السيطرة التعبير قناة ايون من خلال ترنسفكأيشن عابر محرض

Summary

أصبح يدرس القنوات الأيونية من خلال نظام معربا عن heterologously تقنية الأساسية في البحوث الطبية الحيوية. في هذه المخطوطة، فإننا نقدم وسيلة فعالة وقت لتحقيق رقابة مشددة التعبير القناة الايونية عن طريق أداء ترنسفكأيشن عابرة تحت سيطرة المروج محرض.

Abstract

ترنسفكأيشن، وتسليم من الأحماض النووية الأجنبية في خلية، هو أداة قوية في مجال البحوث البروتين. من خلال هذه الطريقة، يمكن التحقيق القنوات الأيونية من خلال تحليل الكهربية، وتوصيف الكيمياء الحيوية، ودراسات طفرية، وتأثيرها على العمليات الخلوية. تعداء عابرة تقدم بروتوكول بسيط في الذي يصبح فيه البروتين المتاحة للتحليل في غضون بضع ساعات إلى أيام. على الرغم من أن يقدم هذا الأسلوب بروتوكول كفاءة واضحة والوقت نسبيا، واحدة من العناصر الأساسية ومعايرة التعبير عن الجينات التي تهم المستويات ذات الصلة الفسيولوجية أو المستويات التي هي مناسبة للتحليل. تحقيقا لهذه الغاية، وقد ظهرت العديد من الطرق المختلفة التي توفر القدرة على التحكم في التعبير عن الجينات في المصالح. توفر عدة مستقرة بروتوكولات خلية ترنسفكأيشن وسيلة لإدخال دائمة الجين في الجينوم الخلوي تحت تنظيم وtranscrip التي تسيطر عليها التتراسيكلينتفعيل tional. في حين أن هذا الأسلوب تنتج مستويات التعبير موثوق بها، كل الجينات في المصالح يتطلب بضعة أسابيع من العمل المهرة بما في ذلك معايرة منحنى القتل، واختيار من مستعمرات الخلايا، وأكثر عموما الموارد. هنا نقدم البروتوكول الذي يستخدم ترنسفكأيشن عابرة من المحتمل قناة الموجبة أعضاء فصيلة V جينات مستقبلات عابر 1 (TRPV1) في نظام محرض وسيلة فعالة للتعبير عن البروتين في الطريقة التي تسيطر عليها والتي لا غنى عنها في تحليل القناة الايونية. علينا أن نظهر أن استخدام هذه التقنية، ونحن قادرون على أداء التصوير الكالسيوم، خلية كاملة، وتحليل قناة واحدة مع مستويات قناة تسيطر المطلوبة لكل نوع من جمع البيانات مع ترنسفكأيشن واحد. وعموما، هذا يوفر تقنية قابلة للتكرار والتي يمكن استخدامها لدراسة هيكل القنوات الأيونية وظيفة.

Introduction

معربا عن Heterologously أنظمة هي واحدة من أكثر التقنيات المستخدمة على نطاق واسع لدراسة العديد من الوظائف الخلوية ^1. جعلت لها الانظار الذاتية البروتين، ومتطلبات الحد الأدنى من الصيانة، والنمو موثوق بها، والقدرة على تناول وتعبير عن الحمض النووي الأجانب خطوط الخلايا مثل الجنينية البشرية الكلى (HEK293) والصينية الهامستر المبيض (CHO) تقريبا من الضروري ان الأبحاث البيولوجية ^{2 و 3.} وتشمل مجالات البحث باستخدام أنظمة مغاير بروتينات الغشاء، مما يشير الى داخل الخلايا، والنشاط الأنزيمي. بعد ترنسفكأيشن من الحمض النووي الأجانب إلى داخل الخلية، والعديد من أشكال مختلفة من التحليل يمكن أن يؤديها، بما في ذلك الكهربية، والتصوير الكالسيوم ratiometric، لطخة غربية، الخ ^{4، 5.}

ويرجع ذلك إلى مجموعة واسعة من التطبيقات المحتملة للأنظمة تعبير مغايرة، وكثير من احوقد وضعت الكواشف والمنتجات الشمالي للاستفادة من هذه الخلايا وصفاتهم ^6. نظم تسليم الحمض النووي التي عابر أو دائم دمج الحمض النووي الأجانب إلى داخل الخلايا لدراسة البروتين دخيلة أصبحت واحدة من أكثر الأدوات شعبية ومفيدة للبحث البيولوجي. وبشكل أكثر تحديدا، ويستخدم على نطاق واسع transfecting عابر الحمض النووي في الخلية على أنها عملية بسيطة، مباشرة إلى الأمام التي تتطلب القليل نسبيا من الوقت والمواد. وعلاوة على ذلك، فإن نسبة النجاح من الخلايا التي تخضع ترنسفكأيشن مرتفع ^7. هذه التقنية هي موثوقة جدا عندما جنبا إلى جنب مع الجين علامة مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، ويمكن استخدامها في العديد من التقنيات المختلفة مثل التصوير الكالسيوم والكهربية ^5. للأسف، على الرغم من، معربا عن عابر الحمض النووي في الخلايا المضيفة يأتي مع بعض العثرات الرئيسية، وليس في الأقل مستوى التعبير في الخلية لا يمكن الاعتماد عليها. عدد النسخ من البلازميد اتخذت شص في الخلية لا يمكن السيطرة عليها، وبالتالي فإن التعبير بين التجارب الفردية يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا ^2. تصبح هذه قضية هامة عند أي محاولة لمحاكاة الظروف الفسيولوجية، أو أداء تقنيات دقيقة لجمع البيانات.

كحل للمضاعفات المذكورة أعلاه، وقد تم تصميم بروتوكولات ترنسفكأيشن مستقرة يمكن من خلالها إدخال الجين في جينوم الخلية تحت رقابة مشددة من المروج محرض، مثل نظام التتراسيكلين التعبير كاظمة، وضمان واحد نسخة من البلازميد يدمج في جينوم كل خلية، ويعبر عنها إلا بعد تحريض آلية النسخ، على سبيل المثال، في حضور الدوكسيسيكلين. في حين أن هذا لا يحل العقبات من مستويات بروتين تعبير متناسقة، يفقد هذه الطريقة راحة بروتوكول سريعة وبسيطة نسبيا من تعداء عابر. إنشاء خط الخلية مستقرة يأخذ أسابيع قليلة على الأقل في حركتيح واحد يجب معايرة منحنى قتل من قبل المضادات الحيوية المحددة للحفاظ على التعبير البروتين وضمان التكامل بين ناقلات وبمهارة تحديد وتنمو المستعمرات الخلية. عموما هذا يأخذ مزيدا من الوقت والجهد مع انخفاض نسبة النجاح ^8.

هنا، ونحن نقدم بروتوكول المتوسطة التي تعتمد على نقاط القوة في كل من الخيارات ترنسفكأيشن شعبية لتوفير وسيلة بسيطة وفعالة للسيطرة على مستويات التعبير في أي خط الخلية محرض. مع الحفاظ على الخلايا مع نظام تيت محرض، نحن عابر transfect لدينا الجينات في المصالح، عابر مستقبلات المحتملة قناة الموجبة أعضاء فصيلة V 1 (TRPV1)، ligated في ناقلات التي يمكن أن تجمع بين homologously مع نظام قامع. وبهذه الطريقة، يمكن إدخال الجين في الخلايا دون بدأوا يعبرون. فقط مع إضافة الدوكسيسيكلين لم تبدأ الجينات للتعبير، مما يسمح لنا لمعايرة مستويات البروتين EXPRession وفقا لتقنية أو المستويات التي سجلت في الظروف الفسيولوجية. كما يتجنب بروتوكول لدينا مضاعفات طويلة المرتبطة توليد خط خلية التعبير عن ثابت. نبدأ من خلال إظهار تغير مستويات تفعيل TRPV1 في التصوير الكالسيوم من الامم المتحدة التي يسببها من خلال أربع ساعات من تحريض وكيف ارتفاع مستويات الكالسيوم داخل الخلايا يرتبط. نحن ثم تكرار البروتوكول في تكوين خلية كاملة من تقنية المشبك التصحيح، والتي تبين تيار متزايد مع زيادة الوقت من الاستقراء. وأخيرا، فإننا نقدم أمثلة من التسجيلات الكهربية قناة واحدة، وتبين أن هذه التقنية مفيدة بشكل خاص للتعبير تسيطر عليها عندما تبحث عن جمع البيانات الدقيقة على أساس الوحدات الفردية من البروتين. من خلال بروتوكول لدينا، ونحن نقدم وسيلة مريحة للسيطرة على التعبير البروتين في النظم مغاير مع تجنب المضاعفات زراعة الخلايا طويلة، وبالتالي توفير وسيلة للسيطرة على الأوضاع بين التجارب وتوفير موإعادة النتائج قابلة للتكرار.

Protocol

1. Ligating الجينات الاهتمام في الموقع كظوم من المتجهات

1. الحصول على ناقلات محرض مثل pcDNA5 / FRT / للأو pcDNA4 / لل.
2. تحليل الجينات في المصالح لأي تقييد مواقع يحتمل أن تكون عرضة في منتصف الجينات التي هي واردة أيضا في موقع استنساخ متعددة للناقلات التي اختارها في الحمض النووي SILICO تحليل البرمجيات ^4.
3. باستخدام تقنيات PCR تداخل معيار ^4، تطويق الجينات في المصالح مع موقعين الاعتراف انزيم التقييد مختارة (التي لا توجد في الجين)، وهو أول إدراج قبل كودون البداية، والثاني بعد توقف كودون.
4. هضم كل من ناقلات وتضاف مع الإنزيمات تقييد (المختار في الخطوة 1.2) في درجة حرارة الانزيمات 'لمدة ساعة واحدة، تليها إضافة حدة واحدة العجل الأمعاء الفوسفاتيز (CIP) إلى رد فعل ناقل فقط لمدة 30 دقيقة من أجل تجنب الذاتي ربط.
5. تحميل الحمض النووي يهضم على هلام الاغاروز 1٪ وفصل قطاعات المشقوق من قبل الكهربائي ^9.
6. باستخدام الأشعة فوق البنفسجية، وقطع مع شفرة قطعة من هلام يحتوي على شرائح المرجوة من ناقلات وتضاف إلى أن ligated.
7. استخراج شرائح الحمض النووي من القطع هلام الاغاروز (باستخدام المتاحة مجموعات استخراج الحمض النووي التجارية) وقياس تركيز النهائي من قبل معمل في 260 نانومتر.
8. Ligate الجينات في المصالح في ناقلات مختارة محرض باستخدام T4 انزيم يغاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. من أجل زيادة احتمال إدراج ligating مع ناقلات، واستخدام نسبة 3: 1 المولي من إدراج: ناقل. للسيطرة، وإعداد رد فعل ربط يتضمن فقط النواقل.
9. للتحول البكتيريا، إضافة 10 نانوغرام من ناقلات وحده، وناقلات + الجين في 50 ميكرولتر المختصة كولاي. احتضان أنبوب على الجليد لمدة 30 دقائق تليها 45 ثانية حضانة في درجة حرارة 42 درجة مئوية. المكان على الفور إلى الوراءعلى الجليد لمدة دقيقتين ونقل البكتيريا تتحول إلى 500 ميكرولتر LB المتوسطة. احتضان لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية تحت الإثارة في 220 دورة في الدقيقة.
10. لاختيار من البكتيريا تتحول بنجاح، لوحة 100 ميكرولتر من كل رد فعل (كما هو موضح في 1.9) على لوحة أجار LB مستعدة تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة (على سبيل المثال، 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين عند استخدام pCDNA4 / TR).
11. السماح لتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. يمكن تخزين لوحات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين عن طريق لف لهم بإحكام في فيلم البارافين البلاستيك.
12. رفع المستعمرات الفردية باستخدام طرف 10 ميكرولتر، والسماح لتنمو بين عشية وضحاها في 3 مل LB + المتوسطة المضادات الحيوية عند 37 درجة مئوية تحت الإثارة في 220 دورة في الدقيقة. البكتيريا مع الحمض النووي من الفائدة قد يتم تجميد (-20 درجة مئوية) لمدة التخزين على المدى القصير بواسطة الطرد المركزي في LB والبكتيريا في 11000 x ج والشفط من طاف. يتطلب التخزين على المدى الطويل تجميد البكتيريا كما أسهم الجلسرين في -80 درجة مئوية.
13. استخراج الحمض النووي throuغ مصغرة الإعدادية وقياس تركيز النهائي من قبل معمل في 260 نانومتر ^5.
14. تأكيد الإدراج الناجح لجينة من الفائدة عن طريق تسلسل بناء تنقيته ^4. بدلا من ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم الهضم التشخيص للبناء من الانزيمات تقييد استخدام الكهربائي لفصل قطع شرائح وتقييم وجودهم وطول لهذه الغاية ^(4).

2. زراعة خطوط خلية التعبير عن TetR

1. الحصول على خط زراعة الخلايا إيواء البلازميد تيت كاظمة إدراجها في الحمض النووي الجيني. هنا سوف تكون مكتوبة بروتوكول باستخدام الجنينية خلايا 293T الكلى البشرية (كلوة-293T) بإيواء pcDNA6 / TR البلازميد كمثال على ذلك.
2. خلايا البذور في 100 ملم لوحة زراعة الأنسجة مع Dulbecco والنسور متوسطة التعديل (DMEM) تستكمل مع FBS 10٪، 1٪ البنسلين، الستربتوميسين، 2 ملي لتر الجلوتامين، و 25 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.3 (هنا: DMEM كامل)، واحتضان O / N في 37 و# 176؛ ج و 5٪ CO _2. وينبغي أن يتم عن العمل مع الخلايا في غطاء محرك السيارة البيولوجي تحت ظروف معقمة.
3. من أجل الحفاظ على التعبير عن الجينات تيت كاظمة، نضح في والمتوسطة واستبدالها مع DMEM كامل تستكمل مع 5 ميكروغرام / مل blasticidin. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.
4. مرة واحدة الخلايا تصل إلى 80-90٪ confluency، نضح المتوسطة ويغسل بلطف الخلايا مرتين مع DPBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) درجة حرارة 37 درجة مئوية.
5. من أجل رفع بلطف الخلايا دون التسبب في الأضرار الميكانيكية، واحتضان الثقافة في DMEM تحتوي على 0.05٪ التربسين تحسنت إلى 37 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة.
6. عرقلة عمل التربسين مع حجم مساو من DMEM كاملة. ماصة بلطف صعودا وهبوطا من أجل رفع الخلايا ونقلها إلى أنبوب العقيمة.
7. الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
8. نضح طاف واستبدالها مع 1 مل كاملة DMEM. ماصة الحل مع الخلايا صعودا ونزولا حتى لاويمكن رؤية كتل الخلايا. عد وحساب عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
9. البذور 1-2 × 10 ⁶ خلايا في 100 مم طبق زراعة الأنسجة التي تحتوي على 12 مل كاملة DMEM مع 5 ميكروغرام / مل blasticidin. انقسام الخلايا مرتين في الأسبوع لأنها تصل إلى 90٪ confluency.

3. Transfecting على البلازميد من الاهتمام إلى خلايا

1. باستخدام نفس الأسلوب من خلايا تقسيم كما هو موضح أعلاه، نقل الخلايا إلى الآبار في لوحة 12-جيدا أعدت مع 0.9 مل كاملة DMEM، وتكون كافية لجعل 50٪ متموجة (~ 200000 خلايا)، واحتضان ليلا 37 درجة مئوية في CO ₂ الحاضنة.
2. إعداد خليط ترنسفكأيشن مع pcDNA4 / TO تحتوي على الجينات في المصالح، البلازميد خامل، ليصبح إجمالي مبلغ الحمض النووي إلى 1 ميكروغرام (إذا لزم الأمر)، 3 ميكرولتر الدهون كاشف ترنسفكأيشن وDMEM لجعل الحجم النهائي 100 ميكرولتر. مبلغ الأمثل للDNA البلازميد ليتم استخدامها على نطاق واسع يختلف التعبير عن بروتينات مختلفة في فعالية مختلفة. للالمنتخبتجارب rophysiological، وتشمل EGFP في التعبير البلازميد الثدييات في كوكتيل ترنسفكأيشن من أجل رؤية الخلايا التي تخضع ترنسفكأيشن ⁴ بنجاح.
3. احتضان الخليط ترنسفكأيشن في RT لمدة 30 دقيقة.
4. Transfect الخلايا بواسطة pipetting الخليط ترنسفكأيشن قطرة من الحكمة على الخلايا مطلي في 12 لوحة جيدا والصخور لوحة بقوة لضمان تشتت متجانس من الحمض النووي وكاشف ترنسفكأيشن. يجب أن تكون الخلايا ~ 80٪ متكدسة في وقت ترنسفكأيشن.
5. احتضان خلايا transfected O / N عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.
6. تأكد من أن الخلايا و transfected بنجاح من خلال مراقبة إشارة مضان EGFP تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية في صباح اليوم التالي إذا أداء الكهربية.

4. خلايا الطلاء على بولي-D-ليسين (PDL) Coverslips / ويلز

1. تعقيم 12 ملم coverslips من إخماد مع 70٪ من محلول الإيثانول الأيسوبروبيل. الجافة ووضع coversl احدالملكية الفكرية في كل بئر من 24 لوحة جيدا لتسجيل الكهربية.
2. ماصة حل 0،1-0،2 ملغ / مل حل PDL على كل ساترة أو بئر من غرفة التصوير الكالسيوم.
3. السماح للجلوس لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ الحاضنة.
4. يغسل مع ثقافة خلية الصف الماء المقطر المزدوج (أحواض دبي الجافة العالمية) ثلاث مرات، الشفط بين كل غسل. بعد غسل النهائي، يجف تماما والسماح للجلوس في RT.
5. لالكهربية، وملء تحتوي كل منها على جانب ساترة PDL المغلفة مع 500 ميكرولتر كاملة DMEM تحسنت إلى 37 درجة مئوية.
6. تنفيذ نفس طريقة تقسيم خلايا transfected كما هو موضح أعلاه. بعد إعادة التعليق الخلايا بعد العلاج التربسين والحجب، ونقل 80 ميكرولتر من الخلايا (أو ما يقرب من 30000 الخلايا) إلى مركز كل ساترة PDL المغلفة لتسجيل الكهربية. تسمح للخلايا ليستقر على 1.5 ساعة على الأقل أو احتضان ليلا 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ الحاضنة.
7. للكالسيوم نقل التصوير والبقعة 20 ميكرولتر من الخلايا (حوالي 20،000 الخلايا) إلى مركز كل PDL التصوير الكالسيوم المغلفة جيدا. تسمح للخلايا ليستقر لمدة 30 دقيقة على الأقل، وإضافة 180 ميكرولتر DMEM الكامل إلى كل بئر.

5. تحريض التعبير الجيني

1. يعد حل الأسهم الدوكسيسيكلين من 1 ملغ / مل في أحواض دبي الجافة العالمية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. حافظ على حل الأسهم محمية من الضوء في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أسابيع. للتخزين على المدى الطويل الحفاظ الدوكسيسيكلين الحل السهم عند -20 درجة مئوية.
2. إعداد الطازجة 2 ميكروغرام / مل (الكهربية) أو 3 ميكروغرام / مل (التصوير الكالسيوم) حل الدوكسيسيكلين في DMEM كاملة ودافئة إلى 37 درجة مئوية.
3. للتسجيلات الكهربية، ماصة 500 ميكرولتر من 2 ميكروغرام / مل الدوكسيسيكلين حل كل بئر لجعل تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / مل الدوكسيسيكلين. للتصوير الكالسيوم، إضافة 100 ميكرولتر من 3 ميكروغرام / مل من محلول الدوكسيسيكلين إلى كل بئر لجعل concentra النهائينشوئها من 1 ميكروغرام / مل الدوكسيسيكلين. أكتب ساعة الاستقراء.
4. احتضان لكمية من الوقت المطلوب لتحريض عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.

6. المعايرة الجدول الزمني للتعبير البروتين

1. معايرة تعبير البروتين من خلال التصوير الكالسيوم ^{5، 10}
   1. يعد حل رينغر (140 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي بوكل، 1.8 ملي CaCl _2، 2 ملي MgSO ₄ و 20 ملي HEPES، ودرجة الحموضة تعديلها إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم) ودافئة إلى 37 درجة مئوية.
   2. إعداد تشبع تركيزات قناة ناهض في حل رينغر. لأنه يخفف من كمية ناهض عندما تضاف إلى غرف التصوير الكالسيوم التي تحتوي على الخلايا وحل خارج الخلية، مضاعفة كمية التركيز النهائي المطلوب من ناهض. وهذا أيضا يجعل كمية من حل حمام في كل حاسمة جيدا للسيطرة.
   3. يعد حل غير الأيونية F-127 20٪ W / V في Dهيئة علماء المسلمين. الحرارة الحل إلى 40 درجة مئوية حتى يذوب غير الأيونية F-127. تخزين غير الأيونية F-127 حل في RT ودافئة إلى 40 درجة مئوية قبل الاستخدام. يستخدم غير الأيونية F-127 للمساعدة في تفريق acetoxymethyl (ص) استرات مؤشرات أيون الفلورسنت مثل FURA-2 في المحاليل المائية.
   4. نضح المتوسطة واستبدالها حل FURA-02:00 تحميل (حل رينغر تستكمل مع 2-3 ميكرومتر FURA-02:00، 0.02 ملغ / مل غير الأيونية F-127 و 10 ملم مد الجلوكوز).
   5. احتضان لمدة 60 دقيقة في RT في الظلام.
   6. نضح FURA-02:00 الحل وغسل الخلايا مع + 10 ملي حل مد الجلوكوز رينغر لإزالة الصبغة خارج الخلية. كرر هذه الخطوة مرتين.
   7. ترك + 10 ملي حل مد الجلوكوز 200 ميكرولتر قارع الأجراس في كل بئر واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
   8. ضع دائرة على خشبة المسرح فوق المجهر الأنف قطعة وثبته مع حامل.
   9. تشغيل مصباح، وكاميرا ومجهر وحدد FURA-2 فلتر للكشف عن الانبعاثات في 510 نانومتر الرعاياelength.
   10. ضبط التكبير المطلوب وتركز الخلايا في الحقل المحدد.
   11. في الظلام، وطرح ضوء الخلفية وتعيين وقت التعرض.
   12. تعيين أخذ العينات الصورة في معدل وسجل مضان الاستجابة المطلوبة من FURA-2 خلايا تحميلها بواسطة مثيرة لهم في 340 و 380 نانومتر موجات. نسبة 340/380 إشارات مؤشرا للداخل الخلايا تركيز الكالسيوم ^2+، وبالتالي أيضا للنشاط TRPV1.
   13. إضافة 2 ميكرومتر كشافات في حل 200 ميكرولتر رينغر قبل pipetting لخلق تركيز تشبع النهائي من 1 ميكرومتر كشافات من أجل تقييم مستوى التعبير عن TRPV1.
   14. تحليل استجابة TRPV1 وفقا لآخر الاستقراء وتحديد بروتوكول للبروتين من الفائدة.
2. ضبط تعبير البروتين في النظم مغاير باستخدام تكوين خلية كاملة من تقنية المشبك التصحيح ^{4 و 11.}
   1. إعداد رانه استحمام حل (ملم) 140 كلوريد الصوديوم، 2.3 بوكل، 2 MgSO _4، 5 HEPES، و 5 2- (N-morpholino) حمض ethanesulfonic (MES)، بعد تعديلها لدرجة الحموضة 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم.
   2. إعداد تشبع تركيزات قناة ناهض في حل خارج الخلية.
   3. سحب أقطاب الزجاج مع القطر الداخلي (ID) من 1.10 ملم وقذائف تلميع لمقاومة 2-4 MΩ.
   4. يعد حل ماصة (ملم) 130 بوكل، 4 كلوريد الصوديوم، 2 MgSO _4، 0.5 CaCl _2، 1 EGTA و 10 HEPES تعديلها لدرجة الحموضة 7.2 مع KOH. تصفية حل ماصة قبل استخدامها. قبل كل تجربة، وملأت واحد، وإطلاق النار مصقول ماصة الزجاج الخلفي عن طريق غمر طرف في حل ماصة لمدة دقيقة على الأقل، ثم شغل باستخدام طرف ذاب وامتدت مع حقنة مليئة نفس الحل ماصة.
   5. رفع بلطف ساترة واحدة PDL المغلفة مع الخلايا مطلي من البئر إلى 35 مم طبق بتري بلاستيكية مملوءة ما يقرب من 2 حل حمام مل في RT. نلاحظ في ظل الجيش الشعبيالمجهر ط الفلورسنت.
   6. تحديد موقع الخلية إيجابية EGFP، كما تصور مع المجهر epifluorescent، على ساترة المعدة والانتقال إلى وسط الميدان تصور.
   7. إرفاق ماصة شغل لصاحب ماصة للmicromanipulator، وحقن كمية صغيرة من الضغط الإيجابي في النظام لتجنب التلوث من الحل ماصة داخل الخلايا. خفضه إلى ما فوق GFP - خلية إيجابية، والتحقق من المقاومة الصحيحة.
   8. كما اللمسات ماصة الخلية، وتطبيق كمية صغيرة من الضغط السلبي من أجل إنشاء ختم GΩ بين ماصة الزجاج وغشاء الخلية.
   9. مع ذلك، نبضة قصيرة حادة من الشفط، وكسر غشاء الخلية، مما يتيح للماصة لتتلامس مع محتويات الخلايا من الخلية.
   10. تشغيل وضع مكبر للصوت لخلية كاملة، وخفض مرشح والإخراج مكاسب بسل إلى 1-5 كيلو هرتز و0.5α، على التوالي.
   11. تسجيل الاستجابة الحالية لتشبعتركيزات قناة ناهض باستخدام سلالم الجهد أو بروتوكول مجانا الفجوة.
   12. لأن الكفاءات التعبير تتغير بين مختلف البروتينات، كرر التسجيلات باستخدام مختلف الأوقات طول الاستقراء.
3. تحديد زمن التحريض المثالي للتسجيلات قناة واحدة ^(4).
   1. يعد حل (ملم) 150 نا غلوكونات، 15 كلوريد الصوديوم، 5 EGTA، و 10 HEPES، بعد تعديلها لدرجة الحموضة 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم، كحل ماصة. من أجل حل الحمام، استخدام الحل من الخطوة 6.2.1.
   2. كرر الإجراء خلية كاملة باستخدام الرقم 0.86 ملم الماصات الزجاج المصقول النار على المقاومة من 10-12 MΩ ووضع عقد إمكانية -40 بالسيارات.
   3. إنشاء ختم على الغشاء كما هو موضح سابقا وتمزق الغشاء.
   4. باستخدام micromanipulator، ورفع ماصة مع التصحيح غشاء بعيدا عن الخلية.
   5. وضع نظام نضح مباشرة بجوار ماصة تحتوي على التصحيح الغشاء.
   6. ر أقلانه بسل تصفية والانتاج الربح إلى 2-5 كيلو هرتز و10α، على التوالي.
   7. يروي تشبع تركيزات ناهض على التصحيح الغشاء، وتقييم إذا كان التصحيح يحتوي على قنوات واحد أو أكثر وفقا لاستجابة.
   8. تحليل عدد من بقع قناة واحدة سجلت بنجاح ضد الساعة الحث تطبيقها على الخلايا. ضبط الوقت الاستقراء وفقا للنتائج المرجوة.

النتائج

بسرعة لخلق نموذج التعبير محرض، التي قطعناها على أنفسنا استخدام الخلايا HEK293 التي تعبر عن بروتين التتراسيكلين كاظمة (TR) (على سبيل المثال، T-REX-293) وناقلات التي تحتوي على تسلسل المشغل التتراسيكلين (تيتو) بين المروج CMV وموقع استنساخ متعددة (على سبيل...

Discussion

ترنسفكأيشن هو بروتوكول يستخدم على نطاق واسع للتعبير البروتين والبحوث، مع العديد من الأشكال المختلفة لتحسين الاتساق التعبير والاستقرار. توفر الكواشف ترنسفكأيشن عابرة بسيطة وسهلة لاستخدام بروتوكول حيث يمكن تحليل الخلايا والبروتين من الفائدة خلال ساعات ليلة وضحاها ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V102020
pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V103320
PureLink Quick PCR Purification Kit	Invitrogen	K310001
Swift™ MaxPro Thermal Cycler	Esco	n.a
Restriction Enzymes	ThermoScientific Fisher	ER0501
Agarose	Lonza	50004
PureLink Quick Gel Extraction Kit	Invitrogen	K210012
NanoDrop 2000c	ThermoScientific Fisher	ND-2000C
T4 DNA Ligase	ThermoScientific Fisher	EL0011
One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli	ThermoScientific Fisher	C404006
Ampicillin (Sodium), USP Grade	Gold Bio	A-301-5
Tryptone for microbiology	Merck	6.19305E+13
Yeast Extract	BD worldwide	212750
SIF6000R Incubated Shaker	LAB COMPANION	45H118
NucleoSpin®plasmid	Macherey Nagel	740588.25
MS 300V Power Supply	Major Science	MP-300V
Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System	ThermoScientific Fisher	B1A
T-REx™-293 cell line	Invitrogen	R710-07
DMEM (1x), liquid (high glucose)	Gibco	41965-039
HindIII-HF®	NEB	R3104S
ApaI	NEB	R0114S
CutSmart® Buffer	NEB	B7204S
pcDNA™6/TR  Mammalian Expression Vector	ThermoScientific Fisher	V102520
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, E.U.-approved, South America origin	Gibco	10270106
HEPES Buffer Solution (1 M)	Biological Industries	03-025-1B
Penicillin-Streptomycin Solution	Biological Industries	03-031-1B
L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM)	Biological Industries	03-022-1B
Heracell™ 150i CO2 Incubator	ThermoScientific Fisher	51026406
MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet	ThermoScientific Fisher	51025411
Blasticidine S hydrochloride	Sigma-Aldrich	15205-25MG
Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline (DPBS) Modified, without calcium chloride and magnesium chloride	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300054
Double Neubauer Ruled Metallized Hemacytometer	Hausser Scientific	31000
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
TransIT®-LT1 Transfection Reagent	Mirus	MIR 2300
glass coverslips, #1 thickness, 12 mm diameter round	Knittel Glass	GG-12
BioCoat™ Poly-D-Lysine (PDL)	Corning	354210
Water, Cell Culture Grade	Biological Industries	03-055-1A
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891-1G
Fura-2, AM ester	Biotium	BTM-50034
Pluronic® F-127	Sigma-Aldrich	P2443-250G
µ-Slide 8 Well	ibidi	80826
(E)-Capsaicin	Tocris	462
Olympus IX70 Fluorescence Microscope	Olympus	n.a
Lambda DG-4 Wavelength Switcher	Sutter Instruments	n.a
EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera	QImaging	n.a
MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software	Molecular Devices	n.a
Thin Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-110-7.5HP
Standard Walled Borosilicate Tubing	Sutter Instruments	B150-86-7.5HP
Dimethyl sulfoxide anhydrous	Sigma-Aldrich	276855
P1000 micropipette puller	Sutter Instruments	P-1000
MF-900 Microforge	NARISHIGE	n.a
ValveBank perfusion sysytem	AutoMate Scientific
Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System	Molecular Devices	n.a
Axopatch 200B Amplifier	Molecular Devices	n.a
pCLAMP 10.6 Software	Molecular Devices	n.a
micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225