JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نقدم بروتوكول ليحلل الألياف العضلية السريعة، والذي يسمح تحسين نوعية تلطيخ، والحصول بالتالي التلقائي وتقدير حجم السكان الألياف باستخدام يماغيج البرمجيات المتاحة بحرية.

Abstract

تقدير حجم السكان الألياف العضلية ويوفر أعمق من آثار المرض، والصدمات النفسية، ومختلف التأثيرات الأخرى على تكوين الهيكل العظمي والعضلات. وقد استخدمت أساليب تستغرق وقتا طويلا مختلفة تقليديا لدراسة السكان الألياف في العديد من مجالات البحث. ومع ذلك، وضعت مؤخرا أساليب المناعى على أساس الميوسين السلسلة الثقيلة تعبير البروتين توفير بديل سريع لتحديد أنواع الألياف متعددة في مقطع واحد. هنا، نقدم بروتوكول سريع وموثوق بها وقابلة للتكرار لتحسين جودة تلطيخ، مما يتيح الاستحواذ التلقائي من المقاطع العرضية كلها وتقدير التلقائي للسكان الألياف مع يماغيج. لهذا الغرض، يتم قطع العضلات والهيكل العظمي جزءا لا يتجزأ في المقاطع العرضية، ملطخة باستخدام الميوسين السلاسل الثقيلة الأجسام المضادة مع الأجسام المضادة فلوري الثانوية ودابي لتلطيخ الخلايا نوى. ثم يتم فحص المقاطع العرضية كلها تلقائيا باستخدام ماسح ضوئي الشرائح للحصول على دقة عالية مركبصور من العينة بأكملها. يتم تنفيذ التحليلات السكان الألياف في وقت لاحق لتحديد الألياف البطيئة والمتوسطة والسريعة باستخدام ماكرو الآلي ليماغيج. لقد أثبتنا سابقا أن هذه الطريقة يمكن تحديد السكان الألياف موثوق بها إلى درجة من ± 4٪. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب يقلل من التباين بين المستخدم والوقت في التحليلات باستخدام بشكل كبير من منصة يماغيج مفتوحة المصدر.

Introduction

الهيكل العظمي تكوين العضلات يخضع لتغيرات عميقة خلال العمليات الفسيولوجية مثل الشيخوخة 1، 2، 3 التمرين، 4، 5، 6، 7، أو العمليات الفيزيولوجية المرضية مثل مرض 8، 9، 10 أو صدمة 11. وبالتالي، عدة مجالات تركيز الأبحاث على تأثيرات هيكلية هذه العمليات لفهم التغيرات الوظيفية. أحد الجوانب الرئيسية التي تحدد وظيفة العضلات هو تكوين ألياف العضلات. ألياف العضلات تعبر عن الميوسين مختلفة السلسلة الثقيلة (MHC) البروتينات وبالتالي تصنيفها إلى بطء والمتوسطة، أو سريعة الألياف 7، 12، 13 > و 14 و 15 و 16 و 17. من الناحية الفسيولوجية والعضلات ومختلفة التراكيب الألياف العضلية اعتمادا على وظيفتها في الجسم. استخدام العضلات الألياف الكتابة، يمكن قياسها كميا السكان الألياف لتحديد التأقلم مع العمليات الفيزيولوجية المرضية في جسم المريض أو 7، 17. تاريخيا، تم تطبيق عدد من الأساليب تستغرق وقتا طويلا للتمييز بين أنواع الألياف العضلية. لهذا الغرض، تم تصنيف ألياف العضلات إما عن طريق التفاعل من أتباز الميوسين في مستويات الحموضة المختلفة أو نشاط انزيم العضلات. كما لا يمكن تقييم الصفات الألياف المختلفة في مقطع واحد، وطلب من المقاطع العرضية المتعددة لتحديد جميع الألياف العضلية والسماح دليل الكمي 14، 16، 17،= "XREF"> 18 و 19 و 20 و 21 و 22. في المقابل، استخدمت المنشورات الحديثة المناعية (IHC) ضد الميوسين بروتين سلسلة ثقيلة وصمة عار بسرعة أنواع الألياف متعددة في المقاطع العرضية واحدة. واستنادا إلى مزايا هذا الإجراء، ويعتبر الآن معيار الذهب في تحليل الألياف العضلية السكان 19 و 23 و 24. عن طريق تحسين بروتوكولات تلطيخ IHC، تمكنا مؤخرا لإظهار أن الاستيلاء التلقائي بالكامل من كامل أقسام العضلات الصليب ولاحق التلقائي الكمي الألياف العضلية ممكنا باستخدام منصة يماغيج مفتوحة المصدر. مقارنة الكمي اليدوي، شريطة إجراء لدينا انخفاض ملحوظ في الوقت المناسب (ما يقرب من 10٪ من دليل تحليل) المطلوبة لكل شريحة في حين يجري بدقة ± 4٪ 25 .

ويتمثل الهدف العام من هذا الأسلوب هو لوصف دليل سريع وموثوق بها، مستقلة المستخدم على التلقائية الكمي الألياف العضلية في عضلات الفئران بأكملها باستخدام منصة مفتوحة المصدر. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف التعديلات المحتملة التي من شأنها أن تسمح استخدامه لعينات أخرى مثل الفئران أو عضلات الإنسان.

Protocol

وأجريت كافة الإجراءات بما في ذلك المواد الحيوانية وفقا للمبادئ رعاية الحيوانات المخبرية على النحو الموصى به من قبل FELASA 26. الموافقة تم الحصول عليها قبل الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للجامعة فيينا الطبية ووزارة النمساوي للبحوث والعلوم (BMWF: Bundesministerium الامناء Wissenschaft اوند Forschung، الرقم المرجعي: BMWF-66.009 / 0222-WF / II / 3B / 2014).

1. العضلات الحصاد

ملاحظة: نشر السابق منغ وآخرون. 27 غير متاح اصفا تجميد الصحيح للعينات العضلات بقدر كبير من التفصيل.

  1. الحصول على عضلات كامل أو الأنسجة كافية للحصول على المقاطع العرضية كامل مباشرة بعد القتل الرحيم للحيوانات.
    1. إزالة العضلات كامل من الفئران تخدير أو الموت الرحيم. إزالة جميع الأنسجة الضامة والأوتار المحيطة العضلات مع ملقط ومقص. لnesthesia أو القتل الرحيم، واتباع المبادئ التوجيهية الدولية للFELASA 28.
  2. وزن العضلات باستخدام مقياس دقة معايرة. هذه الخطوة سريعة تتيح التحليلات المقارنة بين عينات العضلات، خاصة بعد الإجراءات التدخلية.
  3. وضع العضلات في وعاء، وليس صحيحا تماما مع أكتوبر مركب، وفقا لحجم العضلات مع هامش أمان من ما يقرب من 1 ملم الى جميع الاطراف (على سبيل المثال، مصنوعة من رقائق الألومنيوم).
  4. تجميده في حوالي 2 دقيقة precooled نظير البنتان باستخدام النيتروجين السائل. ونظير البنتان يجب أن يبدأ لإظهار بلورات بيضاء في قاع الإناء.
    ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية للحفاظ على بنية صحيحة لعضلة وبالتالي تسمح للتلطيخ الصحيح والألياف يحلل 27.
  5. مخزن العينات المحفوظة في أكتوبر لمدة 24 ساعة على الأقل في -80 ° C. ومع ذلك، يمكن أن يتم تخزين العينات في -80 درجة مئوية لعدة أشهر أو حتى سنوات، إذا كور تبريد ctly.
  6. قطع 10 ميكرون المقاطع العرضية من midportion من العضلات في -20 ° C باستخدام مبضع بردي. إذا قطع في 10 ميكرون ليست مجدية، وزيادة سماكة في الخطوات من 2 ميكرون تصل إلى حد أقصى قدره 20 ميكرون. بما فيه الكفاية شفرات قطع حادة ضرورية لهذه الخطوة.
  7. تطبيق المقاطع على الشرائح اللاصقة عن طريق تقريب الشرائح إلى المقاطع العرضية. والمقاطع العرضية عصا تلقائيا إلى شرائح لاصقة. تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية خلال الليل قبل تلطيخ.

2. تلطيخ

ملاحظة: هناك عدد كبير من الأجسام المضادة ضد الميوسين بروتين سلسلة ثقيلة يتوفر؛ ومع ذلك، والأجسام المضادة جودة عالية ضرورية لاكتساب الآلي والتحليلات. لالتخفيفات وإشارة إلى الأجسام المضادة، انظر الجدول 1. لملف جدول بيانات لحساب التخفيفات الصحيحة ويرى عدد من كميات الحل المطلوب، انظرsource.jove.com/files/ftp_upload/55441/Calculator_for_muscle_fiber_typing.xlsx">Supplemental ملف 1.

  1. ذوبان الجليد والهواء الجاف الأقسام العضلات المجمدة لمدة 10 دقيقة قبل إجراء تلطيخ.
  2. غسل الشرائح بعناية مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) + 0.05٪ تريتون X لمدة 10 دقيقة وبعد ذلك لمدة 5 دقائق. وقد تبين تريتون لتحسين نوعية تلطيخ بشكل كبير. الاطلاع على المناقشات لمزيد من التفاصيل.
  3. دعونا أقسام الهواء الجاف لمدة 2 دقيقة وتحديد المقاطع العرضية الفردية على كل شريحة باستخدام قلم مسعور (لتقليل المبلغ المطلوب من الأجسام المضادة) والسماح تجفيف إضافي لمدة 15 دقيقة.
  4. منع كافة الشرائح مع برنامج تلفزيوني + 0.05٪ تريتون X (PBST) تحتوي على 10٪ مصل الماعز لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  5. تمييع كل الأجسام المضادة الأولية (الجدول 1) في كوكتيل من برنامج تلفزيوني + 0.05٪ تريتون X (PBST) تحتوي على 10٪ مصل الماعز. مزيج بما فيه الكفاية قبل التطبيق. تريتون X هو ضروري لتلطيخ متساو من المقاطع العرضية بأكملها. حسابما يقرب من 30 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة الأولية في المقطع العرضي.
  6. للحصول على خطوات 2،7-2،13 ضمان حماية كافية من الضوء. باهتة أضواء غرفة وصواني تلطيخ مغطاة توفر الحماية الكافية. بالإضافة إلى ذلك، وملء علبة تلوين مع السوائل في أسفل لتوفير بيئة رطبة خلال تلطيخ ومنع جفاف.
  7. تطبيق الأجسام المضادة الأولية (الجدول 1) الكوكتيلات على الشرائح لمدة 1 ساعة في علبة تلوين الرطبة على درجة حرارة الغرفة.
  8. غسل الشرائح مع برنامج تلفزيوني + 0.05٪ تريتون X لمدة 10 دقيقة وبعد ذلك مع PBST جديد لمدة 5 دقائق.
  9. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في كوكتيل من برنامج تلفزيوني + 0.05٪ تريتون X (PBST) + 10٪ مصل الماعز. حساب 30 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة الأولية في المقطع العرضي.
  10. تطبيق كوكتيل الضد الثانوية على الشرائح لمدة 1 ساعة.
  11. غسل الشرائح مع برنامج تلفزيوني + 0.05٪ تريتون X (PBST) لمدة 10 دقيقة ومع PBST جديد لمدة 5 دقائق أخرى.
  12. تطبيق عدة تلطيخ النووي دابي (ويفضل الحلول للقراءة الاستخدام) FOص 15 دقيقة أو وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وصمة عار نواة الخلية.
  13. غسل الشرائح لفترة وجيزة مع PBS + 0.05٪ تريتون X (PBST) لمدة 1 دقيقة. بعد ذلك، دعونا الشرائح لفترة وجيزة الهواء الجاف.
  14. تطبيق الفلورسنت المتوسطة وcoverslips في تصاعد مستمر. تخزينها في 4 ° C محمي من الضوء وإجراء التصوير بالشكل الأمثل ضمن 24-48 ساعة.

3. المجهري

  1. تحميل الشرائح إلى الماسح الضوئي الشرائح. بحد أقصى 12 الشرائح ممكنا اعتمادا على الماسح الضوئي الشرائح.
  2. بدء مشروع جديد. للمعاينة تعيين قناة دابي وعدسة 2.5X. لتحليل مفصل استخدام القنوات دابي، GFP، FITC وCy5 والهدف 20X. يكتسب ضبط تلقائي للصورة في جميع مراحل المشروع في قناة دابي.
  3. استخدام الألوان التالية لكل قناة: -blue دابي، FITC: الأخضر والأحمر تكساس: أحمر، Cy5: أصفر.
  4. إنشاء معاينات من كل شريحة باستخدام قناة دابي. لهذا الغرض، وتطبيق دليل التركيز على عينة الأولى واستخدامها في جميع أنحاء المعاينةتحليل لاكتساب معاينة الصور من كل عينة.
  5. الخطوط العريضة لكل شريحة التي ينبغي إدراجها لعملية الاستحواذ مفصلة. لا رسم الخطوط العريضة على مقربة من حواف عينة، لضمان التسمية التوضيحية المنطقة بأكملها من الفائدة.
  6. تعيين أوقات التعرض لكل قناة. في معظم الحالات، المعلمات تعرض قنوات مختلفة متطابقة لجميع المقاطع العرضية.
  7. تشغيل الحصول على الصور التلقائي. تحقق اكتساب الصحيح للالحقل الأول في وجهات النظر، لمنع حيازة غير صحيحة في عملية مؤتمتة في وقت مبكر.
  8. إذا لزم الأمر، ووضع جهاز التحكم عن بعد باستخدام برامج سطح المكتب متطابق. وهذا يسمح للمراقبة عن بعد من عملية الحصول على الصور التي تعكس شاشة الكمبيوتر الماسح الضوئي الشريحة إلى كمبيوتر آخر عبر أي اتصال الشبكة أو الإنترنت. وعلى الرغم من أي تغييرات يمكن إدخالها على الإعداد البدني بخصوص الشرائح المستخدمة، والبيئة الافتراضية من البرنامج الحصول على الصور تسمح برصد التركيز أو التعرض الأوقات الصحيحة من الصور. وبالإضافة إلى ذلك، الوقت المقدر لإنجاز يمكن التحقق بشكل منتظم.
  9. بعد الانتهاء من الحصول على الصور، والسيطرة على ضبط تلقائي للصورة الصحيح من جميع الصور عن طريق التحكم يدويا إذا كان بنية الألياف، والألياف الفردية وأنواع الألياف المختلفة يمكن تمييزها.
  10. إعادة اكتساب تركز بشكل غير صحيح مناطق صورة لحقول واحدة للعرض أو مناطق بأكملها من الفائدة. لإعادة اكتسابها من المجالات واحدة، بمناسبة المناطق أو الصور في جميع مراحل المشروع بأكمله وإعادة الاستحواذ على المناطق مع التركيز اليدوي. في معظم الحالات، وتفاصيل الصورة إضافي في مستوى تركيز مختلف يؤدي إلى الصور التي تركز بشكل غير صحيح
  11. لكل شريحة التي ينبغي إدراجها في التحليل النهائي، تصدير كل قناة (باستثناء دابي) بشكل منفصل على شكل ملفات JPEG. اسم وفرز الملفات وفقا للقنوات التي تتعرض لها من المجلدات المسماة تكساس الأحمر، FITC وCy5.

4. تحليل الألياف الآلي

خيمة "> ملاحظة: يمكن الحصول على الماكرو من صفحة الويب التالية: https://www.meduniwien.ac.at/hp/bionicreconstruction/macro/

  1. معاينة كل صورة باستخدام برامج تحرير الصور التقليدية قبل التحليلات والتحقق من وجود تباين كاف بين الألياف الملون والخلفية. إذا لزم الأمر، وضبط التباين والسطوع لزيادة الفرق، وذلك باستخدام السطوع والتباين تعديل الأوامر.
  2. يماغيج فتح أو فيجي. فتح الماكرو باستخدام الأمر "الإضافات - وحدات الماكرو - تحرير." وهذا يدل على رمز وحدات الماكرو المصدر ويتيح التكيف سريعا من المعلمات. إذا لزم الأمر، تغيير الدليل المجلد لكل قناة في التعليمات البرمجية المصدر الماكرو.
    ملاحظة: تستند القيم لتحليل الألياف العضلية في العضلة ذات الرأسين وعضلات الفئران الخراطينية والأنواع أو العضلات قد تتطلب قيم مختلفة أخرى.
  3. استخدام "تشغيل" الأوامر لبدء الماكرو. يتم تحميل كافة الصور من المجلد الآن في الماكرو وكميا في ترتيب التوالي. وكانت النتائج شوسفل في نافذة جديدة. هذه الخطوة قد تستغرق من ثوان إلى عدة ساعات، وهذا يتوقف على مقدار يجري تحليلها البيانات.
  4. تصدير إطار النتائج كملف جدول البيانات. تحديد قيم Cy5 تحسب بشكل إيجابي البطيء، FITC (المتوسطة) وتكساس الأحمر الألياف (سريع) وتلخيص لمجموع عدد الألياف.

النتائج

كانت ملطخة المقاطع العرضية كلها الفئران العضلات بسرعة باستخدام المناعية لتحديد MHC I، IIA وألياف العضلات بنك الاستثمار الدولي. باستخدام الفلورسنت الماسح الضوئي المجهر الشريحة، والمقاطع العرضية كامل ثم المكتسبة تلقائيا لألياف العضلات الآلي يحلل مع ي...

Discussion

هنا، علينا أن نظهر منهجية يمكن الوصول إليها على نطاق واسع لدراسة وتحديد السكان الألياف العضلية من أقسام الفئران عبر عبر المناعية بطريقة فعالة الوقت تلقائيا. للاستنساخ، نقدم خطوة مفصلة وصف خطوة والتعديلات المحتملة للتطبيقات في الأنواع الأخرى غير الوارد وصفها في ...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذه الدراسة من قبل مؤسسة أبحاث كريستيان دوبلر. ونود أن نشكر سابين راوشر من مرفق التصوير الأساسية في كلية الطب بجامعة فيينا، النمسا لدعم جميع مراحل المشروع. وقد وضعت الأجسام المضادة الأولية التي كتبها شيافينو مسيرته، S.، تم الحصول عليها من دراسات البنك التنموي ورم هجين، التي تم إنشاؤها من قبل معاهد الصحة القومية من المعاهد الوطنية للصحة وحافظت في جامعة ولاية ايوا، قسم الأحياء، مدينة أيوا، IA.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
O.C.T compoundTissue-Tek, Sakura, NetherlandsFor embedding of muscle tissue
Isopentanefor adequate freezing of muscle tissue
Superfrost Ultra Plus slidesThermo Scientific, Germany1014356190adhesive slides
phosphate buffered saline 
Triton X-100Thermo Scientific, Germany85112Detergent Soluation
Goat serumThermo Scientific, Germany50197ZGoat Serum
DAKO Fluorescent Mounting MediumDako DenmarkS3023
Dako penDako DenmarkS200230-2
TissueFAXSi plusTissueGnostics, Vienna, Austria
Primary antibodies
MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253)Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)Supernatant
MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165)Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)Supernatant
MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724)Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)Supernatant
Secondary antibodies
Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b Thermo Scientific, GermanyA-21146
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1)Thermo Scientific, GermanyA-21121
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain)Thermo Scientific, GermanyA-21426
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes ReagentThermo Scientific, GermanyR37606

References

  1. Kung, T. A., et al. Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).
  2. Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Analysis of muscle fiber clustering in the diaphragm muscle of sarcopenic mice. Muscle Nerve. 52 (1), 76-82 (2015).
  3. Claflin, D. R., et al. Effects of high- and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111 (4), 1021-1030 (2011).
  4. Miller, A. I., Heath, E. M., Dickinson, J. M., Bressel, E. Relationship Between Muscle Fiber Type and Reactive Balance: A Preliminary Study. J Mot Behav. 47 (6), 497-502 (2015).
  5. Song, Y., Forsgren, S., Liu, J. -. X., Yu, J. -. G., Stål, P. Unilateral Muscle Overuse Causes Bilateral Changes in Muscle Fiber Composition and Vascular Supply. PLoS ONE. 9 (12), 116455 (2014).
  6. Hopker, J. G., et al. The influence of training status, age, and muscle fiber type on cycling efficiency and endurance performance. J Appl Physiol (1985). 115 (5), 723-729 (2013).
  7. Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
  8. Suga, T., et al. Muscle fiber type-predominant promoter activity in lentiviral-mediated transgenic mouse. PLoS One. 6 (3), 16908 (2011).
  9. Wang, J. F., Forst, J., Schroder, S., Schroder, J. M. Correlation of muscle fiber type measurements with clinical and molecular genetic data in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 9 (3), 150-158 (1999).
  10. Rader, E. P., et al. Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates. Cleft Palate Craniofac J. 45 (2), 113-120 (2008).
  11. Macaluso, F., Isaacs, A. W., Myburgh, K. H. Preferential type II muscle fiber damage from plyometric exercise. J Athl Train. 47 (4), 414-420 (2012).
  12. Lieber, R. L., Fridén, J. Clinical significance of skeletal muscle architecture. Clin. Orthop. Relat. Res. 383, 140-151 (2001).
  13. Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiol (Oxf). 199 (4), 451-463 (2010).
  14. Bottinelli, R., Betto, R., Schiaffino, S., Reggiani, C. Unloaded shortening velocity and myosin heavy chain and alkali light chain isoform composition in rat skeletal muscle fibres. J Physiol. 478, 341-349 (1994).
  15. Schiaffino, S., Reggiani, C. Myosin isoforms in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 77 (2), 493-501 (1994).
  16. Larsson, L., Moss, R. L. Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles. J Physiol. 472, 595-614 (1993).
  17. Kostrominova, T. Y., Reiner, D. S., Haas, R. H., Ingermanson, R., McDonough, P. M. Automated methods for the analysis of skeletal muscle fiber size and metabolic type. Int Rev Cell Mol Biol. 306, 275-332 (2013).
  18. Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
  19. Lieber, R. L. . Skeletal muscle structure, function, and plasticity. , (2009).
  20. Hintz, C. S., Coyle, E. F., Kaiser, K. K., Chi, M. M., Lowry, O. H. Comparison of muscle fiber typing by quantitative enzyme assays and by myosin ATPase staining. J Histochem Cytochem. 32 (6), 655-660 (1984).
  21. Havenith, M. G., Visser, R., van Schendel, J. M. S. c. h. r. i. j. v. e. r. s. -., Bosman, F. T. Muscle fiber typing in routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies. Histochemistry. 93 (5), 497-499 (1990).
  22. Likar, B., Pernuš, F. Registration of serial transverse sections of muscle fibers. Cytometry. 37 (2), 93-106 (1999).
  23. Liu, F., et al. Automated fiber-type-specific cross-sectional area assessment and myonuclei counting in skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1714-1724 (2013).
  24. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273 (2012).
  25. Bergmeister, K. D., et al. Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry. Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).
  26. Guillen, J. FELASA guidelines and recommendations. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
  27. Meng, H., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), e51586 (2014).
  28. Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. J Am Assoc Lab Animal Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
  29. Ribarič, S., ČebaŠek, V. Simultaneous Visualization of Myosin Heavy Chain Isoforms in Single Muscle Sections. Cells Tissues Organs. 197 (4), 312-321 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

121

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved