تلألؤ بيولوجي والقريبة من تحت الحمراء التصوير من التهاب العصب البصري والمخ التهاب في نموذج EAE من مرض التصلب العصبي المتعدد في الفئران

Summary

وتبين لنا تقنية لفي الجسم الحي تلألؤ بيولوجي الحية والأشعة تحت الحمراء القريبة التصوير من التهاب العصب البصري والتهاب الدماغ في النموذج التجريبي التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي (بنت) لمرض التصلب المتعدد في الفئران SJL / J.

Abstract

التجريبية التهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي (بنت) في SJL / J الفئران هو نموذج للتحويل بين التصلب المتعدد الانتكاس (RRMS). عشرات EAE السريرية واصفا العجز وظيفة الحركة هي قراءات الأساسية للالتهاب بوساطة في مأمن من الحبل الشوكي. ومع ذلك، عشرات ووزن الجسم لا تسمح لإجراء تقييم في الجسم الحي من التهاب الدماغ والتهاب العصب البصري. وهذا الأخير هو مظهر باكر ومتكررة في حوالي 2/3 من مرضى التصلب المتعدد. هنا، وتبين لنا طرق تلألؤ بيولوجي والتصوير الحي القريب من الأشعة تحت الحمراء لتقييم EAE أثار التهاب العصب البصري، التهاب الدماغ، وحاجز الدم في الدماغ (BBB) اضطراب في الفئران الحية باستخدام المجراة نظام التصوير. والركيزة إضاءة الحيوية تفعيلها من خلال oxidases أظهر في المقام الأول التهاب العصب البصري. كانت إشارة محددة وسمحت التصور من آثار الدواء والمرض مرة الدورات، التي توازي عشرات من السريرية. النانوية الفلورسنت مضاد للفيروسات التي بقيت داخل vasculaturاستخدمت البريد لفترات طويلة من الوقت لتقييم سلامة BBB. بالقرب من الأشعة تحت الحمراء وكشف التصوير تسرب BBB في ذروة المرض. كانت إشارة أقوى حول العينين. تم استخدام الركيزة القريب من الأشعة تحت الحمراء للمصفوفة metalloproteinases لتقييم التهاب أثار EAE. تدخلت لصناعة السيارات في مضان مع إشارة، تتطلب unmixing الطيفي للالكمي. وعموما، كان التصوير تلألؤ بيولوجي طريقة موثوق بها لتقييم التهاب العصب البصري والدواء الآثار المرتبطة EAE وكان متفوقة على التقنيات القريب من الأشعة تحت الحمراء من حيث خصوصية إشارة، متانة، وسهولة القياس الكمي، والتكلفة.

Introduction

Multiple sclerosis is caused by the autoimmune-mediated attack and destruction of the myelin sheath in the brain and the spinal cord¹. With an overall incidence of about 3.6 cases per 100,000 people a year in women and about 2.0 in men, MS is the second most common cause of neurological disability in young adults, after traumatic injuries^2,3. The disease pathology is contributed to by genetic and environmental factors⁴ but is still not completely understood. Autoreactive T lymphocytes enter the central nervous system and trigger an inflammatory cascade that causes focal infiltrates in the white matter of the brain, spinal cord, and optic nerve. In most cases, these infiltrates are initially reversible, but persistence increases with the number of relapses. A number of rodent models have been developed to study the pathology of the disease. The relapsing-remitting EAE in SJL/J mice and the primary-progressive EAE in C57BL6 mice are the most popular models.

The clinical EAE scores, which describe the extent of the motor function deficits, and body weight are the gold standards to assess EAE severity. These clinical signs agree with the extent of immune cell infiltration and myelin destruction in the spinal cord and moderately predict drug treatment efficacy in humans⁵. However, these signs mainly reflect the destruction of the ventral fiber tracts in the spinal cord. Presently, there is no easy, non-invasive, reliable, and reproducible method to assess in vivo brain infiltration and optic neuritis in living mice.

The in vivo imaging agrees with the 3 "R" principles of Russel and Burch (1959), which claim a Replacement, Reduction, and Refinement of animal experiments⁶, because imaging increases the readouts of one animal at several time points and allows for a reduction of the overall numbers. Presently, inflammation or myelin status is mainly assessed ex vivo via immunohistochemistry, FACS-analysis, or different molecular biological methods⁷, all requiring euthanized mice at specific time points.

A number of in vivo imaging system probes have been developed to assess inflammation in the skin, joints, and vascular system. The techniques rely on the activation of bioluminescent or near-infrared fluorescent substrates by tissue peroxidases, including myeloperoxidase (MPO), matrix metalloproteinases (MMPs)⁸, and cathepsins⁹ or cyclooxygenase². These probes have been mainly validated in models of arthritis or atherosclerosis^9,10. A cathepsin-sensitive probe has also been used for fluorescence molecular tomographic imaging of EAE¹¹. MMPs, particularly MMP2 and MMP9, contribute to the protease-mediated BBB disruption in EAE and are upregulated at sites of immune cell infiltration¹², suggesting that these probes may be useful for EAE imaging. The same holds true for peroxidase or cathepsin-based probes. Technically, imaging of inflammation in the brain or spinal cord is substantially more challenging because the skull or spine absorb bioluminescent and near-infrared signals.

In addition to inflammation indicators, fluorescent chemicals have been described, which specifically bind to myelin and may allow for quantification of myelination¹³. A near-infrared fluorescent probe, 3,3'-diethylthiatricarbocyanine iodide (DBT), was found to specifically bind to myelinated fibers and was validated as a quantitative tool in mouse models of primary myelination defects and in cuprizone-evoked demyelination¹⁴. In EAE, the DBT signal was rather increased, reflecting the inflammation of the myelin fibers⁵.

An additional hallmark of EAE and MS is the BBB breakdown, resulting in increased vascular permeability and the extravasation of blood cells, extracellular fluid, and macromolecules into the CNS parenchyma. This can lead to edema, inflammation, oligodendrocyte damage, and, eventually, demyelination^15,16. Hence, visualization of the BBB leak using fluorescent probes, such as fluorochrome-labeled bovine serum albumin⁵, which normally distribute very slowly from blood to tissue, may be useful to assess EAE.

In the present study, we have assessed the usefulness of different probes in EAE and show the procedure for the most reliable and robust bioluminescent technique. In addition, we discuss the pros and cons of near-infrared probes for MMP activity and BBB integrity.

Protocol

1. EAE التعريفي في SJL / J الفئران

1. الفئران
   1. استخدام منذ 11 أسابيع الإناث SJL / J الفئران والسماح لهم روض إلى غرفة التجريبية لمدة 7 أيام. استخدام ن = 10 الفئران في المجموعة.
   2. لتقييم تأثيرات الدواء وإدارة المخدرات وهمي لمجموعة المراقبة بشكل مستمر عن طريق مياه الشرب أو عن طريق الغذاء الكريات تبدأ بعد 3 أو 5 أيام التحصين (ن = 10 لكل مجموعة). في ذروة المرض، إدارة الدواء أو وهمي مع الحليب أو 3٪ رقائق الذرة ينقع بالماء السكر.
2. مادة التحصين
   1. استخدام عدة تحريض EAE تتكون من المستضد (الببتيد من البروتين شحم بروتيني، PLP139-151، 1 ملغ / مل مستحلب) في مستحلب مع مساعد الكامل فرويند (CFA، قتلت الحرارة المتفطرة السلية H37 رع) و 2 قارورة (5 ميكروغرام لكل منهما) من السم السعال الديكي مجفف بالتجميد (PTX).
   2. حل PTX (2 ميكروغرام / مل) في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، أي </ م> إضافة 1.5 مل من برنامج تلفزيوني على كل أنبوب PTX، وتخلط جيدا، وإزالة بنفس طرف الماصة، وإضافة إلى 1 مل من برنامج تلفزيوني في أنبوب 50 مل)؛ اخلط جيدا.
3. تحصين
   1. حقن حزب العمال التقدمي / CFA تحت الجلد في 2 أجزاء، كل 100 ميليلتر، سواء على قاعدة الذيل. لا حقن في الجزء الخلفي من الرقبة، لأن أي ردود فعل المناعة في الجلد في الجزء الأعلى من الظهر أو العنق ويشوش على تصوير الرأس والحبل الشوكي.
   2. ضخ 100 ميكرولتر من PTX البريتونى (الملكية الفكرية)، مرتين في الماوس، أول 1-2 ساعة بعد التطعيم، والثانية في 24 ساعة.
   3. للالسيطرة على الفئران، وضخ CFA من دون حزب العمال التقدمي (2 أجزاء من 100 ميكرولتر)، بالإضافة إلى PTX دون حزب العمال التقدمي.
4. التعامل مع الماوس بعد التطعيم
   1. وزن الفئران كل يوم حتى آخر ليوم 7، ثم وزن لهم يوميا.
      ملاحظة: الفئران تفقد حوالي 1 - 2 غرام من وزن الجسم خلال EAE. يمثل انخفاضا بداية EAE.
   2. تقييم الأعراض السريرية يوميا من يوم 7 الاتفاقجي لأنظمة القياسي بتسجيله (أي نقاط 0: لا تغييرات واضحة في الوظائف الحركية، يسجل 0.5: شلل البعيدة من الذيل، درجة 1: شلل ذيل الكامل، يسجل 1.5: شلل جزئي خفيف في إحدى أو كلتا رجليه الخلفيتين، يسجل 2: شلل شديد في رجليه الخلفيتين، يسجل 2.5: الشلل التام من الساق الخلفية واحد؛ النتيجة 3: الشلل التام من ساقيه الخلفيتين، يسجل 3.5: الشلل التام من رجليه الخلفيتين وشلل جزئي من الساق الأمامية واحد الموت ببطء الفئران مع عشرات من 3.5 أو أعلى ل > 12 ساعة.
5. EAE الدورة ووقت التصوير
   1. إجراء التصوير الأولى في بداية المرض، عندما تصل الفئران العشرات> 1، والتي سوف تحدث في جميع أنحاء يوم 10-12 بعد التحصين.
   2. إجراء التصوير الثاني في الذروة، والتي سوف يتم التوصل إلى 1 أو 2 بعد أيام من ظهور الاعراض عليهم الأولية وتستمر لمدة 1-3 أيام.
      ملاحظة: بعد ذلك، سوف الفئران يتعافى تماما في غضون 7 إلى 10 أيام. التصوير خلال فترات قد لا تزال تظهر تسرب الأوعية الدموية،لكن مؤشرات الالتهاب يجب أن تكون سلبية.

2. إضاءة الحيوية والتصوير القريبة من الأشعة تحت الحمراء من التهاب العصب البصري والمخ التهاب

1. إعداد نظام التصوير
   1. أداء في مجال التصوير المجراة مع أي المعدات التي تسمح لتحليل تلألؤ بيولوجي وإشارات الأشعة تحت الحمراء القريبة.
   2. حافظ على الفئران تحت 2-2،5٪ الأيزوفلورين التخدير خلال جميع الإجراءات التصوير.
   3. موقف واحد أو اثنين من الفئران بجانب بعضها البعض في الجهاز باستخدام إمدادات الغاز المتوسطة. وضع العمود الفقري العلوي في المركز.
   4. استخدام اثنين من الفئران في وقت واحد، واحد في كل مجموعة، لتقييم تأثيرات الدواء للمقارنة بين الأزواج. وهذا أمر مهم للتصوير إضاءة الحيوية.
   5. حماية الموقع من التحصين مع قطعة قماش سوداء وأخذ صورة فوتوغرافية وخط الأساس لتقييم المواقع الصحيحة من الماوس / الفئران. استخدام التركيز B بمسافة 6.5 سم إلى الكاميرا لجميع الصور.
2. الحقن والتصوير من التحقيق التهاب إضاءة الحيوية
   1. استخدام في الجسم الحي إعدادات نظام التصوير: برنامج التحصين الموسع-BLI، إم تصفية مفتوحة، مثال مرشح كتلة، fstop 1، binning 8، والتركيز B = 6.5 سم، والتعرض الإعلان 120 ق. التقاط صورة أساسية.
   2. ضخ 100 الملكية الفكرية ميكرولتر من كاشف chemiluminescent جاهزة للاستعمال (40 ملغ / مل). تخلط جيدا قبل ملء المحقن.
   3. التقاط الصور تلألؤ بيولوجي 5 و 10 و 15 دقيقة بعد الحقن. على مدار الساعة من ذروة إضاءة الحيوية التي تختلف بين الحيوانات.
      ملاحظة: سوف ذروة تحدث 5-10 دقائق بعد الحقن. انخفاض في 15 دقيقة إلى أن ليس هناك حاجة لمزيد من الصور. استخدام الماوس أزواج من مجموعات المراقبة والعلاج للقضاء على التحيز طفيفة نظرا لمختلف الدورات الوقت.
   4. شغل في وصف ذات الصلة إلى التجربة. لاحظ مربع الحوار المنبثقة تلقائيا؛ ويشمل المعلومات، مثل سلالة الماوس، الجنس، وأشر الوقت، والوقت من حقن التحقيق، مجموعة، الخ. حفظ كافة الملفات في سمجلد ني. سيكون لديهم علامات الساعة وجميع الأوصاف.
3. الحقن والتصوير النانوية الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء القريبة لسلامة BBB
   1. استخدام الأشعة تحت الحمراء القريبة التصوير epifluorescence في التركيز ب (المسافة: 6.5 سم). ماكسيما الإثارة / الانبعاثات من الجسيمات النانوية الفلورسنت مضاد للفيروسات و675/690 نانومتر. التقاط صورتين في أطوال موجية مختلفة، في Ex640 / Em700 وEx675 / Em720. استخدام ليالي 2 التعرض binning 8، وfstop 2. أخذ صورة خط الأساس.
   2. ضخ 70 ميكرولتر من النانوية الأشعة تحت الحمراء الفلورسنت مضاد للفيروسات الرابع عن طريق الوريد الذيل وتخيل الفئران 3 ساعات و 24 ساعة بعد الحقن باستخدام الإعدادات أعلاه. مزيج البئر حل قبل ملء المحقن.
   3. ضخ 0.9٪ كلوريد الصوديوم في السيطرة على الفئران، والتي سوف تكون هناك حاجة لتقييم خصوصية الإشارة.
4. الحقن والتصوير لجنة التحقيق الفلورسنت القريب من الأشعة تحت الحمراء للنشاط MMP
   1. يحلق أو يزيل الشعر من الرأس وشمنطقة العمود الفقري pper بحذر يوم واحد قبل التقاط الصورة الأساس. يجب عدم جرح الجلد.
   2. استخدام الأشعة تحت الحمراء القريبة التصوير epifluorescence في التركيز ب (المسافة: 6.5 سم). ماكسيما الإثارة / انبعاث التحقيق activatable المشاركة المتناقصة و680/700 نانومتر. التقاط صورتين في أطوال موجية مختلفة، في Ex640 / Em700 وEx675 / Em720. استخدام ليالي 1 التعرض binning 8، وfstop 2. أخذ صورة خط الأساس.
   3. إضافة 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X إلى أنبوب 1.5 مل من محلول جاهزة للاستخدام (20 نانومول / 1.5 مل في برنامج تلفزيوني 1X) بحيث تكون كافية لمدة 10 الفئران. تخلط جيدا قبل ملء المحقن.
      ملاحظة: حجم المقدمة لا تأخذ في الاعتبار أن يتم فقدان بعض وحدات التخزين خلال ملء حقنة وحقن.
   4. ضخ 150 ميكرولتر من د التحقيق عن طريق الوريد الذيل 24 ساعة قبل التصوير. حقن برنامج تلفزيوني فقط في الحيوانات السيطرة لتقييم خصوصية الإشارة.
   5. في 24 ساعة بعد الحقن، والتقاط صور برنامج التحصين الموسع-FL على الأقل اثنين من الأطوال الموجية، Ex640 / Em700 والمحررين 675 / EM720، مع إعدادات موضح أعلاه (1-ق التعرض، والتركيز B، binning 8، وfstop 2).
      ملاحظة: استخدام اثنين من موجات يسمح للunmixing الأطياف بطرح إشارة غير محددة.

3. تحليل صورة

1. تحليل تلألؤ بيولوجي (BLI)
   1. انقر نقرا مزدوجا فوق البرنامج لفتحه.
   2. في شريط القوائم العلوي، انقر على أيقونة ملف المتصفح، انتقل إلى الدليل من مجلد من هذه التجربة، وتحديده. هذا سيفتح جميع الملفات في المجلد في جدول.
   3. تكوين الأعمدة التي تبين أوصاف ذات الصلة إلى التجربة.
   4. لمراقبة الجودة، انقر نقرا مزدوجا فوق ملف على فأرة الحاسوب عدم الرد من دون أعراض EAE و / أو الماوس السذاجة تحقق خصوصية إشارات EAE.
      ملاحظة: يجب أن يكون هناك أي إشارة في الفئران ساذجة والحد الأدنى من إشارة في الفئران غير مستجيب.
      1. التحقق من الصورة الأساسية قبل حقن للمحترفينيكون لكل فأر كما مزيد من السيطرة على خصوصية إشارة. ينبغي أن يكون سلبيا.
   5. لتحديد صورة، انقر نقرا مزدوجا فوق الملف الأول من أول ماوس EAE وتحقق من شدة إضاءة الحيوية (طرفية شريط المدى) والتعريب. تحقق من كل الصور واحدة تلو الأخرى. إغلاق الملف مع أقل كثافة لكل الماوس (أي، والحفاظ على 2 من 3 صور لكل الماوس).
   6. صورة تعديل والتصدير
      1. انقر نقرا مزدوجا فوق الملف الأول إلى أن يكون كميا. مراقبة نافذة البوب ​​الجديد يصل. تحت عنوان "خيارات" (القائمة العلوية)، وتخصيص تسميات لعرضه في كل صورة.
      2. في لوحة أداة الصحيح، انتقل إلى "تعديل الصور". افتراضيا، يتم تعيين كثافة الحد الأدنى والحد الأقصى ل"السيارات" وعرضها في pseudocolor قوس قزح. حدد "يدوي" إلى تغيير الإعدادات إذا لزم الأمر.
         ملاحظة: على سبيل المثال، قد يكون كل صور المصدرة الحانات طرفية متطابقة (الدنيا متطابقة وماكسيما) لتكون قابلة للمقارنة بسهولة.تعديل الحدود الدنيا والحدود القصوى ليس له أي تأثير على النتائج الكمية.
      3. انقر على تصدير صورة، حدد بابوا نيو غينيا، الدليل، واسم الصورة
   7. الكمي من المناطق ذات الاهتمام (ROI)
      1. انتقل إلى أداة "العائد على الاستثمار" في لوحة الأدوات. حدد طريقة العائد على الاستثمار (دائرة، مستطيل، والسيارات، أو خالية من ناحية) وعدد رويس. مراقبة نافذة العائد على الاستثمار يطفو على السطح في نافذة الصورة.
      2. باستخدام الماوس، وضبط حجم وموضع. استخدام عتبات العائد على الاستثمار متطابقة لجميع الصور إذا تم استخدام أداة لصناعة السيارات في العائد على الاستثمار. استخدام المناطق متطابقة لجميع الصور إذا تم تعريف أحجام العائد على الاستثمار والمواقف يدويا (على سبيل المثال، رويس التعميم).
      3. انقر على "قياس RO.I. مراقبة نافذة البوب الجديد يصل. تخصيص الأعمدة (على سبيل المثال، اسم الملف، عدد الحيوانات، مجموعة، التجربة، منطقة، العدد الكلى، متوسط التهم، تهمة SD، دقيقة والحد الأقصى تحصي، منطقة، وقت نقطة، والوقت من حقن التحقيق، وما إلى ذلك). احفظ الإعدادات المخصصة. عندما إعادةعدي، حدد كافة (السيطرة + A)، ونسخ ولصق الجدول في جدول بيانات.
      4. تصدير الصورة كما بابوا نيو غينيا مع رويس في المكان. حفظ وإغلاق ملف الصورة.
   8. كرر الإجراء (الخطوات 3.1.6 - 3.1.7) لجميع ملفات الصور التي تحتاج إلى أن يكون كميا. نسخ كافة التحديد الكمي العائد على الاستثمار في جدول البيانات.
      ملاحظة: وهنا النتائج يمكن فرزها من قبل مجموعة، نقطة زمنية، وغيرها، وتحليلها إحصائيا. استخدام العد الكلي للإشارات تلألؤ بيولوجي في رويس التحليلات الإحصائية.
2. (الجرد) تحليل الأشعة تحت الحمراء القريب من الجسيمات النانوية الفلورسنت
   1. باستخدام عناصر التحكم في البرنامج، وضبط عتبة الصورة.
      ملاحظة: هذا ليس له أي تأثير على النتيجة الكمية.
   2. بصريا مقارنة الصور التي تم التقاطها في السابق / إم 675/720 والمحررين / إم 640/700 لتقييم خصوصية الإشارة.
   3. استخدام الصور التي تم التقاطها في السابق / إم 675/720 للتحليل الكمي (الإثارة القصوى: 680 نانومتر). تحديد رويس، والتي يمكن أن تستخدم أداة لصناعة السيارات في العائد على الاستثمار. ضبط عتبة لصناعة السيارات في العائد على الاستثمار واستخدامه لجميع الصور. قياس كفاءة مشع الإجمالية في رويس (راجع الخطوة 3.1).
3. (الجرد) تحليل الأشعة تحت الحمراء القريب من التحقيق الحساسة البروتيني
   1. باستخدام ضوابط البرنامج، وضبط عتبة الصورة.
      ملاحظة: هذا ليس له أي تأثير على النتيجة الكمية. أداء unmixing الطيفي لصناعة السيارات في مضان. ويتم تنفيذ الأداة unmixing في صورة حية. يستخدم-unmixing السيارات في السابق / إم 640/700 كما محدد، و675/720 كصورة السيارات الفلورسنت.
   2. حدد الصورة غير مخلوطة وتحديد رويس، كما هو موضح أعلاه. استخدام كفاءة مشع الإجمالية في رويس لالتحليلات الكمية والإحصائية.

النتائج

دورة الوقت من ضوء بارد من التهاب العصب البصري

كانت إشارة تلألؤ بيولوجي لجنة التحقيق التهاب الأقوى حول العينين ويحدث بشكل حصري في الفئران EAE مع التهاب العصب البصري. حدثت إشارة في أي ...

Discussion

ويظهر شريط الفيديو الحالي تقنيات تلألؤ بيولوجي ومضان الأشعة تحت الحمراء القريبة في التصوير المجراة من EAE في الفئران SJL / J. وتبين لنا أن تلألؤ بيولوجي التصوير باستخدام مسبار الحساسة للالتهاب يظهر أساسا التهاب العصب البصري، ويوافق على القياس الكمي مع التقييم...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AngioSpark-680	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	NEV10149	Imaging probe, pegylated nanoparticles, useful for imaging of blood brain barrier integrity
MMP-sense 680	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	NEV10126	Imaging probe, activatable by matrix metalloproteinases, useful for imaging of inflammation
XenoLight RediJect Inflammation Probe	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	760535	Imaging probe, activatable by oxidases, useful for imaging of inflammation
PLP139-151/CFA emulsion	Hooke Labs, St Lawrence, MA	EK-0123	EAE induction kit
Pertussis Toxin	Hooke Labs, St Lawrence, MA	EK-0123	EAE induction kit
IVIS Lumina Spectrum	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA		Bioluminescence and Infrared Imaging System
LivingImage 4.5 software	Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA	CLS136334	IVIS analysis software
Isoflurane	Abbott Labs, Illinois, USA	26675-46-7	Anaesthetic