تطبيق الحواجز غير نفاذ جنبا إلى جنب مع المرشح عامل الخرز غارقة لدراسة إشارات الاستقرائي في الفرخ

Summary

Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

Abstract

يوفر الجنين الفرخ نموذجا الفقاريات رائعة التي يمكن استخدامها لتشريح الأسئلة التنموية بطريقة مباشرة. إمكانية الحصول عليها ومتانة بعد التدخل الجراحي هي نقاط القوة التجريبية الرئيسية. وكانت لوحات الميكا الحواجز الأولى تستخدم لمنع الفرخ برعم الطرف بدء ^1. يتم وصف البروتوكولات التي تستخدم رقائق الألومنيوم بمثابة حاجز كتيم إلى برعم الجناح أو تحريض الساق برعم وأو البدء. نحن الجمع بين هذه التقنية مع الجانبية حبة التنسيب للعائقا أمام خارجيا العوامل الداخلية مرشح العرض التي تم حظرها من قبل حاجز. ويتم تحليل النتائج باستخدام التهجين الموضعي التعبير الجيني لاحق. هدفنا الرئيسي هو التركيز على دور الإشارات حمض الريتينويك في تحريض والشروع في وقت لاحق من الصدارة كتكوت الجنين وhindlimb. نحن نستخدم BMS 493 (ناهض معكوس مستقبلات حمض الريتينويك (RAR)) حبات غارقة مزروع في لوحة جانبية الأديم المتوسط ​​(LPM) لتقليد أثر باررير وضعت بين و somites (مصدر لحمض الريتينويك (RA)) وLPM التي تنمو براعم الأطراف. ويمكن أيضا أن نسخ معدلة من هذه البروتوكولات يتم استخدامها لمعالجة مسائل أخرى على الأصل وتوقيت الاشارات الاستقرائي. تقدم منطقة جنين الفرخ يمكن الوصول إليها في هذه المرحلة التنموية ذات الصلة، ويمكن وضع حاجز بين الأنسجة والتغيرات اللاحقة في التنمية المدروسة. يمكن العثور على أمثلة في الدماغ، والإرشاد محور تطوير وفي تطوير الجهاز، مثل الكبد أو الكلى الاستقراء.

Introduction

عالم أجنة الكلاسيكية تستخدم عادة تقنيات المادية لاستجواب الآليات المتحكمة في التطور الجنيني. في 1960s و 1970s طور الباحثون التقنيات التي تستخدم حواجز منيعة تدرج بين أنسجة الجنين النامي للتدليل على أهمية إشارات الاستقرائي خلال مرحلة التطور الجنيني. مصلحتنا هي في وضع الطرف الفقاريات وعلى وجه الخصوص ما أحداث تسبق برعم الطرف ثمرة. على سبيل المثال، يمكن ادراج حاجزا يمنع برعم الطرف ثمرة من الحدوث على جانب واحد من أجنة الدجاج في حين يسمح لها المضي قدما عادة على الجانب، unoperated المقابل. المواد المستخدمة لجعل هذه الحواجز متنوعة. على سبيل المثال، لوحات الميكا ¹ والتنتالوم احباط ^2. هذه الحواجز تفصل بشكل فعال لوحة الأديم المتوسط ​​الجانبي (LPM)، والتي من أشكال برعم الطرف، من و somites تتشكل من الأديم المتوسط ​​المجاور للمحور. تقنيات تطعيم الجراحية تثبت أن وثيقة الارتباط خفة دمح و somites ضروري إذا برعم الطرف بدء هو أن يحدث في LPM ^{3 4.} في 80s و 90s اكتشف علماء البيولوجيا التطورية قابل للانتشار الجزيئات مما يشير التي لا غنى عنها في السيطرة على العمليات التنموية. حبات غارقة مع هذه الجزيئات يشير يمكن زرعها في مناطق معينة من الجنين وينتج تعديلات على التطور الجنيني. على سبيل المثال، يتم تحرير حمض الريتينويك (RA) التي اتخذت من قبل الخرز التبادل الأيوني على مدى فترة 24 ساعة عند زرعها في أجنة الدجاج ويمكن ان تنتج ازدواجية مرآة صورة من الأرقام ^5. يمكن الهيبارين الخرز الاكريليك تحتوي على البروتين صندوق الأجيال القادمة بدء برعم الطرف ثمرة من interlimb LPM ^6.

وفي الآونة الأخيرة أخذت الماوس والأسماك الوراثة دراسة بدء الفقاريات الأطراف إلى عهد جديد (إعادة النظر في ^7). وهناك أدلة قوية على ان RA موجودة في و somites قبل بدء برعم الطرف هو إشارة إنتشاري الأساسية المطلوبة من قبل ليرة لبنانيةM للشروع الطرف مهدها. أردنا استغلال الوصول ومتانة التجريبية للجنين فرخ لتشريح تأثير زرع حاجز على التعبير الجيني في LPM في وقت قريب من بدء برعم الطرف. والتكيف الرواية من أسلوبنا هو الجمع بين حاجز يمنع إشارات من الأنسجة المحورية مع الجانبية حبة التنسيب إلى حاجز لعوامل داخلية المنشأ مرشح العرض خارجيا التي تم حظرها من قبل حاجز. البروتوكولات التالية هي تلك التي وضعت لاستخلاص آليات الطرف تحريض برعم وبدء.

دراسة برعم الطرف بدء يعني استخدام الأجنة مرحلة مبكرة. الكثير من البيض الباحثين نافذة الدجاج عن طريق إزالة أولا بعض الزلال من خلال كيس الهواء مع إبرة تحت الجلد. الجنين، والتي تقع على رأس صفار البيض، وبعد ذلك تكمن أقل في البيض. هذه هي ميزة لبعض التقنيات، مثل Electroporation لل، ولكن يمكن أن يكون العيب إذا كان المطلوب معالجة جراحية للجنين.نجد وجود الجنين أقرب إلى فتحة في البيض ممكن هو ميزة.

ما زالت هناك تساؤلات بشأن الإشارات التي تتحكم في أطرافهم الفقاريات برعم تحريض وبدء والبروتوكولات التالية هي مناسبة لمعالجتها. نحن أول من وضع بروتوكول لإدخال الحواجز لمنع الفرخ برعم الطرف ثمرة في مرحلة مبكرة من المرحلة 12 ^8. ويمكن أيضا أن نسخ معدلة من هذه البروتوكولات يتم استخدامها لمعالجة مسائل أخرى على الأصل وتوقيت الاشارات الاستقرائي حيث تقع على الأنسجة على حث الوصول المتاخمة للمنشم التي يسببها. تقدم منطقة جنين يمكن الوصول إليها في هذه المرحلة التنموية ذات الصلة، ثم حاجز يمكن أن توضع بين الأنسجة والتغيرات اللاحقة في التنمية المدروسة. يمكن العثور على أمثلة في نمو الدماغ، والإرشاد محور والتنمية ربما الأعضاء مثل الكبد أو الكلى الاستقراء.

Protocol

يستخدم بروتوكول التالية أجنة الدجاج في أقل من عشرة أيام من الحضانة. أجريت جميع التجارب وفقا كينجز كوليدج لندن، المملكة المتحدة، والمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان في المملكة المتحدة وزارة الداخلية.

1. إعداد المطلوبة قبل كتكوت الأجنة عملية

1. جمع الأدوات الجراحية التالية اللازمة لعمليات، الحصاد ولتحديد الأجنة الفرخ: اثنين من أزواج من رقم 5 الساعات ملقط، زوج واحد من ملقط قوية، على سبيل المثال، نوع AA، مقص منحني مع شفرات 2.5 سم طويلة، وانتهت صريحا المنحني ملقط مع نهايات حوالي 0.5 سم، وأيضا اثنين من أزواج من رقم 4 الساعات ملقط لاستخدام في حين جعل الحواجز احباط (1.6.3).
2. جعل سكين الصغير من دبوس الصلب (0.3 ملم عبر) شحذ باستخدام زيت على حجر شحذ. باستخدام مجهر مجهر، وشحذ غيض من دبوس إلى شفرة مسطحة. وضع دبوس في حامل إبرة وحماية نهايته حادة من خروجه ووكرتيد.
   ملاحظة: تغليف السكين مع 1000 ميكرولتر ماصة هو خيار بسيط لهذا.
3. إعداد 70٪ من الإيثانول في زجاجة غسل البلاستيكية. استخدام بخ هذا على المناديل الورقية لمسح الأدوات الجراحية والسكين الصغير قبل وبعد استخدامها لتعقيم وتنظيفها.
4. شراء شريط لاصق واضحة 5 سم وموزع مناسبة. بحث أو تصنيع بقية مناسبة لعقد الدجاج والبيض ثابتة على جانبها.
5. جعل وحلول تخزين حبات تمرغ.
   1. إعداد محلول 0.35 ملغ / مل من الخلايا الليفية عامل النمو 4 (FGF4) البروتين من 1 ملغ / مل الأسهم المجمدة عن طريق تمييع مع الماء ومخزن في -20 درجة مئوية في 30 مكل.
   2. إعداد الحلول (إما 0.05 أو 0.1 ملغ / مل) من جميع عبر الريتينويك حمض (RA) المخفف مع سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]) في أنابيب microcentrifuge الظلام من 5 ملغ / مل الأسهم. تخزين الأوراق المالية و 100 مكل في -20 درجة مئوية.
   3. إعداد الحلول (إما 2.5 أو 5 ملغ / مل) من BMS 493 (وهي آغ معكوسonist من RARS) المخفف مع DMSO في أنابيب microcentrifuge الظلام من 10 ملغ / مل الأسهم. تخزين الأوراق المالية و 100 مكل في -20 درجة مئوية.
6. جعل حواجز من رقائق الألومنيوم.
   ملاحظة: احباط تستخدم في صنع الحواجز هي احباط الطعام القياسية (التي تقاس ميكرون كما 0.013 مم). ان أي رقائق الألومنيوم المحلي من المرجح أن تكون مناسبة.
   1. قطع 1 سم قطعة مربعة من رقائق الألومنيوم وتعقيم من قبل القضاء عليه مع 70٪ من الإيثانول على الأنسجة. وضعه على 6 سم بلاستيكية معقمة طبق بتري. تجاهل الغطاء وتقديم غطاء للطبق من رقائق.
      ملاحظة: هذا سوف يمنع خفض الحواجز من الالتصاق في وقت لاحق إلى غطاء من البلاستيك الطبق بسبب ساكنة.
   2. وضع طبق بتري على رأس graticule المرحلة (1 سم تقسيم فترة طويلة في 100 أجزاء) تحت المجهر مجهر مع التكبير المقرر أن 1.6X. باستخدام مشرط NO.15 شفرة صغيرة، وقطع شرائح من احباط لعرض المحدد، على سبيل المثال، 0.7 ملم أو 1.3 ملم.
   3. فصل احباطتجرد باستخدام اثنين من أزواج من رقم 4 الساعات ملقط. ثم جعل منحنى قائم الزاوية في وسط الجدار احباط بحيث يشبه المفصلي من عرض معين.
      ملاحظة: يتم أخذ هذا الشكل من حاجز ^{9، 10.} يبقى هناك حاجز يتوقف في مكان أفضل من الحواجز شقة على التوالي. رقم 4 ملقط هي حادة نسبيا وتستخدم لأنهم أقل عرضة لجعل الخدوش أو العشرات في الحواجز احباط.
   4. حتى خط الحواجز في وسط طبق بيتري مع جانب واحد ضد شقة الطبق والآخر لافتا للخروج من صحن، والانتقال من احباط تقطيعه المتبقية إلى جانب واحد. إعداد 20 أو أكثر من الحواجز قبل يوم العملية. وضع غطاء احباط فوق الطبق وتخزين الحواجز في مكان حيث لن تكون منزعجة.
      ملاحظة: حتى لانتكاسة خفيفة يمكن ترجيح كفة الحواجز على أو يعني أنها العصا مع ساكنة على جانبي الطبق.
7. احتضان بيض الدجاج المخصب على جنوبهم على أطباق البيض الكرتون في 38 °مئوية لمدة مناسبة من الوقت قبل يوم العملية مثل أن الأجنة سوف تكون على المطلوب ⁸ المرحلة.

2. إعداد الفرخ الأجنة والخرز في يوم العملية

1. "نافذة" حضنت بيض الدجاج.
   ملاحظة: تم تمرير الطريقة التالية لفتح البيض على طريق دينيس Summerbell (لم تنشر).
   1. مع البويضة ترقد على جانبها، يخترق نهاية حادة (كيس نهاية الهواء) من البيض مع نوع AA ملقط قوية والتأكد من أن قذيفة الغشاء الداخلي قد تم كسر. للقيام بذلك فهم ملقط معا بحزم وتستخدم حركة طعن تسيطر عليها في حين عقد البيض مع الحرية.
   2. تأخذ البيضة، لا تزال ترقد على جانبها، في كلتا اليدين (واحدة جانبي) تحويله من خلال 180 درجة على طول المحور الأفقي ويحل محله في علبة البيض مثل هذا الجانب الذي كان العلوي هو الآن بجانب الدرج.
      ملاحظة: هذا يخفف من الجنين من الأغشية قذيفة وسوف يعني أن الجنين جنيهSS المرجح أن يكون قطعت عند إزالة قذيفة فوق الجنين.
   3. تأخذ قطعة من الشريط واضح حوالي 5 سم مربع، وعصا هذا عن كثب على السطح العلوي من البيض لوقف قشر البيض من الانهيار على الجنين عند فتح البيض.
   4. استخدام مقص منحنية لكسر بلطف من خلال وعاء والأغشية في وسط الجزء العلوي من البيض، وجعل ثقب صغير جدا مع شفرة واحدة من مقص بحيث الهواء يمكن أن يدخل البيض على الجنين (والتي تقع على بعد تحت الجزء العلوي من قذيفة).
      ملاحظة: فقط عن طريق كسر الأغشية قذيفة وليس كسر أي من الأغشية التي تغطي الجنين، وهواء يدخل البيض فصل الجنين من قذيفة وسوف الجنين أن تستقر على رأس صفار البيض عن 0.5-1 سم من قذيفة .
   5. استخدام مقص منحنية لتوسيع ثقب في وعاء على شكل دائرة يبلغ قطرها حوالي 1 سم. إزالة قطعة من قذيفة رفعه وتغطي فتحة في البيضة معقطعة من الشريط واضح حوالي 5 سم مربع. لإزالة بسهولة هذا الشريط، اضغط على الشريط لعصا فقط على شفة حفرة، وترك المتبقي من الشريط مجانا. الشريط الحرة ومن ثم يمكن اغتنامها لفضها والبيض.
2. الأجنة مرحلة
   1. وبعد الحضانة عند 38 درجة مئوية (راجع الخطوة 1.7) والنوافذ (الخطوة 2.1)، واستخدام المجهر مجهر لاستضافة افراخ الدجاج وفقا ^ل8. هل هذا فقط قبل أن يتم ختم البيض التالية النوافذ. إرسال مرحلة كل جنين على قشر البيض. عودة البيض إلى الحاضنة.
      ملاحظة: الأجنة في مراحل ما بين 8 و 15 هي مناسبة للحاجز وحبة التجارب. هي أكثر عرضة للبقاء على قيد الحياة إن لم تكن قد تم استبعاده من الحاضنة لفترة طويلة جدا قبل العملية الأجنة.
3. حبات نقع قبل العملية.
   1. FGF4
      1. اتخاذ عدد من الخرز هلام اللوني تقارب (150-300 ميكرون) التي تلتصق نهاية 1000 ميكرولتر ماصة وكانح لهم في 1 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في أنبوب microcentrifuge لإزالة أزيد يتم تخزينها في أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 ثانية، تجاهل برنامج تلفزيوني وتكرار العملية مرتين.
      2. نقع حبات جل في انخفاض 30 ميكرولتر من 0.35 ملغ / مل بروتين FGF4 على طبق بتري معقمة على الجليد لمدة 30 دقيقة. اختيار حبات حوالي 150 ميكرون في القطر مع رقم 5 microforceps لإدراجها في الجنين.
         ملاحظة: التعامل مع أيون الخرز الراتنج الصرف المستخدمة في الخطوات التالية مع رقم 5 microforceps وقبضة منهم بلطف جدا لأن حبات هشة ويمكن أن تتحطم إذا تقلص محكم جدا. وينطبق هذا التحذير على 2.3.2-2.3.3 وجميع العمليات الراتنج حبة.
   2. RA
      1. تذويب قسامة من 0.05 أو 0.1 ملغ / مل جميع العابر-RA المخفف مع DMSO ووضع قطرة 100 ميكرولتر على طبق بيتري معقمة (9 سم القطر)، التي سبق أن غطت في احباط لحماية RA من الضوء. خذ 10 ميكرولتر ماصة والتقاط بعض التبادل شكل كلوريد أيونالخرز الراتنج على نهايته ونقع هذه في إسقاط RA محمية من الضوء في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
      2. شطف حبات في ثلاث قطرات متتالية من 100 ميكرولتر Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) وضعت في نفس طبق بيتري لا يقل عن 1 سم عن بعضها البعض.
         ملاحظة: الخرز يستغرق الفينول صبغة حمراء من DMEM. ويستند هذا الأسلوب على ^5.
      3. اختيار حبات ما يقرب من 100 ميكرون في القطر (تتراوح الخرز في حجم 75-180 ميكرون عندما تكون رطبة) لإدراجها في الجنين، وذلك باستخدام شريحة graticule مرحلة المجهر تحت طبق بيتري وNO.5 microforceps لعقد الخرز. عند التقاط حبة من انخفاض 100 ميكرولتر من DMEM، المركز الأول حبة أسفل على طبق بيتري وإزالة أي DMEM المتبقية منه إما عن طريق دفع حبة من انخفاض أو عن طريق وضع ملقط مغلقة بجانب حبة (الشعرية ويعتمد عمل السائل بعيدا عن حبة).
   3. BMS 493
      1. أما بالنسبة لالتهاب المفاصل الروماتويدي (2.3.2)، نقع صرافة أيونالخرز الراتنج آنج في انخفاض 100 ميكرولتر من 2.5 أو 5.0 ملغ / مل BMS 493 في DMSO في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة ثم يشطف في 100 قطرات ميكرولتر من DMEM. اختيار حبات ما يقرب من 100 ميكرون في القطر لإدراجها في الجنين.
   4. السيطرة DMSO
      1. أما بالنسبة لالتهاب المفاصل الروماتويدي (2.3.2)، نقع حبات راتنج التبادل الأيوني في انخفاض 100 ميكرولتر من DMSO في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة ثم يشطف في 100 قطرات ميكرولتر من DMEM. اختيار حبات ما يقرب من 100 ميكرون في القطر لإدراجها في الجنين.

3. عمليات الجدار والخرزة

الشكل 1. مخططات من الفرخ الأجنة من مراحل مختلفة عرض أين الحواجز وأو ينبغي أن توضع الخرز. (أ) المرحلة 13 كتكوت الجنين موقف الاداء التخطيطي الحاجز (الخط الأخضر) بين القطع البدنية النمطية وLPM في presumpمستوى الجناح TIVE (القطع البدنية النمطية 15-20). (ب) نفس التخطيطي كما هو الحال في (أ)، مما يشير إلى حيث حبة RA (الدائرة الحمراء) يجب أن توضع قبل الإدراج الحاجز. (ج) وضع تخطيطي يظهر الحاجز (الخط الأخضر) على مستوى الساق المفترض (القطع البدنية النمطية 26-32) في جنين المرحلة 15. (د) نفس التخطيطي كما هو الحال في (C)، مما يشير إلى حيث ينبغي أن توضع على حبة RA (الدائرة الحمراء). (E) التخطيطي مشيرا إلى أين BMS 493 الخرز (الدوائر البنفسجية) يجب أن توضع في LPM من جنين المرحلة 15. (F) رسم تخطيطي للكتكوت الجنين مرحلة 9 يشير إلى موقف الحاجز (الخط الأخضر) بين الأديم المتوسط presomitic وLPM على مستوى الجناح الافتراضي. (G) رسم تخطيطي من جنين المرحلة 9 تظهر مواقف حاجز (الخط الأخضر)، والتهاب المفاصل الروماتويدي حبة (الدائرة الحمراء). (H) رسم تخطيطي للكتكوت الجنين المرحلة 10 التي تبين موقف الحاجز (الخط الأخضر) على مستوى الساق الافتراضي. (أنا ) رسم تخطيطي يظهر BMS 493 موقف حبة (دائرة البنفسجية) في المرحلة 10 LPM مستوى الساق. تم تعديل هذا الرقم من ^7. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. حاجز إدراج في المرحلة 13 لمنع الجناح برعم بدء.
   1. إلقاء الجنين المرحلة 13 من الحاضنة ووضع البيض على بقية البيض تحت المجهر مجهر المقرر أن 3.2X التكبير أو أعلى إذا كان يفضل. إزالة الطبقة العليا من الشريط واضح.
      1. باستخدام سكين الفولاذ الصغير، وجعل شق من خلال الغشاء المحي والجانبي لوحة الأديم المتوسط (LPM) المتاخمة لالقطع البدنية النمطية 15-20 (الشكل 1A) على الجانب الأيمن من جنين (القطع البدنية النمطية لا تتمتع جميع تشكلت في هذه المرحلة). قطع المتاخمة لو somites الأربع الماضية شكلت ومواصلة قطع اثنين من أطوال الجسيدة caudally.
      2. التقاط حاجز (0،7-1 ملم واسعة) مع رقم 5 microforceps في نهاية جاحظ من طبق بيتري وتطور من ناحية لادخال نهاية خالية من الجدار في شق. حاجز يتوقف على شكل شقة تقع على الغشاء المحي فوق LPM مع نصفه الأسفل جاحظ من خلال القاصي شق لو somites. في أقرب وقت ممكن ختم البيض مع الشريط واضح وإعادته إلى الحاضنة.
         ملاحظة: السكين الصغيرة وملقط تصبح لزجة على اتصال مع الغشاء المحي. ومن المهم للقضاء عليها نظيفة مع الايثانول 70٪ قبل محاولة عملية لاحقة. وهذا ينطبق على جميع الأوصاف عملية لاحقة وحبة زرع.
      3. إذا كان حبة لإدراجها بالتزامن مع وجود حاجز. أولا، يأخذ حبة في رقم 5 microforceps وأدخله في قطع وجه LPM على الجانب البعيد من شق ومن ثم إدراج حاجز في الدانية شق إلى حبة (الشكل 1B). ختم البيض وإعادته فورا إلى الحاضنة.
2. حاجز إدراج في المرحلة 15 لمنع الساق بدء برعم.
   ملاحظة: مثال على نتيجة هذه العملية على Tbox 4 عامل النسخ التعبير (Tbx4) هو مبين في الشكل 2D و 2E.
   1. إلقاء الجنين المرحلة 15 من الحاضنة ووضع البيض على بقية البيض تحت المجهر مجهر المقرر أن 3.2X التكبير أو أعلى إذا كان يفضل. إزالة الطبقة العليا من الشريط واضح.
      1. باستخدام سكين الفولاذ الجزئي إجراء شق من خلال الغشاء المحي وLPM المجاور لالقطع البدنية النمطية 26-32 (الشكل 1C) على الجانب الأيمن من جنين (القطع البدنية النمطية لا تتمتع جميع تشكلت في هذه المرحلة). قطع المجاورة لهما و somites الماضية شكلت ومواصلة أطوال الجسيدة قطع خمسة caudally.
      2. التقاط حاجز (1،2-1،3 ملم واسعة) مع رقم 5 microforceps في نهاية واحدة وتحريف الحاجز لادخال نهاية خالية في شق. في أقرب وقت ممكن ختم البيض واضح مع شريط لالثانية إعادته إلى الحاضنة.
         ملاحظة: يتوقف على شكل حاجز شقة تقع على الغشاء المحي فوق LPM مع نصفه الأسفل جاحظ من خلال القاصي شق لو somites.
      3. إذا كان حبة لإدراجها بالتزامن مع وجود حاجز، أولا، يأخذ حبة في رقم 5 microforceps وأدخله في قطع وجه LPM على الجانب البعيد من شق ومن ثم إدراج حاجز في الدانية شق ل حبة (1D الشكل). ختم البيض وإعادته فورا إلى الحاضنة.
      4. إذا حبة أو حبات لإدراجها دون حاجز، على سبيل المثال، BMS 493 الخرز لمنطقة الساق في المرحلة 15، لا تجعل شق طويل (3.2.2.1). إجراء شق صغير من خلال الغشاء المحي وفي LPM في موقف حبة توضع. خذ حبة في رقم 5 microforceps وأدخله في حفرة في LPM. دفعها في قليلا أبعد مع نهايات مغلقة من ملقط (الشكل 1E).
3. حاجز إدراج في المرحلة 9 لمنع الجناح برعم تحريض وبدء.
   1. خذ مرحلة 8 أو 9 الجنين من الحاضنة ووضع البيض على بقية البيض تحت المجهر مجهر المقرر أن 3.2X التكبير أو أعلى إذا كان يفضل.
      1. باستخدام سكين الفولاذ الجزئي إجراء شق من خلال الغشاء المحي وLPM الجانبية ومنقاري إلى الشريط البدائي، في نهاية الذيلية للجنين في خط مع و somites (الشكل 1F) حوالي 5 الجسيدة فترات طويلة.
      2. التقاط حاجز (0،7-1 ملم واسعة) مع رقم 5 microforceps في نهاية جاحظ من طبق بيتري وتطور من ناحية لادخال نهاية خالية من الجدار في شق. في أقرب وقت ممكن ختم البيض مع الشريط واضح وإعادته إلى الحاضنة.
         ملاحظة: يتوقف على شكل حاجز شقة تقع على الغشاء المحي فوق LPM مع نصفه الأسفل جاحظ من خلال شق.
      3. إذا حبة هو أن تكون inserteد بالتزامن مع وجود حاجز. أولا، يأخذ حبة في رقم 5 microforceps وأدخله في قطع وجه LPM على الجانب البعيد من شق ومن ثم إدراج حاجز في الدانية شق إلى حبة (الشكل 1G). ختم البيض وإعادته فورا إلى الحاضنة.
4. حاجز إدراج في المرحلة 10 لمنع الساق تحريض برعم وبدء.
   ملاحظة: مثال على نتيجة هذه العملية على التعبير Tbx4 هو مبين في الشكل 2G.
   1. إلقاء الجنين المرحلة 10 من الحاضنة ووضع البيض على بقية البيض تحت المجهر مجهر المقرر أن 3.2X التكبير أو أعلى إذا كان يفضل.
      1. باستخدام سكين الصغير الصلب إجراء شق من خلال الغشاء المحي وLPM الجانبي إلى الشريط البدائي، في نهاية الذيلية للجنين في خط مع و somites (الشكل 1H) ما يقرب من 6 الجسيدة فترات طويلة.
      2. التقاط حاجز (1.2ملم واسعة) مع رقم 5 microforceps في نهاية جاحظ من طبق بيتري وتطور من ناحية لادخال نهاية خالية من الجدار في شق. في أقرب وقت ممكن ختم البيض مع الشريط واضح وإعادته إلى الحاضنة.
         ملاحظة: يتوقف على شكل حاجز شقة تقع على الغشاء المحي فوق LPM مع نصفه الأسفل جاحظ من خلال شق.
      3. إذا كان حبة لإدراجها دون حاجز، على سبيل المثال، BMS 493 حبة للمنطقة المحطة في المرحلة 10، وجعل شق صغير من خلال الغشاء المحي وفي LPM في موقف حبة توضع. خذ حبة في رقم 5 microforceps وأدخله في حفرة في LPM. دفعها في قليلا أبعد مع نهايات مغلقة من ملقط (الشكل 1I).
5. 24 ساعة أو أكثر بعد تشغيل التحقق من موقف من الجدار بالمقارنة مع برعم الطرف المقابل الناشئة. تخلصي من أي الأجنة التي الحاجز هو واضح ليس opposITE برعم الطرف الأيسر. في هذه الحالة تم وضع حاجز خطأ.

4. حصاد الأجنة، التثبيت والإعداد للWholemount في الموقع التهجين (WISH)

1. الأجنة بعد الحصاد العملية.
   1. الأجنة الحصاد في مرحلة 19-23 بحيث برعم الطرف التشكل مرئيا في كل من الجانبين السيطرة تشغيلها والمقابل بشكل واضح.
      1. قطع باستخدام مقص منحني حفرة أكبر في قشرة البيضة. خفض حول الجنين أثناء الضغط على الأوعية الدموية الكبيرة إلى اليسار من الجنين مع microforceps. استخدام هذا قبضة سفينة لإزالة الجنين ووضعه في طبق بيتري من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) الرقم الهيدروجيني 7.3.
      2. تحت المجهر مجهر، بعيدا تشريح السفن والأغشية الجنينية إضافية باستخدام مزيج من مقص منحني ولا. 5 microforceps. إزالة الرأس باستخدام مقص.
2. تثبيت الأجنة مرحلة ما بعد الحصاد.
   1. باستخدام blun المنحنيةر ملقط، ورفع الجنين ووضعه في 5 مل 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة هزاز ثم في 4 درجات مئوية خلال الليل في زجاجة 20 مل مع غطاء المسمار.
      تحذير: PFA يشكل خطرا كبيرا على الصحة. بل هو ضار، مهيجة للتآكل ويجب منع مسحوق من ملامسة الجلد والعينين والرئتين. استخدام الملابس الواقية الشخصية وغطاء الدخان في حين تستعد الحل. مرة واحدة بل هو حل 4٪، والقفازات، وحماية العين ومعطف المختبر يجب أن ترتديه.
      ملاحظة: من المهم للحصول على الأجنة في الإصلاح بسرعة إلى الأفضل الحفاظ على سلامة مرنا.
3. إزالة الحواجز قبل wholemount في الموقع التهجين.
   تتم إزالة الحواجز لأنها حادة ويمكن أن تلحق الضرر الأجنة لأنها تذهب من خلال في البروتوكول الموقع التهجين، وخاصة إذا ملطخة عدة أجنة في وقت واحد: ملاحظة.
   1. بعد التثبيت، ووضع الجنين في طبق من برنامج تلفزيوني تحت مجهر ميلcroscope.
   2. باستخدام اثنين من أزواج من رقم 5 microforceps، وضع الزوج ترك كثب جانبي الجدار في الجانب تشغيلها من الجنين. فهم الحاجز مع الزوج المناسب وسحب بلطف حاجز من الجنين باستخدام زوج تركهن لحفظ الجنين إلى أسفل وإلى منع أي نوع من الأنسجة من الانضمام إلى الحاجز كما يتم إزالته.
4. تنفيذ WISH أساسا كما هو موضح في ^11.

النتائج

يصف بروتوكول المفصلة أعلاه الأساليب المستخدمة في نيشوموتو وآخرون. ، عام 2015. ورقة دراسات برعم الطرف تحريض والشروع في كل من الصدارة وhindlimb الجنين الفرخ. وقد نشرت النتائج التالية ادراج حواجز منيعة لمنع نمو البرعم forelimb السابق ^{1، 2، 9} ولكن كان هناك فقط واصفا الحواجز دراسة واحدة منع الساق برعم بدء ^1. البيانات Hindlimb من نيشوموتو وآخرون. ، يتم عرض 2015 هنا النتائج ممثل دراسة التعبير مرنا بعد إدخال الحاجز.

التعبير Tbx4 في LPM غير كاف لبدء Hindlimb ثمرة:
الأرقام 2B و ج (الجدول رقم 2) تبين أن الإدراج حاجز في المرحلة 15 (الشكل 2A) (انظر بروتوكول 3.2) يؤدي إلى كل من Fgf10وFgf8 التعبير غائب المنطقة الساق برعم (الرمز بواسطة قوس) على الجانب الأيمن تشغيلها. مقارنة مع الجانب الأيسر unoperated. ومع ذلك، لوحظ Tbx4 التعبير في كل مرحلة 19 و 23 مرحلة على الجانب تعمل (الشكل 2D و E). نخلص إلى أن التعبير Tbx4 وحدها ليست كافية لبدء hindlimb ثمرة من LPM. وأشارت دراسات أخرى في فرخ هذا التعبير TBX الجين هو كاف لبدء تشكيل forelimb برعم ^{12 و 13.}

يتم تضمين الشكل 2C "لتوضيح كيفية حاجز يبدو جعلهما في منطقة الساق وظيفة الجنين التثبيت. في معظم الحالات الحواجز أزيلت قبل في الموقع التهجين (بروتوكول 4.3).

التهاب المفاصل الروماتويدي من و somites ضروري في LPM قبل Fgf10 يقنع الاطراف برعم ياutgrowth:
الشكل 3A هو التخطيطي تمثل إضافة لالقاصي حبة RA غارقة إلى حاجز إدراجها في المرحلة 15 (بروتوكول 3.2.1.3). لاحقا إلى هذه العملية برعم الطرف ثمرة (الرمز بواسطة علامة النجمة) ويلاحظ على الجانب الأيمن تشغيلها وTbx4، Fgf10 وFgf8 يتم التعبير عنها في مهدها كما هي في الجانب الأيسر التحكم (الشكل 3B، C و D، الجدول 2) . وبالتالي إضافة RA إلى LPM تتغلب على تأثير الجدار وأطرافهم عائدات برعم بدء. نستنتج أن في الاتحاد الإقليمي تنمية العادي من و somites أمر ضروري في LPM قبل ويمكن البدء في نمو برعم الطرف. براعم hindlimb الناتجة أصغر عموما من تلك الموجودة على الجانب السيطرة. قد يكون هذا بسبب جرعة RA في LPM كونها لا تعادل الوضع النوع البري. إذا كانت الجرعة RA عالية جدا وقمي الأدمة ريدج (آي إي آر) يمكن اختصارها، وسوف يؤدي البراعم الصغيرة^{14، 15.}

للتأكد من أن التهاب المفاصل الروماتويدي (من و somites) في LPM مطلوب للالعادي برعم الطرف بدء ناهض معكوس من RAR، BMS 493، تم استخدامها. تزرع حبات في LPM منطقة الساق في المرحلة 15 (انظر بروتوكول 3.2.1.4) (الشكل 3E). وdownregulated التعبير Fgf10 تطبيق التالي من BMS 493 حبات في LPM، مما أدى إلى براعم hindlimb أصغر بالمقارنة مع الجانب السيطرة (الشكل 3F، الجدول 3). حبات السيطرة DMSO لا تسبب هذه العيوب (الأرقام الجيل الثالث 3G و3H، الجدول 3). العيوب وحظ التالية BMS 493 التطبيق هي أخف من تلك التي تحدثها عملية الحاجز. أي Fgf10 لا يزال أعرب وتتشكل براعم الأطراف. هذا ومن المرجح أن يكون ذلك بسبب تقتصر آثار BMS 493 محليا في جميع أنحاء الخرز وقد لا تكون قادرة على استعداء كل RA التي تنتجها AXIآل الأنسجة.

في وقت مبكر إشارات المحورية التخصص خلايا LPM أن عبر عن وقت لاحق Tbx4:
اختبرنا عندما LPM يكتسب القدرة على التعبير عن Tbx4 في المنطقة التي تشكل المحطة المرتقبة. أقرب المرحلة التي يمكن إدراج حاجزا التي من شأنها عرقلة في وقت لاحق الساق برعم ثمرة، هي مرحلة 10. نحن أول من وضع بروتوكول لادخال الحواجز على مراحل في وقت سابق من مرحلة 12. الحواجز تدرج بين الأديم المتوسط ​​المجاور للمحور والساق الظني LPM في المرحلة 10 (انظر بروتوكول 3.4) تشكيل برعم كتلة الساق والتعبير عن Tbx4 في LPM تشكيل الساق (أرقام 2F و 2G، الجدول 2)، مما يدل على أن إشارة من الأنسجة المحورية في المرحلة 10 مطلوب للتعبير في وقت لاحق من Tbx4 في LPM hindlimb. قارن هذه النتيجة مع شخصيات 2D و E حيث يسمح لاحق حاجز الإدراج التعبير Tbx4حتى تتاسس. وعلاوة على ذلك، نحن اختبار ما إذا كان هذا إشارة محوري يمكن أن يكون التهاب المفاصل الروماتويدي من خلال مراقبة ما إذا كان ناهض معكوس من RAR يقلل التعبير Tbx4. وBMS 493 حبة توضع في LPM hindlimb في المرحلة 10 (انظر بروتوكول 3.4.1.3) downregulates التعبير Tbx4 (أرقام 2H و2I)، في حين حبات السيطرة غارقة في DMSO لا تؤثر Tbx4 التعبير (أرقام 2J و2K). معا، وهذه النتائج تدعم نموذجا إشارة RA من الأنسجة المحورية تنظم أطرافهم تحريض من خلال تنظيم إيجابيا Tbx4 في LPM hindlimb ^7.

الموت بعد الجراحة:
الجدولين 1 و 2 و 3 تعطي تفاصيل النتائج التجريبية بما في ذلك عدد من افراخ الدجاج التي نفقت بعد العملية وقبل الحصاد. بعض الوفيات وينتظر أن تتم بعد جراحة من هذا النوع. الموت أرقام يمكن أن تظل إلى أدنى حد ممكن عن طريق التأكد من أن الصكوك نظيفة، وثقب في البيضة هو الحد الأدنى لحجم المطلوبة، التي تترك الأجنة دون حماية ختم شريط لاصق للحد الأدنى من الوقت وبالتزامن مع هذه النقطة الأخيرة أن العملية ونفذت في أسرع وقت ممكن. أيا من هذه العمليات هم قتا طويلا جدا ولكن العمليات التي تنطوي على الخرز والحواجز تأخذ وقتا أطول قليلا. وعلى الرغم من هذه الإجراءات، العمليات التي تتم في المراحل الأولى وتلك الموجودة في منطقة الجناح على الأرجح أن يؤدي إلى الوفاة. هناك الأوعية الدموية الكبيرة في جميع أنحاء المناطق التي تشكل الأطراف وتمزق عرضية من هذه السفن قد يؤدي إلى الوفاة بسبب فقدان الدم. نجد أن البيض فتحت في مرحلة 8 أو 9، الذي الأجنة لم تعمل على، وغالبا ما يموت في اليوم التالي. ولذلك، فإن الحل الوحيد لهذه المشاكل هو تنفيذ عدد كبير من التجارب.

د / 54618 / 54618fig2.jpg "/>
الشكل 2. ماركر التغييرات التعبير الجيني التالية الحاجز أو الخرزة الإدراج في افتراض والساق مستوى. (أ) وضع عرض تخطيطي الحاجز (الخط الأخضر) في الظني مستوى الساق (القطع البدنية النمطية 26-32) في جنين المرحلة 15. (B - E و G) تحليل WISH على الأجنة تشغيلها. ويرد منطقة الساق (بين قوسين). (ب) التعبير Fgf10 غائب في LPM تعمل، ولكن تم الكشف عن التعبير القوي في مهدها الأيسر. (ج) التعبير Fgf8 غائب في الجانب تشغيلها، مما يشير إلى عدم وجود هيئة تنظيم الكهرباء. (C ') نفس الجنين قبل إزالة الجدار. وأعرب عن (D) Tbx4 في LPM على نفس المستوى rostro-الذيلية كما مهدها السيطرة. وحافظت (E) التعبير Tbx4 في منطقة الساق اليمنى على الرغم من عدم وجود نمو أطرافهم. (F) رسم تخطيطي للمرحلة 10 كتكوت الجنين الذي يظهر في موضع الحاجز (الخط الأخضر) على مستوى الساق الافتراضي. (G) التعبير Tbx4 غائب في تشغيلها الصحيح LPM (قوس). (H) رسم تخطيطي للكتكوت الجنين المرحلة 10 يظهر BMS 493 موقف حبة (دائرة البنفسجية) على مستوى الساق الافتراضي. وdownregulated (I) التعبير Tbx4 على الجانب الأيمن تشغيلها بعد العلاج مع BMS 493. (J) رسم تخطيطي للكتكوت الجنين المرحلة 10 يظهر سيطرة على الموقف DMSO حبة (الدائرة الرمادية). وأعرب عن (K) Tbx4 على الجانب الأيمن تعمل على مستوى مماثل لتلك التي تحكم الجانب الأيسر بعد العلاج مع DMSO وحدها. تم تعديل هذا الرقم من ^7. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

د / 54618 / 54618fig3.jpg "/>
غياب الشكل 3. RA تنقذ برعم الطرف الناجمة عن الجدار الإدراج وضروري في LPM قبل الساق برعم ثمرة. (A) رسم تخطيطي مشيرا إلى موقف الحاجز (الخط الأخضر) على مستوى الساق المفترض (القطع البدنية النمطية 26-32) وحبة غارقة RA (الدائرة الحمراء). (B - D) RA الإنقاذ الساق برعم ثمرة (يتضح من النجمة). (ب) التعبير Tbx4 موجود في مهدها الساق انقاذ مماثلة إلى جانب الامم المتحدة وتعمل. وأعرب عن (C) Fgf10 في ساقه انقاذ برعم على غرار الجانب تديرها الامم المتحدة. وأعرب عن (D) Fgf8 في هيئة تنظيم الكهرباء من المهد الساق اليمنى انقاذهم. (E) التخطيطي مشيرا إلى حيث وضعت BMS 493 الخرز (الدوائر البنفسجية) في LPM الساق افتراضية المرحلة 15 الأجنة. وdownregulated (F) التعبير Fgf10 على الجانب الأيمن تشغيلها وبرعم الساق صغير التالي BMS 493 العلاج. حبات بنجمة. (G) التخطيطي على غرار (E)، مما يدل على موقف السيطرة الخرز DMSO (الدوائر الرمادية). لم (H) حبات DMSO (كما هو موضح من قبل العلامات النجمية) لن يؤثر على التعبير Fgf10 أو حجم الساق مهدها. تم تعديل هذا الرقم من ^7. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مرحلة الحاجز وضعت (+ حبة) *	عدد تعمل	الجناح المفقودين **	الجناح الحاضر **	العدد القتلى
مرحلة 12-14	40	24	1	15
مرحلة 8/9	65	23	0	42
مرحلة 12-13 (FGF4 حبة)	41	7 (المفقودين حبة)	17	17
مرحلة 12-13 (RA حبة)	75	9 (المفقودين حبة)	32	34
المرحلة 13 (حبة السيطرة)	5	3	0	2
* 0،7-1 ملم الحواجز احباط وضعت بين القطع البدنية النمطية 15-20 ولوحة الأديم المتوسط ​​الجانبي. 0.35 ملغ / مل FGF4 حبة. 0،05-،1 ملغ / مل RA حبة.
[دمس] حبة السيطرة.
** مراحل الأجنة الفرخ ثابتة 21-23

الجدول 1. الجناح مستوى الجدار والخرزة تجربة النتائج.

مرحلة الحاجز وضعت (+ حبة) * td>	عدد تعمل	ساق في عداد المفقودين **	الساق الحاضر **	العدد القتلى
مرحلة 12-15	43	39	0	4
مرحلة 10/11	23	16	0	7
المرحلة 15 (حبة FGF4)	8	0	5	3
المرحلة 15 (حبة RA)	18	0	18	0
* 0،7-1،3 مم الحواجز احباط وضعت بين القطع البدنية النمطية 26-32 ولوحة الأديم المتوسط ​​الجانبي. 0.35 ملغ / مل FGF4 حبة. 0،05-،1 ملغ / مل RA حبة.
** مراحل الأجنة الفرخ ثابتة 18-24

الجدول 2. الساق مستوى الجدار والخرزة تجربة النتائج.

عدد تعمل	برعم صغير الساق	برعم صغير الساق قليلا	الساق برعم الحجم العادي	العدد القتلى
BMS 493 الخرز *
15	12	3	0	0
حبات DMSO **
12	0	3	9	0
* 2-3 حبات غارقة في 5 ملغ / مل BMS 493 وضعت في حق مرحلة 14-15 LPM على مستوى الساق.
** 2-3 حبات غارقة في DMSO ضعت وحدها في حق المرحلة 15 LPM على مستوى الساق.
افراخ الدجاج ثابتة في مراحل 17-19.

دير = "1" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1" FO: المحافظة على مع next.within صفحة = "دائما">

الجدول 3. الساق مستوى BMS 493 حبة تجربة النتائج.

Discussion

وصفنا استخدام الحواجز غير منفذة لمنع تشكيل براعم الأطراف في أجنة الدجاج. هذه التقنية لديها عدد من الخطوات الحاسمة. وبعد التجارب الأولية، وجدنا أن الحواجز يتوقف على شكل المستخدمة في ^{9 و 10} تبقى في مكانها في الجنين أفضل بكثير من الحواجز على التوالي. الجانب المسطح البعيدة من الجدار العصي على الغشاء المحي ويحافظ على حاجز في مكان (الشكل 2C). التحضير المتأني للالمفصلي على شكل حواجز من رقائق الألومنيوم كما هو موضح في البروتوكول خطوة 1.6 ضروري لنجاح العملية. والخطوة الثانية المهمة هي ضمان أن البيض لا استبعد من الحاضنة لفترة طويلة جدا بعد النوافذ وتنظيم قبل التشغيل على الجنين. في تجربتنا، والأجنة البقاء على قيد الحياة لعملية جراحية أفضل إذا كانوا في أو بالقرب من درجة حرارة الحضانة عند تنفيذ العملية. ولذلك، ينبغي تنفيذ العمليات في أسرع وقت ممكن والبيض أعادت موجهلاي لضمان بقاء معدلات جيدة. العديد من الباحثين إضافة قطرة من المضادات الحيوية إلى الجنين بعد جراحة قبل أن تعود البيض إلى الحاضنة. وجود السائل منعت الحواجز من الالتصاق جيدا في الموقف. يمكن إضافة المضادات الحيوية أيضا طرد حبات بعد التنسيب. لذلك لا تستخدم المضادات الحيوية، وعمليات سريعة ونظافة جيدة مع الصكوك ينصح لتجنب العدوى. محو الأدوات مع 70٪ من الإيثانول بعد كل مرحلة من مراحل العملية أمر ضروري لمنع الأدوات من أن تصبح لزجة من الاتصال مع الغشاء المحي الذي يمكن أن يسبب كل من الحواجز أو الخرز التمسك ملقط (انظر بروتوكول خطوة 3.1.2.2). كلا أصناف من الخرز المستخدمة يمكن تسقط من مكان بعد العملية. عندما تم فحص موقف حاجز في اليوم التالي لم يكن من الممكن أن نرى من خلال حاجز للتأكد ما إذا كانت حبة بقيت في مكانها أم لا. في الحالات التي يكون فيها حبة قد انخفض من لم انقاذ الجناح برعم ثمرة ( الجدول 1). تجنب نقل السائل مع حبة عند زرعها يعني أن حبات عصا بسهولة أكبر إلى قطع وجه LPM (انظر بروتوكول 2.3.2.3). وأخيرا ضمان أن الأجنة ثابتة مباشرة بعد الحصاد أمر بالغ الأهمية لتحليل التعبير الجيني لاحق جيدة (انظر بروتوكول خطوة 4.2).

هذا البروتوكول يعدل التجارب التي نشرت في وقت سابق ان تستخدم الحواجز لمنع برعم الطرف بدء، ويعرف بعرض المثلى محددة الحواجز ويقدم الجمع بين الجدار ووضع حبة تليها تحليل التعبير الجيني. لقد وجدنا باستخدام رقائق الألومنيوم التقليدية، وهي رخيصة ومتاحة بسهولة في جميع المختبرات، وتنتج نتائج مساوية لتلك التي كانت تستخدم في السابق احباط التنتالوم. احباط يمكن أن تترك في الجنين عند تنفيذ في الموقع التهجين (الشكل 2C ') لكننا عادة إزالته إذا كان يتم تجهيزها أكثر من جنين واحد لمنع الحواف الحادة من احباط إتلاف الأجنة. Pأثبتت الدراسات في Ilot أن عرض الحواجز منطقة الساق أهمية خاصة. في البداية كانت الحواجز محاكمتهم قصيرة جدا ولم تمنع نمو الساق مهدها. 1،2-1،3 مم هو العرض الأمثل لحاجز لمنع الساق ثمرة برعم تماما. أضيق الحواجز الجناح يمكن للمرء أن وضع بدقة لمنع نمو برعم تعطي أفضل معدلات البقاء على قيد الحياة. وهذا يمكن أن تكون ضيقة مثل 0،5-0،7 مم. ومع ذلك، الحواجز التي هي أوسع قليلا من المرجح أن يؤدي إلى إتمام حظر الجناح برعم ثمرة لأنها تسمح لعدم دقة صغيرة من وضع (كنا 0،7-1 ملم). تجنب الأوعية الدموية عندما جعل شق أمر بالغ الأهمية للحواجز مستوى الجناح مهدها. وقد سبق استخدام حواجز شبه منفذة للشطر برعم كتكوت أطرافهم. MacCabe وباركر، 1976 وSummerbell، 1979 مرشحات كلاهما يستخدم 0.45 ميكرون و 0،8 ميكرون حجم المسام، على التوالي ^{16، 17.} وذكرت ان اشارات إنتشاري يمكن أن تمر من خلال المسام في الفلاتر والتياكتسبت النتائج باستخدام حواجز شبه منفذة منتصف الطريق بين براعم الأطراف مع عدم وجود حاجز الحالي واحد مع حاجز احباط التنتالوم بردة. ويمكن تكييف هذا البروتوكول لاستخدام الحواجز شبه منفذ متفاوتة حجم المسام للتمييز إشارات مرشح على أساس الحجم أو تعديل ديناميكية انتشار إشارة.

هذا البروتوكول لديه العديد من القيود المرتبطة أساسا مع كائن النموذج نفسه. ويمكن استخدام هذه التقنيات لتحقيق المزيد من الأسئلة في تطوير أطرافه وأيضا أسئلة أخرى من التطور الجنيني الفقاريات. والشرط هو أن الجهاز / المنطقة المعنية يجب أن تتطور عند الجنين الفرخ هو الوصول إلى التدخل. وجود الأوعية الدموية الكبيرة في المنطقة حيث يحتاج إلى حاجز لتوضع يجعل في وقت لاحق حاجز تنسيب من المرحلة 13 أو 14 تحديا تقنيا. إذا يتم قطع الأوعية الدموية الكبيرة خلال وضع حاجز هذا يمكن أن يسبب وفيات الأجنة. تحقيقنا متى عوامل النسخ Tوبفعل bx5 وTbx4 لأول مرة في LPM كان محدودا من قبل أقرب المرحلة التي نحن يمكن أن تضع حاجزا من شأنه أن ينهي في وقت لاحق العكس إما الجناح أو برعم الساق على التوالي. كان من الممكن إلقاء الضوء على محاولة لمنع TBX تحريض الجينات في مراحل سابقة، أقرب إلى تكون المعيدة. يمكن وضعها في أقرب حاجز في منطقة الجناح الظني كان بنجاح مرحلة 8 و في مرحلة منطقة الساق 10. هذا البروتوكول هو ربما غير مناسبة لدراسة التعبير الجيني وراء مراحل برعم الطرف بسبب النمو السريع لاحق من شأنه أن يزيح الحاجز والنتائج أن تتصل فقط على الموقف المبدئي من الجدار.

بعد أن تتصل القيود المفروضة على أجنة الدجاج في هذا السياق، مزاياه أكثر الكائنات نموذج الفقاريات الأخرى كثيرة. الجنين الفرخ هو نموذج حيواني مناسبة جدا لهذا النوع من التدخل المادي في جنين الفقاريات. الأجنة كبيرة نسبيا، ويمكن الوصول إليها بسهولة throuGH قشر البيض. يمكن للمرء أن العودة إلى جنين لمزيد من التجارب (على سبيل المثال، وإزالة حبة ¹⁸ أو حتى حاجز) أو للاطمئنان على التقدم ببساطة عن طريق إزالة نافذة الشريط. وهناك مجال الممكن إدراج التصوير الحي أو الوقت الفاصل بين التصوير. نحن تصف طريقة وضع النوافذ بيض الدجاج التي تناسب بشكل خاص لتعمل على الأجنة مرحلة مبكرة. في حالة الدراسات أطرافهم من المهم والمفيد جدا أن هناك أحد أطرافه السيطرة المقابل لكل التجربة التي تعد بمثابة الرقابة الداخلية مثالية لكل تكرار البيولوجي.

لم يتم الابلاغ عن مزيج من استخدام الحواجز غير منفذة لمنع نمو الأطراف والخرز غارقة في الجزيئات يشير من قبل. لدينا تحليل مرنا التعبير التالي مثل هذه التدخلات هو أيضا رواية. هذه التقنيات مكنتنا من تشريح المشكلة الصعبة المتمثلة في حين عوامل أطرافهم النسخ محددة هي التي يسببها Tbx5 وTbx4 في LPM وأيضالتظهر في وقت لاحق، وذلك قبل بدء أطرافهم برعم، فإن وجود هذه الجينات TBX في LPM لا يكفي لتفعيل Fgf10 النسخ وبداية نمو برعم الطرف. أرقام 2G، 2D و 2E توضح هذه النتائج أيضا. غياب التعبير Tbx4 بعد الإدراج حاجز في المرحلة 10 في الشكل 2G هو في تناقض صارخ مع وجودها في 2D و 2E التالية الإدراج حاجز في المرحلة 15، بعد تحريض Tbx4. غرس حبات RA غارقة تسهيل إنقاذ برعم الطرف بدء التالية الإدراج الحاجز وحتى نقطة لالتهاب المفاصل الروماتويدي من و somites أساسية في عملية LPM قبل برعم الطرف ثمرة يمكن أن تبدأ. ويمكن استخدام هذه التقنيات على حل المزيد من الأسئلة في تطوير أطرافه ولكن أيضا أسئلة أخرى من التطور الجنيني من الفقاريات. ومن المرجح أن تكون مناسبة مناطق الدماغ والعين والجذع.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont No. 5 watchmakers forceps, x2	Fine Science Tools  www.finescience.de	11251-20
Dumont No. 4 watchmakers forceps, x2	Fine Science Tools  www.finescience.de	11241-30
Dumont strong forceps, type AA	Fine Science Tools  www.finescience.de	11210-10
Curved scissors with blades 2.5 cm long	Fine Science Tools  www.finescience.de	14061-11
Blunt ended curved forceps, ends approx 0.5 cm long	Fine Science Tools www.finescience.de	11065-07
Steel pin, 0.2 mm wide	Fine Science Tools  www.finescience.de	26002-20
Sharpening stone, square	Fine Science Tools  www.finescience.de	29008-01
Mineral oil
Needle holder	Fine Science Tools  www.finescience.de	26016-12
Clear tape, 50 mm x 66 m	www.5staroffice.com	295985
FGF4 protein			A gift from Cliff Tabin.
all-trans-retinoic acid	Sigma www.sigmaaldrich.com	R2625-50MG	Remember to protect from light.
BMS 493	Sigma www.sigmaaldrich.com	B6688-5MG
Scalpel blade No. 15	www.swann-morton.com	cat no. 0105
Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel	Bio-Rad www.bio-rad.com	153-7301	Beads for delivering protein.
AG1-X2 Ion exchange resin	Bio-Rad www.bio-rad.com	140-1251	Beads for delivering RA or BMS 493.
Incubator for eggs	Memmert www.hce-uk.com	LAB128
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma www.sigmaaldrich.com	P6148-1KG	Harmful, irritant, corrosive.  Handle powder in fumehood with full protective clothing.
Ethanol	Sigma www.sigmaaldrich.com	32221-2.5L
DMEM, high glucose	Gibco www.thermofisher.com	41965-039	500 ml
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific webshop.fishersci.com	D/4121/PB08	500 ml
Binocular Microscope	Leica www.leica-microsystems.com	MZ6	Replaced by M60
Chicken eggs	Henry Stewart & Co Ltd sales@medeggs.com		Brown Eggs