم عقد اليرقة. سحب بلطف إهاب نحو نهاية الأمامي حتى يتعرض السنانير الفم.
      ملاحظة: إن الهدف من ذلك هو لقشر بشرة من دون إزعاج أي الهياكل الداخلية.
    8. الافراج عن بشرة واستخدام كل ملقط لقطع اليرقة في البلدين. إزالة نهاية الخلفي من انخفاض PBST.
      ملاحظة: إذا لم بشرة قشر على طول الطريق إلى الفم السنانير، وقطع اليرقة في اثنين وإزالة نهاية الخلفي. استخدام زوج واحد من ملقط لعقد حافة بشرة، واستخدام زوج آخر من ملقط لدفع السنانير الفم من خلال فتح. وهذا عكس بشرة وفضح السنانير الفم. هذا ويمكن استخدامها بوصفها alternأكل طريقة تشريح كذلك.
    9. استخدام زوج واحد من ملقط ليتعرفوا على بشرة (إما إهاب بطني وظهري رفرف بشرة، أو كليهما) لتحقيق الاستقرار.
    10. استخدام زوج آخر من ملقط للاستيلاء على السنانير الفم المكشوفة وسحب بلطف بها.
      ملاحظة: هذا فصل إهاب من الهياكل الداخلية. من الناحية المثالية، العين / أقراص تخيلي antennal والدماغ والغدة حلقة، والغدة الليمفاوية المحيطة السفينة الظهرية سوف لا تزال تعلق على السنانير الفم.
    11. في حين لا يزال يمسك السنانير الفم، وإزالة بعناية الهياكل غير المرغوب فيها مثل الغدد اللعابية، الدهون في الجسم، والأمعاء.
      ملاحظة: إذا كان يفصل الدماغ من السنانير الفم، قد لا تزال تعلق الغدة الليمفاوية والتي تم جمعها مع الدماغ. في هذه الحالة، وعقد الحبل العصبي البطني بدلا من السنانير الفم.
    12. عن طريق الفم السنانير أو الحبل العصبي البطني كمقبض، ونقل مجمع تشريح تحتوي على الغدة الليمفاوية إلى البئر على الجليد. لا تتجاوز 30 دقيقةقبل التثبيت.
  3. تثبيت والمناعية
    1. وضع لوحة 24 جيدا على قاعدة مجهر تشريحي.
    2. استخدام ماصة P200 لإزالة بعناية PBST من البئر.
      ملاحظة: فارغة والآبار المجاورة مفيدة لإيداع النفايات بشكل مؤقت.
    3. إضافة بلطف 200 ميكرولتر 3.7٪ الفورمالديهايد (الجدول 1) أسفل الجانب من البئر ودوامة لوحة للتأكد من أن الأنسجة تشريح وغرقت تماما.
    4. العودة لوحة من الثلج لمدة 30 دقيقة. إذا الغدد الليمفاوية تعبر عن بروتين فلوري (الصورة)، والحفاظ على لوحة مغطاة لمنع photobleaching من.
    5. استخدام ماصة P200 لإزالة بعناية تثبيتي.
    6. غسل بإضافة 200 ميكرولتر 1X برنامج تلفزيوني إلى البئر ووضع لوحة على شاكر المداري لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. استخدام ماصة P200 لإزالة بعناية برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: الثابتة الغدد الليمفاوية يمكن أن تترك على الجليد في برنامج تلفزيوني حتى الغدد الليمفاوية ليتم د كل الظروف التجريبيةissected والثابتة.
    7. تكرار غسل الخطوات مرتين أخريين.
    8. إضافة 200 ميكرولتر permeabilization حل (الجدول 1) إلى البئر. تعيين لوحة على شاكر المداري لمدة 45 دقيقة في RT.
      ملاحظة: 45 دقيقة هو "المعيار الذهبي" لpermeabilization الغدة الليمفاوية ولكن واضعي لها النجاح بعد دقيقة فقط 20.
    9. إزالة الحل مع ماصة P200.
    10. تمييع الأجسام المضادة الأولية مع حل الأجسام المضادة (الجدول 1) وفقا لمواصفات مقدم الخدمة. إضافة 300 ميكرولتر حل الأجسام المضادة الأولية إلى البئر والتأكد من أن الأنسجة تشريح وغرقت تماما. احتضان عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
    11. استخدام ماصة P200 لإزالة الأجسام المضادة الأولية.
    12. غسل بإضافة 200 ميكرولتر 1X برنامج تلفزيوني إلى البئر ووضع لوحة على شاكر المداري لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استخدام ماصة P200 لإزالة بعناية برنامج تلفزيوني.
    13. تكرار غسل الخطوات مرتين أخريين.
    14. تمييع الثانويntibody مع حل الأجسام المضادة وفقا لمواصفات مقدم الخدمة. إضافة 300 ميكرولتر حل الأجسام المضادة الثانوية إلى البئر والتأكد من أن الأنسجة تشريح وغرقت تماما. احتضان على شاكر المداري على الأقل 2 ساعة على RT.
    15. استخدام ماصة P200 لإزالة الأجسام المضادة الثانوية، ويغسل كما هو موضح في خطوات 4.3.12 و 4.3.13. لا تقم بإزالة برنامج تلفزيوني بعد غسل النهائي.
  4. الليمفاوية تركيب الغدة
    1. ميكروسكوب نظيفة الشرائح باستخدام الايثانول 70٪ (الجدول 1) ومناديل الأنسجة.
    2. لكل حالة تجريبية، وضع قطرة واحدة من تصاعد عازلة (الجدول 1) على شريحة زجاجية.
      ملاحظة: شرطين احتواءه على شريحة واحدة. تصاعد حجم عازلة يعتمد على عدد من الغدد الليمفاوية ليتم تحميلها. استخدام 2 ميكرولتر لحوالي 18-20 الغدد الليمفاوية، 1 ميكرولتر ل10-12، و 0.5 ميكرولتر لمدة 5 أو أقل.
    3. ضع شريحة المجهر على قاعدة مجهر تشريحي مضيئة.
    4. لمدة تصل إلى شرطين في وقت واحد، نقل جميع الغدد الليمفاوية من البئر إلى المخزن المؤقت المتصاعدة مع ملقط، وذلك باستخدام خطاطيف الفم أو الحبل العصبي البطني كمقبض.
    5. مساحة الأنسجة تشريح بالتساوي في شكل دائري أو مستطيل، ونشر عازلة متزايدة في هذه العملية.
    6. لكل من أنسجة تشريح، كل على حدة، مرر تونغ واحد من ملقط تحت السفينة الظهرية وسحب بلطف باتجاه محيط المخزن المؤقت في تصاعد مستمر.
      ملاحظة: هذا رسم الليمفاوية الغدة من بقية أنسجة تشريح وتتسطح الغدة الليمفاوية على الزجاج.
    7. باستخدام ملقط واحدة من الملقط واقتراح نشر، قطع السفينة الظهرية بين الغدة الليمفاوية والمخ.
    8. نقل باقي أنسجة تشريح إلى الجانب الآخر من الغدة الليمفاوية، في الحافة الخارجية من المنطقة العازلة.
      ملاحظة: الأنسجة تشريح غير المرغوب فيها سوف تشكل في نهاية المطاف محيط حول الغدد الليمفاوية، ويكون بمثابة دعم على حركتيح وساترة الراحة.
    9. كرر حتى يتم فصل كل من الغدد الليمفاوية من الأنسجة تشريح، حجز واحدة من أنسجة تشريح غير المرغوب فيها وضعها في المركز.
    10. اتخاذ ساترة بين إصبعين. تأكد من أن ساترة خالية من الغبار وبصمات الأصابع. إذا لزم الأمر، واستخدام الأنسجة مسح و 70٪ من الإيثانول لتنظيف ساترة.
    11. ضمان حافة ساترة موازية لحافة الشريحة الزجاجية، وانخفاض بعناية ساترة على المخزن المؤقت في تصاعد مستمر.
      ويمكن تخزين الشرائح المجهر في 4 درجات مئوية قبل التصوير: ملاحظة. الوقت الأقصى للتخزين يعتمد على استقرار الأجسام المضادة المستخدمة. 24 لوحات بشكل جيد يمكن أن تشطف وإعادة استخدامها.

5. التصوير

  1. صورة ثابتة hemocytes وشنت الغدد الليمفاوية على مضان القياسية المناسب أو المجهر متحد البؤر في 20X أو أعلى التكبير وفقا لدليل التشغيل المصنعة. صورة يرقات كاملة على الوقوفمجهر تشريحي ARD في 2X التكبير وفقا لدليل التشغيل المصنعة.
  2. اتبع تعليمات مقدم البرنامج لdeconvolution، إذا رغبت في ذلك.
حل تركيب تخزين تعليقات
برنامج تلفزيوني 1X 200 ملغم / لتر كلوريد البوتاسيوم درجة حرارة الغرفة
200 ملغم / لتر فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة
8000 ملغم / لتر كلوريد الصوديوم
1150 ملغم / لتر فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة
O 2 درهم
مثبت 3.7٪ أو 7.5٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني 1X درجة حرارة الغرفة في الظلام الفورمالديهايد السامة.
حل Permeabilization / مخفف الأجسام المضادة 0.4٪ تريتون 4 ° C تستخدم الصيغة القياسية 0.4٪ تريتون ولكن واضعي تستخدم 0.1٪ توين 20 مع النجاح. استخدام لتمييع الأجسام المضادة الأولية والثانوية وفقا لتركيزات أوصى مقدمي الخدمة.
5٪ الزلال البقري في الدم، وطبيعي مصل الماعز، أو المصل حمار عادي
برنامج تلفزيوني 1X
70٪ من الإيثانول 70٪ من الإيثانول 200 الإثبات في dH2O ما درجة حرارة الغرفة
عازلة تصاعد 0.5٪ N-بروبيل غالاتي 4 درجات مئوية في الظلام N-بروبيل غالاتي هو ضار. دابي هو المغير.
الجلسرين 80٪
اختياري: 1 ميكروغرام / مل دابي (4، 6 diamidino-2-phenylindole)
برنامج تلفزيوني 1X
0.1٪ PBST 0.1٪ توين 20 في برنامج تلفزيوني 1X درجة حرارة الغرفة
0.01٪ PBST 01:10 التخفيف من 0.1٪ PBST درجة حرارة الغرفة

الجدول 1. الحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.

النتائج

تعميم كرية دموية تركيز

زيادة أعداد كرية دموية طوال نمو اليرقات 35. لتوضيح أن هذه الطريقة بالكشف عن الاختلافات في الأرقام كرية دموية والتركيز، وبغض النظر عن سبب بيولوجي، قمنا بقياس تركيزات ?...

Discussion

على التعديل الوراثي أو البيئة، والطرق الأربعة الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم بشكل فردي أو بالاشتراك لتحليل العمليات متميزة خلال تكون الدم مثل الإشارات والبقاء والانتشار، والتمايز ذبابة الفاكهة تكون الدم هو عملية ديناميكية؛ عدد hemocytes لكل حيوان يزيد 35 و هيكل ...

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح متنافسة أو المالية.

Acknowledgements

We thank Matthew O'Connell, Maryam Jahanshahi, and Andreas Jenny for assistance. We thank István Andó for plasmatocyte-specific antibodies, Utpal Banerjee for dome-meso-EBFP2 flies, Julian Martinez-Agosto for antp>GFP flies, and Michael O'Connor for ptth and ptth>grim flies. These methods were developed with support by the Kimmel Foundation, the Leukemia & Lymphoma Society, NIH/NCI R01CA140451, NSF 1257939, DOD/NFRP W81XWH-14-1-0059, and NIH/NCI T32CA078207.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
PBS tabletsMP Biomedicals2810305
dissecting dishCorning7220-85
microcentrifuge tubeDenvilleC2170
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kitKrayden (distributed through Fisher)NC9644388 (Fisher catalog number)Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions.
stereomicroscopeMorrell Instruments (Nikon distributor)mna42000, mma36300Nikon models SMZ1000 and SMZ645
tissue wipeVWR82003-820
forcepsElectron Microscopy Sciences72700-DZ
p200 pipetteEppendorf3120000054
Countess Automated Cell CounterInvitrogenC10227
Countess cell counting chamber slidesInvitrogenC10283
hemocytometerHausser Scientific3200
trypan blue stainLife TechnologiesT10282
formaldehydeFisherBP531-500
TritonFisherBP151-500
Tween 20FisherBP337-500
bovine serum albuminRocky Mountain BiologicalsBSA-BSH-01K
normal goat serumSigmaG9023-10ML
normal donkey serumSigmaD9663-10ML
200 proof ethanolVWRV1001
N-propyl gallateMP Biomedicals102747
glycerolVWREM-4750
DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole)Fisher62248
6-well plateCorning351146
12-well plateCorning351143
microscope cover glass, 22 mm squareFisher12-544-10
microscope cover glass, 18 mm circularFisher12-545-100
glass microscope slidesFisher22-034-980
thermal cyclerEppendorfE950010037Mastercycler EP Gradient S
PCR tubesUSA Scientific1402-2700
24-well plateCorning351147
disposable transfer pipetFisher13-711-9AM
fluorescence microscopeZeissAxio Imager.Z1

References

  1. Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5 (5), 673-690 (2003).
  2. Crozatier, M., Meister, M. Drosophila haematopoiesis. Cell Microbiol. 9 (5), 1117-1126 (2007).
  3. Crozatier, M., Vincent, A. Drosophila: a model for studying genetic and molecular aspects of haematopoiesis and associated leukaemias. Dis Model Mech. 4 (4), 439-445 (2011).
  4. Gold, K. S., Bruckner, K. Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates. Exp Hematol. 42 (8), 717-727 (2014).
  5. Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).
  6. Ghosh, S., Singh, A., Mandal, S., Mandal, L. Active hematopoietic hubs in Drosophila adults generate hemocytes and contribute to immune response. Dev Cell. 33 (4), 478-488 (2015).
  7. Leitao, A. B., Sucena, E. Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation. Elife. 4, (2015).
  8. Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Bruckner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138 (24), 5379-5391 (2011).
  9. Crozatier, M., Ubeda, J. M., Vincent, A., Meister, M. Cellular immune response to parasitization in Drosophila requires the EBF orthologue collier. PLoS Biol. 2 (8), 196 (2004).
  10. Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4805-4809 (2009).
  11. Minakhina, S., Steward, R. Melanotic mutants in Drosophila: pathways and phenotypes. Genetics. 174 (1), 253-263 (2006).
  12. Bina, S., Wright, V. M., Fisher, K. H., Milo, M., Zeidler, M. P. Transcriptional targets of Drosophila JAK/STAT pathway signalling as effectors of haematopoietic tumour formation. EMBO Rep. 11 (3), 201-207 (2010).
  13. Avet-Rochex, A., et al. An in vivo RNA interference screen identifies gene networks controlling Drosophila melanogaster blood cell homeostasis. BMC Dev Biol. 10, 65 (2010).
  14. Rodriguez, A., et al. Identification of immune system and response genes, and novel mutations causing melanotic tumor formation in Drosophila melanogaster. Genetics. 143 (2), 929-940 (1996).
  15. Mandal, L., Banerjee, U., Hartenstein, V. Evidence for a fruit fly hemangioblast and similarities between lymph-gland hematopoiesis in fruit fly and mammal aorta-gonadal-mesonephros mesoderm. Nat Genet. 36 (9), 1019-1023 (2004).
  16. Grigorian, M., Mandal, L., Hakimi, M., Ortiz, I., Hartenstein, V. The convergence of Notch and MAPK signaling specifies the blood progenitor fate in the Drosophila mesoderm. Dev Biol. 353 (1), 105-118 (2011).
  17. Lebestky, T., Jung, S. H., Banerjee, U. A Serrate-expressing signaling center controls Drosophila hematopoiesis. Genes Dev. 17 (3), 348-353 (2003).
  18. Krzemien, J., et al. Control of blood cell homeostasis in Drosophila larvae by the posterior signalling centre. Nature. 446 (7133), 325-328 (2007).
  19. Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. A Hedgehog- and Antennapedia-dependent niche maintains Drosophila haematopoietic precursors. Nature. 446 (7133), 320-324 (2007).
  20. Benmimoun, B., Polesello, C., Haenlin, M., Waltzer, L. The EBF transcription factor Collier directly promotes Drosophila blood cell progenitor maintenance independently of the niche. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), 9052-9057 (2015).
  21. Sinenko, S. A., Mandal, L., Martinez-Agosto, J. A., Banerjee, U. Dual role of wingless signaling in stem-like hematopoietic precursor maintenance in Drosophila. Dev Cell. 16 (5), 756-763 (2009).
  22. Pennetier, D., et al. Size control of the Drosophila hematopoietic niche by bone morphogenetic protein signaling reveals parallels with mammals. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3389-3394 (2012).
  23. Dragojlovic-Munther, M., Martinez-Agosto, J. A. Extracellular matrix-modulated Heartless signaling in Drosophila blood progenitors regulates their differentiation via a Ras/ETS/FOG pathway and target of rapamycin function. Dev Biol. 384 (2), 313-330 (2013).
  24. Ferguson, G. B., Martinez-Agosto, J. A. Yorkie and Scalloped signaling regulates Notch-dependent lineage specification during Drosophila hematopoiesis. Curr Biol. 24 (22), 2665-2672 (2014).
  25. Milton, C. C., et al. The Hippo pathway regulates hematopoiesis in Drosophila melanogaster. Curr Biol. 24 (22), 2673-2680 (2014).
  26. Evans, C. J., Liu, T., Banerjee, U. Drosophila hematopoiesis: Markers and methods for molecular genetic analysis. Methods. 68 (1), 242-251 (2014).
  27. Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68 (1), 116-128 (2014).
  28. Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response. J Vis Exp. (63), e3347 (2012).
  29. Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
  30. Rizki, M. T. M., Rizki, R. M. Functional significance of the crystal cells in the larva of Drosophila mekmogaster. Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 5, 235-240 (1959).
  31. Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, 95-111 (2007).
  32. Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis. Development. 132 (11), 2521-2533 (2005).
  33. Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism. Int J Dev Biol. 54 (6-7), 1117-1125 (2010).
  34. Rizki, T. M., Rizki, R. M. Properties of the Larval Hemocytes of Drosophila-Melanogaster. Experientia. 36 (10), 1223-1226 (1980).
  35. Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. Postembryonic hematopoiesis in Drosophila. Dev Biol. 230 (2), 243-257 (2001).
  36. McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic hormone regulates developmental timing and body size in Drosophila. Dev Cell. 13 (6), 857-871 (2007).
  37. Reimels, T. A., Pfleger, C. M. Drosophila Rabex-5 restricts Notch activity in hematopoietic cells and maintains hematopoietic homeostasis. J Cell Sci. 128 (24), 4512-4525 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

117

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved