JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نهج كامل المناعية جبل، لتصور التعبير البروتين العصبية في القناة الصفراوية خارج الكبد في سونكوس مورينوس. هنا. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لتحليل التعصيب من جميع الأجهزة الحشوية في S. مورينوس أو الأنواع الأخرى.

Abstract

يصف هذا العمل طريقة تلطيخ المناعية كامل جبل في التفاصيل، وذلك باستخدام الأجسام المضادة البروتين العصبي لتسمية التعصيب من القناة الصفراوية في سونكوس مورينوس ( S. مورينوس   ). أولا، تم تشريح العينة من S. مورينوس وثابتة في بارافورمالدهيد 4٪ (بفا). ثانيا، تم إجراء علاج الأنزيمية وإمكانية تعطيل البيروكسيداز الذاتية. ثم تعرض العينة إلى الأجسام المضادة الأولية، المضادة للالعصبية البروتين الأجسام المضادة، لمدة 3-6 أيام. ثم تم تحضينها مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق مع البيروكسيديز الفجل. تم الكشف عن تفاعل اللون عن طريق تفاعل العينة مع 3،3'-ديامينوبنزيدين (داب) الركيزة. ويمكن تطبيق هذه الطريقة لتحليل التعصيب من جميع الأجهزة الحشوية. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن تتكيف هذا البروتوكول لاختبار الأجسام المضادة العصبية الأخرى، ولكن الأمثل من أنتيبودييجب أن يتم إس أولا. وقد قدم هذه الطريقة أصلا من قبل كوراتاني وتاناكا 1 ، 2 ، 3 .

Introduction

المسك منزل يلقي ، سونكوس مورينوس ، ينتمي إلى النظام إنسكتيفورا والأسرة سوريسيداي. وتوزع هذه الثدييات الصغيرة في جميع أنحاء جنوب شرق آسيا وتسكن المنازل والمناطق العشبية التي تقع بالقرب من مساكن الإنسان أو أقلام الماشية 4 . هذا النوع يحمل الخصائص المورفولوجية العامة أكثر مماثلة للبشر من الحيوانات المختبرية الأخرى، مثل الماوس، الفئران، والأرنب 5 . سابقا، تم استخدام المناعية كامل جبل مع علامة الخلايا العصبية الطرفية ل S. مورينوس الخلايا العصبية البروتين (نف) لتسمية الأعصاب الطرفية في البنكرياس 6 ، الحليمة الاثني عشر الرئيسية 7 ، البواب 8 ، المرارة 5 ، والمسالك الصفراوية خارج الكبد 9 .

نف هو مجمع الجزيئات التي هي جزء من الهيكل العصبي الخلايا العصبية ناضجة. البروتين ذات الصلة العصبيةتوسط التفاعلات بين نف والزيغوسوم. وينظم كل من وظيفة الانزيم وهيكل بروتينات رابط من قبل نف 10 . يتكون مجمع نف من ثلاثة ببتيدات: نف-L (70 كيلو دالتون)، نف-M (150-160 كيلو دالتون)، و نف-H (200 كيلو دالتون). نف يمكن العثور عليها في محاور عصبية في كل من الجهاز العصبي المركزي والمحيطي. وقد تبين أن الأجسام المضادة نف البشري المضادة لتسمية محاور عصبية من الجهاز العصبي المركزي والمحيطي. وقد أثبتت التحقيقات التشريحية والكهربية أن العضلة العاصرة، المرارة، والجهاز الهضمي القريبة ترتبط 11 ، 12 ، 13 ، 14 . ومع ذلك، لم يتم تعريف السمات المورفولوجية من اتصالات الخلايا العصبية بعد.

هذا العمل يدل على استخدام كامل جبل طريقة تلطيخ المناعي لتسمية التعصيب من بيلين S. مورينوسإاري، أداة تعريف إنجليزية غير معروفة، أداة تعريف إنجليزية غير معروفة، نف، أنتيبودي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل جامعة طوكيو رعاية المؤسسية المؤسسية واللجنة استخدام الحيوان (إاكوك). تم إيواء الحيوانات والتعامل معها وفقا لدليل رعاية الحيوانات المختبرية واستخدامها ودليل رعاية واستخدام الحيوانات التجريبية للمجلس الكندي للرعاية الحيوانية . استخدمنا الحيوانات التي تم تربيتها والحفاظ عليها في مختبر مورفولوجيا وظيفية، قسم علوم الصحة الحدودية، جامعة طوكيو متروبوليتان، اليابان.

1. رعاية الحيوان والإسكان

  1. الحصول على 7 S. مورينوس (3 إناث و 4 ذكور يزن 70-90 ز) من مستعمرة تربية مغلقة.
  2. قفص S. مورينوس بشكل فردي بعد الفطام (20 د بعد الولادة) في أقفاص بلاستيكية مجهزة مربع عش خشبي يحتوي على شرائط الورق. الاحتفاظ بها في غرفة الحيوان مكيفة تقليديا: 23-27 درجة مئوية، لا مراقبة الرطوبة، و 12:12 ساعة ضوء: دورة مظلمة. توريد كومركالكريات التراوت والماء ليبيتوم الإعلانية.

2. إعداد الأنسجة

  1. لتحضير 4٪ (ث / ت) بارافورمالدهيد (بفا)، حل 40 غرام من بفا في 1000 مل من 0.01 M الفوسفات مخزنة المالحة (بس، ودرجة الحموضة 7.4). في خزانة الدخان، مزيج باستخدام دوامة حتى الحل واضح. تخزين 4٪ بفا O / N عند 4 درجات مئوية.
    تنبیھ: ارتداء معدات الوقایة الشخصیة المناسبة (ب) عند التعامل مع بفا.
  2. لإرضاء وإصلاح الحيوان، تخدير مع الأثير ومن ثم إعطائها حقن داخل الصفاق من سومنوبنتيل (بينتوباربيتال الصوديوم، 0.6 مل / كجم من وزن الجسم).
  3. بعد تخدير الحيوان تماما، وفتح تجويف البطن مع مشرط، وخلق خط الوسط شق البطن 3 سم طويلة. في حين تحريض الوريد الأجوف السفلي للانفجار، إدراج قسطرة ريتروغراديلي في الشريان الأورطي البطني على المستوى مباشرة فوق التشعب من هذا الشريان في الشرايين الحرقفية المشتركة.
  4. حقن سومنوبنتيل (بنتوباربيتال ذلكديوم، 1.0 مل / كجم من وزن الجسم). بعد القتل الرحيم الكامل، يروي مع 0.01 M بس (الرقم الهيدروجيني 7.4) وبعد ذلك مع بفا 4٪ في خزانة الدخان.
  5. بعد نضح، وحقن 2-3 مل من النيوبرين الأبيض اللاتكس (تمييع النيوبرين الأبيض اللاتكس 3: 2 مع الماء المقطر (دو)) لتسمية الأوعية الدموية.
  6. استخراج أعضاء البطن، بما في ذلك الكبد، المرارة، القناة الصفراوية المشتركة، الاثني عشر، والبنكرياس إن الكتلة، مع الأعصاب والأوعية ذات الصلة.
  7. حقن حوالي 0.1 مل من النيوبرين الأزرق اللاتكس (إضافة قطرة من الحبر الأزرق إلى 10 مل من المخفف النيوبرين الأبيض اللاتكس) إلى المرارة لتسمية النظام الصفراوي.
  8. بعد الإصلاح بين عشية وضحاها مع 4٪ بفا في 4 درجات مئوية لكامل جبل إمونوستينينغ.
    تنبيه: بفا سامة. تجنب التعامل مع بفا مباشرة. وينبغي استخدام بفا في خزانة الدخان.

3. كله جبل المناعية

ملاحظة: طوال البروتوكول، بما في ذلك أثناء الغسيل، حضانة الأجسام المضادة، والتلوين، ثه عينة يجب أن تبقى على نوتاتور، هزاز بلطف في رت أو في 4 درجات مئوية .

  1. يوم 1: العلاج الأنزيمي وإبطال البيروكسيديز الذاتية المحتملة
    1. غسل العينة استعداد مع دو 4x لمدة 1 ساعة كل في رت في قنينة زجاجية الحجم المناسب. روك العينة بلطف على نوتاتور لإزالة بفا. تجنب إتلاف العينة عند تبادل الحلول.
    2. لإعداد 1٪ (ث / ت) حمض أورثوبيريوديك، حل 1 غرام من حمض أورثوبيريوديك في 100 مل من دو.
    3. احتضان العينة في 1٪ حمض أورثوبيريوديك لمدة 20 دقيقة في رت لمنع أي رد فعل بيروكسيداز جوهري.
    4. إعداد 0.004٪ (ث / ت) غراء عن طريق إذابة 0.004 غرام من غراء في 100 مل من 0.025 مول / لتر العازلة تريس- حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6).
    5. غسل العينة مع دو لمدة 10 دقيقة في رت.
    6. احتضان العينة في الطازجة 0.004٪ غشاء لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية في حمام درجة حرارة ثابتة مع هزاز لطيف.
    7. غسل العينة مع DW لمدة 50-60 دقيقة في رت.
    8. تخزين العينة في بفا 4٪ في 4 ° كو / N.
  2. يوم 2: العلاج الأنزيمي
    1. غسل العينة المخزنة مع دو 4 مرات لمدة 1 ساعة لكل منهما في رت.
    2. احتضان العينة في الطازجة 0.004٪ غشاء لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية في حمام درجة حرارة ثابتة مع هزاز لطيف.
    3. غسل العينة مع دو لمدة 50-60 دقيقة في رت. تخزين العينة في بفا 4٪ في 4 ° كو / N.
  3. يوم 3: تجميد العلاج
    1. غسل العينة المخزنة مع دو 4x لمدة 1 ساعة كل في رت، على النحو الوارد أعلاه.
    2. إعداد 2.5٪ (ث / ت)، 5٪ (ث / ت)، و 10٪ (ث / ت) السكروز عن طريق إذابة 2.5 غرام، 5 غرام، و 10 غرام من السكروز، على التوالي، في 100 مل من 0.01 M بس ( الرقم الهيدروجيني 7.4).
    3. تزج العينة في 2.5٪ (ث / ت)، 5٪ (ث / ت)، و 10٪ (ث / ت) السكروز لمدة 30 دقيقة لكل منهما.
    4. تجميد العينة في -20 درجة مئوية لمدة 30 - 60 دقيقة ثم ذوبان الجليد تماما في رت. كرر دورة 3X.
    5. أعلىريبار 2٪ تريتون X-100 (v / v)، إضافة 2 مل من تريتون X-100 إلى 100 مل من 0.01 M بس (الرقم الهيدروجيني 7.4).
    6. تخزين العينة في 2٪ تريتون X-100 في 4 ° كو / N.
  4. يوم 4: حضانة الأجسام المضادة الأولية
    1. إعداد حل التخفيف من الأجسام المضادة الأولية عن طريق إذابة 0.2 غرام من البقري مصل الألبومين (بسا)، 0.3 مل من تريتون X-100، و 0.1 غرام من أزيد الصوديوم في 100 مل من 0.01 M بس (الرقم الهيدروجيني 7.4).
      تنبيه: أزيد الصوديوم هو سامة للغاية. يجب تجنب الاستنشاق واللمس. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
    2. تمييع الأجسام المضادة الأولية (نف) 1: 600 في المخزن المؤقت التخفيف أعلاه (الخطوة 3.4.1). احتضان العينة مع الأجسام المضادة نف في 4 درجات مئوية لمدة 3-6 أيام، والحفاظ على عينة هزاز بلطف على نوتاتور. العينات الكبيرة تتطلب زيادة أوقات الحضانة.
  5. الثانوية حضانة الأجسام المضادة
    1. غسل العينة في برنامج تلفزيوني 4x لمدة 1 ساعة كل في رت لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير منضم.
    2. إعداد حل التخفيف للجسم المضاد الثانوي عن طريق إذابة 0.2 غرام من بسا و 0.3 مل من تريتون X-100 في 100 مل من 0.01 M بس (الرقم الهيدروجيني 7.4).
    3. تمييع الأجسام المضادة الثانوية (البيروكسيديز مترافق، الأغنام تنقيته المنقى المضادة للفأر إيغ-هرب) 1: 600 في المخزن المؤقت التخفيف (الخطوة 3.5.2). احتضان العينة مع الأجسام المضادة الثانوية في 4 درجات مئوية لمدة 3 د، والحفاظ على عينة هزاز بلطف على نوتاتور.
  6. تلوين
    1. إعداد حل تلوين داب بإضافة 0.002 غرام من 3،3'-ديامينوبنزيدين رباعي هيدروكلوريد (داب) إلى 100 مل من 0.05 مول / لتر العازلة تريس-حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6) تحت خزانة الدخان، والحفاظ على الحل في الظلام.
    2. غسل العينات في رت في برنامج تلفزيوني 4x لمدة 1 ساعة لكل منهما.
    3. إضافة 10 ميكرولتر من 30٪ H 2 O 2 في حل تلوين داب طازجة واحتضان مع الحل في 4 ° كو / N أو لمدة 3 د بينما هزاز بلطف على نوتاتور.
    4. وقف رد الفعل من قبل جيش التحرير الشعبى الصينىسينغ العينة في برنامج تلفزيوني مع 0.04٪ أزيد الصوديوم عندما يتم التوصل إلى كثافة تلطيخ الأمثل.
      ملاحظة: تجنب استخدام أزيد الصوديوم حتى هذه الخطوة، كما أنه يمنع البيروكسيداز الفجل.
  7. تصوير الأنسجة الملون
    1. نقل بعناية العينة إلى طبق زجاج بتري (5 سم عالية، 10 سم في القطر) التي تحتوي على برنامج تلفزيوني. التقاط صور جبل كامل باستخدام كاميرا محمولة على ستيريوميكروسكوب.
      ملاحظة: يجب أن يكون تصوير كامل جبل نسيج ملون بينما مغمورة تماما في برنامج تلفزيوني على طبق زجاج شفاف.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

الأشكال 1 - 4 تظهر النتائج النموذجية للألياف العصبية إيجابية غير إيجابية في القناة الصفراوية خارج الكبد في S. مورينوس . الجسم المضاد ضد نف استنساخ وصفت تعصيب في الصورة بأكملها من القناة الصفراوية خارج الكبد ( الشك...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يصف هذا العمل الإجراء التجريبي لتصور التعصيب من القناة الصفراوية خارج الكبد باستخدام الأجسام المضادة ضد البروتين العصبية. تم تكييف هذا البروتوكول من البروتوكول الذي وصفه كوراتاني وتاناكا 1 ، 2 ، 3 .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

أعلن المؤلفون أنه لا يوجد اختلاف في الاهتمامات.

Acknowledgements

المؤلفين ليس لديهم اعترافات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
orthoperiodic acidWako162-00732
papainWako164-00172
bovine serum albumin (BSA)Wako010-15131
sodium azideNacalai Tesque312-33
neurofilament protein (NFP) antibodyDakoM0762, lot 089, clone: 2F11
peroxidase-conjugated affinity-purified sheep anti-mouse IgG-HRPMBLCode 330
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)Wako349-00903
imidazoleSigmaI-0125

References

  1. Kuratani, S., Tanaka, S., Ishikawa, Y., Zukeran, C. Early development of the hypoglossal nerve in the chick embryo as observed by the whole-mount nerve staining method. Am. J. Anat. 182 (2), 155-168 (1988).
  2. Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of the avian vagus nerve with special reference to the morphological innervation of heart and lung. Anat. Embryol. (Berl). 182 (5), 435-445 (1990).
  3. Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of avian trigeminal nerves. Am. J. Anat. 187 (1), 65-80 (1990).
  4. Yi, S. Q., et al. House musk shrew, Suncus murinus: a novel and natural obesity-resistant animal model. Obes. Metab. 6, 22-28 (2010).
  5. Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of innervation of the gallbladder in humans and Suncus murinus with special reference to morphological understanding of gallstone formation after gastrectomy. World J. Gastroenterol. 13 (14), 2066-2071 (2007).
  6. Yi, S. Q., et al. Anatomical study of the pancreas in the house musk shrew, Suncus murinus, with special reference to the blood supply and innervation. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 273 (1), 630-635 (2003).
  7. Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the major duodenal papilla in humans and Suncus murinus, from the perspective of preserving innervation in organ-saving procedures. Pancreas. 30 (3), 211-217 (2005).
  8. Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the pylorus in humans and Suncus murinus, in relation to the surgical technique for pylorus-preserving pancreatoduodenectomy. World J. Gastroenterol. 12 (14), 2209-2216 (2006).
  9. Yi, S. Q., Ren, K., Kinoshita, M., Takano, N., Itoh, M., Ozaki, N. Innervation of Extrahepatic Biliary Tract, With Special Reference to the Direct Bidirectional Neural Connections of the Gall Bladder, Sphincter of Oddi and Duodenum in Suncus murinus, in Whole-Mount Immunohistochemical Study. Anat. Histol. Embryol. 45 (3), 184-188 (2016).
  10. Wang, H., et al. Neurofilament proteins in axonal regeneration and neurodegenerative diseases. Neural Regen. Res. 7 (8), 620-626 (2012).
  11. Wyatt, A. P. The relationship of the sphincter of Oddi to the stomach, duodenum and gall-bladder. J. Physiol. 193 (2), 225-243 (1967).
  12. Mawe, G. M., Kennedy, A. L. Duodenal neurons provide nicotinic fast synaptic input to sphincter of Oddi neurons in guinea pig. Am. J. Physiol. 277, G226-G234 (1999).
  13. Seo, J. H., Cho, S. S., Lee, I. S., Lee, H. S. Anatomical and neuropeptidergic properties of the duodenal neurons projecting to the gallbladder in the golden hamster. Arch. Histol. Cytol. 65 (4), 317-321 (2002).
  14. Padbury, R. T., Furness, J. B., Baker, R. A., Toouli, J., Messenger, J. P. Projections of nerve cells from the duodenum to the sphincter of Oddi and gallbladder of the Australian possum. Gastroenterology. 104 (1), 130-136 (1993).
  15. White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography. J. Vis. Exp. (62), e4042(2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

124

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved