تحريض نقص الأكسجة في الضفدع الحي والأجنة الزرد

Helena Khaliullina-Skultety; Ngiam Zi Chao; William A. Harris

doi:10.3791/55710

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

نحن نقدم نظام غرفة هايبوكسيك الرواية للاستخدام مع الكائنات المائية مثل الضفدع والأجنة الزرد. نظامنا هو بسيط، قوي، فعالة من حيث التكلفة ويسمح للاستقراء والحفاظ على نقص الأكسجة في الجسم الحي ، وتصل إلى 48 ساعة. نقدم 2 أساليب قابلة لإعادة الإنتاج لمراقبة فعالية نقص الأكسجين.

Abstract

هنا، نحن نقدم نظاما جديدا لتحريض نقص الأكسجين، الذي وضعنا لدراسة آثار نقص الأكسجين في الكائنات المائية مثل الأجنة الضفدع والزرد. يتكون نظامنا من غرفة تتميز بإعداد بسيط مع ذلك قوي للحث والحفاظ على تركيز الأكسجين ودرجة الحرارة المحددة في أي حل تجريبي من الاختيار. النظام المقدم هو جدا فعالة من حيث التكلفة ولكن وظيفية للغاية، فإنه يسمح الاستقراء والحفاظ على نقص الأكسجة للتجارب المباشرة في الجسم الحي وللفترات الزمنية المختلفة تصل إلى 48 ساعة.

لمراقبة ودراسة آثار نقص الأكسجة، استخدمنا طريقتين - قياس مستويات عامل نقص الأكسجين المحفز 1 ألفا (هيف-1α) في الأجنة كاملة أو الأنسجة المحددة وتحديد تكاثر الخلايا الجذعية الشبكية بنسبة 5-إثينيل-2'- ديوكسيوريدين (إيدو) دمج في الحمض النووي. مستويات هيف-1α يمكن أن تكون بمثابة علامة نقص الأكسجين العام في الجنين كله أو الأنسجةمن الاختيار، هنا شبكية العين الجنينية. دمج إيدو في الخلايا المتكاثر من شبكية العين الجنينية هو ناتج معين من تحريض نقص الأكسجة. وهكذا، فقد أظهرنا أن أسلاف الشبكية الجنينية نقص الأكسجة انخفاض الانتشار في غضون ساعة واحدة من الحضانة تحت 5٪ من الأكسجين من كل من الأجنة الضفدع والزرد.

مرة واحدة يتقن، يمكن أن تستخدم لدينا الإعداد للاستخدام مع الكائنات الحية المائية الصغيرة، لتجارب مباشرة في الجسم الحي ، أي فترة زمنية معينة وتحت العادي، نقص الأكسجة أو تركيز الأكسجين مفرط الأكسجين أو تحت أي خليط الغاز معين آخر.

Introduction

بحوث نقص الأكسجة لديها العديد من التطبيقات. وتشمل هذه التحقيق في التسبب وتطوير العلاجات للحالات الطبية التي تتميز نقص الأكسجة ¹ والأمراض ارتفاع حاد حاد ² . يسبب نقص الأكسجة تغيرات الأيض الرئيسية في جميع الكائنات الحية التي تتطلب الأوكسجين. الإجهاد نقص الأكسجين يؤثر أيضا على نمو الجنين والتنمية والتسبب في العديد من الأمراض البشرية، بما في ذلك تقييد النمو داخل الرحم ³ . لا يمكن أن يؤدي إجهاد نقص الأكسجة فقط إلى انخفاض وزن المواليد، أو وفيات الجنين أو حديثي الولادة، بل يمكن أن يؤدي أيضا إلى مضاعفات كثيرة في حياة البالغين، مثل أمراض القلب والأوعية الدموية وداء السكري من النوع 2 والبدانة وارتفاع ضغط الدم ⁴ . وغالبا ما يلاحظ الإجهاد نقص الأكسجة أثناء تطور الورم الصلبة، عندما الأنسجة الورم يتفوق إمدادات الدم لها. ولذلك فمن الأهمية بمكان أن تكون قادرة على دراسة آثار نقص الأكسجين في الجسم الحي ومباشرة خلال إمبر التنمية اليونية.

من بين الطرق الأكثر شهرة التي تم استخدامها لدراسة تأثير نقص الأكسجة أثناء التنمية هو استخدام كلوريد الكوبالت في وسط النمو أو حضانة الكائن الحي في غرفة نقص الأكسجين. كلوريد الكوبالت يحفز اصطناعيا استجابة نقص الأكسجة تحت تركيز الأكسجين العادي، نظرا لدورها في استقرار الأكسجين محفز عامل 1 ألفا (هيف-1α) عن طريق منع تدهور بروتيوسومي لها ⁵ ^، ⁶ ^، ⁷ . ومع ذلك، كونها طريقة مريحة ⁸ ، واستخدام كلوريد الكوبالت، فضلا عن غيرها من مماثلة كيميائيات نقص الأكسجة الكيميائية يمكن أن يكون لها تأثير ضار غير محدد على الخلايا والأنسجة، على سبيل المثال ، موت الخلايا المبرمج ⁹ . لذلك، غرف نقص الأكسجين هي طريقة أفضل لتحريض "نقص الأكسجين الطبيعي" في الكائنات الحية من خلال مسار التطور الطبيعي.

نتنت "> لقد ركزنا على تطوير نظام لتحريض نقص الأكسجة في الأجنة الحيوانية المائية، وقد أصبحت كل من الضفادع والزرد الآن الكائنات نموذجية الفقاريات بالمعلومات لدراسات العديد من العمليات البيولوجية، وكذلك نماذج لمختلف الأمراض البشرية.الأجنة الضفدع والزرد وتطور من الخارج، مما يؤدي إلى القضاء على مضاعفات تعويض الأمهات.وعلاوة على ذلك، فإن مسار سريع للتنمية يجعل من الممكن التلاعب العوامل البيئية ومراقبة التغيرات المظهرية في تشكيل الجهاز في الوقت الحقيقي.بالإضافة إلى ذلك، يتم حفظ العديد من مكونات مسارات التنبيه إشارة رئيسية للغاية في وهذه الكائنات النموذجية وقد تميزت بالتفصيل من قبل مجموعة كبيرة من الأدب، والميزة الرئيسية في استخدام الضفادع والأجنة الزرد لدراسة آثار نقص الأكسجين على تطوير الفقاريات هو أن جميع العمليات يمكن رصدها مباشرة، منذ الأكسجين تخترق بسرعة الأجنة. وهكذا، في الضفادع والزرد، كما هو على النقيض من الكائنات نموذج آخر مثلالأجنة الماوس، وتأثير تركيز الأكسجين محددة يمكن دراستها في الأنسجة من الفائدة، دون الأخذ بعين الاعتبار وجود أو عدم وجود الأوعية الدموية وظيفية.

معظم الإمدادات المتاحة تجاريا لحضانة الأكسجين غير مؤات من كونها كبيرة نسبيا ولها ارتفاع تكاليف التشغيل المقابلة. وبصرف النظر عن ارتفاع التكلفة الأولية واستهلاك الغاز، موازنة وصيانة غرف نقص الأكسجة المشتركة تتطلب الحفاظ على جو من نقص الأكسجين المستمر ضد التدرج الغاز التي تحدث بشكل طبيعي في هذه الغرف بسبب حجمها أكبر و / أو تنفس الكائن الحي. وهذا يتطلب توظيف مراوح الغاز ونظام التبريد، مما يزيد من كمية المعدات الإضافية اللازمة، ويعوق البراعة الباحث ويقلل عموما بساطة الإجراء التجريبي. في المقابل، فإن الإعداد الذي نقدمه هنا قوي نسبيا ولكن فعالة جدا من حيث التكلفة، صغيرة، وسهلة لإقامة ويسمح وأست توازن الغاز، جو ناقص الأكسجين مستقرة وتبادل بسيط من المواد والحلول داخل الغرفة. نظامنا يمكن استخدامها للاستخدام مع أي كائن نموذج المائية من الفائدة.

لقد شيدت غرفة نقص الأكسجة التي هي صغيرة مريحة، وبالتالي يمكن وضعها داخل حاضنة المختبر المشتركة، والتي تسمح بسهولة الإجراءات التجريبية في أي درجة حرارة محددة. توفير السيطرة مريحة من درجة الحرارة وكذلك تركيز الأكسجين في المتوسط، وميزة نظامنا ضد حاضنات نقص الأكسجة المتاحة تجاريا تكمن في صغر حجمها وكفاءة التكلفة. وبالتالي، يمكن إنشاء الإعداد لدينا باستخدام إمدادات المختبرات العامة المتاحة لمعظم مختبرات البحوث ولا تتطلب أي مواد باهظة الثمن. وبالإضافة إلى ذلك، لدينا الإعداد لا تولد الحرارة، على عكس حاضنات نقص الأكسجة المتاحة تجاريا، ويسمح للاستخدام في درجات حرارة أقل من درجة حرارة الغرفة التي توضع في حاضنة. ذي لاست أهمية خاصة للعمل مع الكائنات الحية ذات الدم البارد مثل الضفادع والأسماك حيث تعتمد معدلات النمو والتمثيل الغذائي بقوة على درجة الحرارة.

وبفضل فعاليتها من حيث التكلفة وبسهولة، فإن غرفة حضانة الغاز لدينا تنوعا جدا في تحديد ظروف مختلفة من نقص الأوكسجين أو فرط التأكسج، فضلا عن تمكين الإدارة السريعة والسهلة لوسائل الإعلام والحلول المختلفة لعدد كبير من الظروف التجريبية. وبالإضافة إلى ذلك، توظيف لوحة 24 جيدا بدلا من الأطباق المستخدمة عادة أو الدبابات المختبرية ¹⁰ ^، ¹¹ ^، ¹² ، ونظامنا يسمح المراقبة والعلاج التجريبي لعدة شروط متحولة في آن واحد.

للسيطرة على تحريض الصحيح من نقص الأكسجة، لقد رصدنا مستويات البروتين هيف-1α بواسطة الكشف لطخة غربية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن عدد الخلايا التكاثر قبل وبعد إنكوباتيون في غرفة نقص الأكسجين يمكن استخدامها لتحديد ما إذا كان نقص الأكسجة قد تسبب في الأنسجة. ويستند هذا الأسلوب على نتائجنا المنشورة سابقا ¹³ ، والتي تبين أن انتشار في الشبكية الجذعية شبكية الخلايا الجذعية يقلل على تحريض نقص الأكسجين. وهكذا، فقد رصدنا مستوى تكاثر الخلايا الجذعية الشبكية عن طريق إضافة 5-إثينيل-2'-ديوكسيوريدين (إيدو) إلى المتوسطة الجنين وقياس دمجها في الحمض النووي للخلايا تكاثر حديثا.

Protocol

هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من جامعة كامبريدج.

1. صيانة الحيوان

الأجنة الضفدع
ملاحظة: يمكن رفع الأجنة والحفاظ عليها وفقا لمرفق الحيوان والمختبر. هنا، وصف مثال على صيانة الحيوان.
1. إعداد حل 0.1 بار تعديل بارث (مبس) الحل: 0.88 ملي كلوريد الصوديوم، 10 ميكرومتر بوكل، 24 ميكرومتر ناهكو ₃ ، 100 ميكرومتر هيبيس، 8.2 ميكرومتر مغسو ₄ ، 3.3 ميكرومتر كا (نو ₃ ) ₂ ، و 4.1 ميكرومتر كاكل ₂ ، ودرجة الحموضة 7.6 .
2. الحصول على القيطم الأجنة الأجنة عن طريق الإخصاب في المختبر .
  1. تثبيط الإباضة في الكبار الإناث الضفادع مخلب الأفريقية ( القيطم ليفيس) عن طريق الحقن مع الحوامل المصل الغدد التناسلية المصل أسبوع واحد (60 وحدة دولية) و 12 ساعة (500 وحدة دولية) قبل وضع البيض.
  2. جمع البويضات وتسميدها في المختبر مع الخصية الذكور المجانسة.
  3. الرايسي الأجنة في 0.1x مبس في 16 - 18 درجة مئوية. المرحلة الأجنة وفقا لجدول عادي من القيطم ليفيس ¹⁴ . رعاية في اختيار الأجنة كلها وعلى قيد الحياة لهذه التجربة.
الأجنة الزرد
ملاحظة: يمكن رفع الأجنة والحفاظ عليها وفقا لمرفق الحيوان والمختبر. هنا، وصف مثال على صيانة الحيوان.
1. إعداد المتوسطة الجنين: 5 ملي كلوريد الصوديوم، 0.17 ملي بوكل، 0.33 ملي كاكل ₂ ، 0.33 ملي مغسو ₄ ، و 0.00001٪ الميثيلين الأزرق.
2. الحفاظ على سلالة وت أب سلالة دانيو ريريو في 26.5 درجة مئوية.
3. جمع الأجنة في الصباح من الإخصاب، ورفع حتى 4 د آخر التسميد (دبف) عند 28 درجة مئوية في المتوسطة الجنين أعدت كما هو موضح أعلاه، حدد والمرحلة كما هو موضح سابقا ¹⁵ .

2. تحريض نقص الأكسجين في فيفو

بناء غرفة حضانة الغاز
1. استخدام خزان المائية تربية ( الشكل 1A ) التي يتم استخدامها عادة في منشأة الأسماك لبناء غرفة نقص الأكسجة. هذا الخزان يجب أن تناسب لوحة 24 جيدا.
2. إعداد شبكة أسفل 24 لوحة جيدا كما هو مبين في الشكل 1 . إزالة أسفل البلاستيك من لوحة 24 جيدا ( الشكل 1B )، على سبيل المثال ، وذلك باستخدام آلة طحن لهذا الغرض.
3. ملء الفراغ بين البلاستيك من الآبار وجدران لوحة مع راتنجات الايبوكسي. نعلق أي مرشح النايلون ( الشكل 1C ) مع قطر شبكة من 0.1-0.2 ملم إلى البلاستيك المغلفة الراتنج والسماح لوحة لتكون جافة تماما.
4. مرة واحدة الجافة، حفر ثلاثة أو أربعة أنفاق ( الشكل 1D ) من 10 مم طول و 5 مم قطرها في الراتنج، وشبكة لوحة المغلفة الجدران. إرفاق قضبان بلاستيكية أو تفلون( الشكل 1E ) من القطر المناسب وطول 30 ملم إلى الأنفاق ووضع لوحة في خزان الاختيار.
5. وضع شبكة أسفل 24 لوحة جيدا في خزان المائية المفضل. باستخدام أنابيب سيليكون ( الشكل 1F )، نعلق خزان الغاز ( الشكل 1G ) مع المطلوب O ₂ / N ₂ خليط أو خليط الغاز آخر من خيار لصمام موزع ( الشكل 1H ) باستخدام منظم الغاز المناسب (I) (بوك 200 شريط). هنا، استخدم خزانات الغاز التي تحتوي على خليط من الأكسجين 5٪ و 95٪ N ₂ في التجارب نقص الأكسجة المعروضة هنا.
6. ضبط معدل تدفق الأوكسجين في وسط الغرفة إلى 0.0017-0.0019 متر مكعب في الثانية الواحدة. في ظل هذا معدل تدفق الغاز، لا ينبغي أن ينظر إلى أي اضطراب في المتوسط في آبار لوحة.
  1. استخدام عالية النقاء منظم الغاز على مرحلتين لهذا الغرض. تعيين منظم للحد من الضغط الداخلي للثه خزان الغاز (1000 - 2500 يسي) إلى ضغط تسليم 10 يسي طوال التجربة. وهكذا، وفقا لمواصفات هذا منظم الغاز، تم تحقيق معدل تدفق 0.00189 متر مكعب في الثانية طوال التجربة.
7. ربط أنابيب السيليكون وصمام الموزع إلى الناشر القرص السيراميك ( الشكل 1J ) داخل خزان المائية. إغلاق خزان المائية وختم بعناية غطاء، طلاء عليه مع الشحوم سيليكون ( الشكل 1K ) (مقارنة مع الشكل 1 ). إذا كان مطلوبا درجة حرارة غير الغرفة معينة، ضع غرفة نقص الأكسجة في حاضنة مختبر من درجة الحرارة المطلوبة.
8. اعتمادا على نوع الأجنة المستخدمة في التجربة، وملء خزان غرفة نقص الأكسجة مع المتوسطة الجنين المناسب والبدء في نشر خليط الغاز من خلال الناشر القرص السيراميك. تتوازن لمدة 10-15 دقيقة.
9. بعد موازنة مع ثه مزيج الأكسجين المطلوب، وقياس تركيز الأكسجين في الماء باستخدام أوكسيميتر أو التحقيق الأكسجين. هنا، استخدام أوكسيميتر مع الألياف البصرية الأكسجين المذاب ومستشعر درجة الحرارة لهذا الغرض.
تحريض نقص الأكسجة في الأجنة
1. اختيار بعناية الأجنة للتجربة، واستخدام الأجنة كلها وعلى قيد الحياة لحضانة نقص الأكسجين. هنا، لنا الأجنة الضفدع من المرحلة 38 أو الأجنة الزرد 4 دبف في التجارب المعروضة هنا.
2. وضع أطباق الجنين في حاضنة ( الشكل 1K ) التي تحتوي على غرفة حضانة الغاز والسماح لهم موازنة لدرجة حرارة الحاضنة.
3. نقل بعناية الأجنة في آبار لوحة 24-جيدا متشابكة ( الشكل 1B ) للغرفة حضانة الغاز، وذلك باستخدام ماصة بلاستيكية. دائما استخدام ماصة بلاستيكية لنقل الأجنة في جميع أنحاء البروتوكول.
  ملاحظة: كل بئر من هذه اللوحة يمكن أن تحتوي على ما يصلإلى 5 الأجنة الضفدع من المرحلة 38 أو ما يصل إلى 7 أجنة الزرد من 4 دبف. تسمية الآبار بعناية إذا كان استخدام أنماط وراثية مختلفة.
4. الحفاظ على غرفة حضانة الغاز تحت ضخ المستمر مع خليط الغاز من الاختيار لمدة 5 ساعات أو لفترة أطول التي تناسب التجربة. استخدام خليط من 5٪ O ₂ و 95٪ N ₂ هنا.
5. نقل بعناية الأجنة من غرفة الحضانة الغاز إلى وسط نورموكسيك المقابلة لنوع الجنين والمضي قدما على الفور مع الخطوات 3 أو 4.
6. إذا كان هناك حاجة إلى مزيد من العلاج نورموكسيك، نقل بعناية الأجنة مرة أخرى إلى الوسط نورموكسيك المقابلة لنوع الجنين.

3. السيطرة الناجحة نقص الأكسجة الحث عن طريق رصد مستويات هيف-1α

استعدادات
1. إعداد 0.4 ملغ / مل MS222 الحل في 0.1x مبس.
2. إعداد العازلة التجانس: شراء رابيمونوبوريسيبيتاتيون فحص العازلة (ريبا بالعازلة) لتجانس الأنسجة وتكملة كمية من العازلة اللازمة لتجربتك مع مثبط البروتياز إلى تركيز النهائي 1: 100 الخامس / الخامس.
3. إعداد حلول لطخة غربية.
  1. إعداد 4x ليملي العازلة تحميل هلام: 425 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، 40٪ الخامس / الخامس الجلسرين، 8٪ الخامس / الخامس سدز، 4٪ V / V بيتا ميركابتويثانول، 0.5٪ ث / الخامس بروموفينول الأزرق، 10 مل إجمالي حجم د ₂ O.
  2. إعداد 5X العازلة تشغيل: 15 ز قاعدة تريزما، 72 غرام من الجليكاين، 5 غرام سدز، 1 L إجمالي حجم د ₂ O.
  3. إعداد نقل العازلة: 2.66 غرام قاعدة تريزما، 14.4 غرام غليكاين، 200 مل 100٪ الميثانول، 1 L إجمالي حجم د ₂ O.
  4. إعداد 10X تبست: 5 مل 1 M تريس الرقم الهيدروجيني 8.0، 30 مل 5M كلوريد الصوديوم، 2.5 مل توين 20، 1 L إجمالي حجم H ₂ O.
  5. إعداد حل حجب: 4٪ ث / الخامس مسحوق الحليب الخالي من الدسم في تبست 1X.
مجموعة من الأنسجة
1. تخدير الأجنة عن طريق الاستحمام في 0.4 ملليجرام / مل MS222 الحل¹⁶ ^، ¹⁷ ونقلها إلى أنبوب التفاعل البلاستيك مليئة العازلة التجانس باستخدام ماصة بلاستيكية. استخدام 20 ميكرولتر العازلة في الجنين. لاحظ أن ما لا يقل عن 5 الأجنة الضفدع من المرحلة 38 أو 7 الأجنة الزرد من 4 دبف مطلوبة لتحديد تغيير كبير في مستويات البروتين HIF1α.
2. تجانس الأنسجة باستخدام الخالط الأنسجة المناسبة أو سونيكاتور. إزالة الحطام بواسطة الطرد المركزي (15 دقيقة، 13،000 x ج؛ 4 درجات مئوية).
  1. بدلا من ذلك، تشريح شبكية العين من الأجنة الضفدع تخدير ¹⁷ والتجانس على النحو الوارد أعلاه. استخدام 20 ميكرولتر من العازلة التجانس في 10 شبكية العين.
3. خذ طاف باستخدام ماصة، ينكر في 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتكملة مع ليملي العازلة تحميل هلام إلى تركيز النهائي من 1X الخامس / الخامس (على سبيل المثال ، إضافة 5 ميكرولتر من العازلة ليملي 4x إلى 15 ميكرولتر جناسة). استخدام هذا طاف ل ويسالخرشنة لطخة أو تجميد العينات في -20 درجة مئوية.
لطخة الغربية
1. تحميل العينات أعدت كما هو موضح في الخطوة 3.2 على 12٪ مسبقة هلام في نظام الكهربائي باستخدام 1X الخامس / الخامس تشغيل العازلة. استخدام سلم البروتين لتحديد حجم البروتين. نقل البروتينات على غشاء النيتروسليلوز (0.45 ميكرون غشاء) في نقل العازلة لمدة 1 ساعة معبأة على الجليد في 4 درجات مئوية، وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
2. منع مواقع ملزمة غير محددة احتضان الغشاء في العازلة حظر لمدة 60 دقيقة. اتبع مع 3 × 10 دقيقة يغسل في 1X تبست.
3. احتضان الغشاء في حلول أرنب المضادة لل هيف-1α الأجسام المضادة والفأر المضادة لل α- توبولين المخفف 1: 100 الخامس / الخامس و 1: 5000 الخامس / الخامس، على التوالي، في حجب الحل، لمدة 2.5 ساعة في رت. اتبع مع 3 × 10 دقيقة يغسل في 1X تبست.
4. للكشف، واحتضان في الماعز المضادة للأرنب والماعز المضادة للفأر هرب مترافق الأجسام المضادة المخفف 1: 1000 V / V في حجب الحل لمدة 1 ساعة.اتبع مع 3 × 10 دقيقة يغسل في تبست 1X وتصور تلطيخ هرب باستخدام مجموعة التجارية وآلة المطور من الاختيار.
5. تحديد كمية البروتين HIF1α باستخدام الكمي الرقمي.

4. رصد انتشار الخلايا في نقص الأكسجين

استعدادات
1. إعداد 5 ملي إيدو الحل في وسط الجنين في الاختيار. الحل يمكن استخدامها على الفور أو أليكوتد وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
2. إعداد الفوسفات مخزنة المالحة (بس) أو شراء برنامج تلفزيوني من الموارد التجارية. الأوتوكلاف لمدة 10 دقيقة عند 115 درجة مئوية.
3. إعداد حلول للكشف عن إدو التأسيس.
  1. إعداد حل التثبيت: 4٪ الخامس / الخامس من 16٪ محلول الأسهم الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني.
  2. إعداد حل السكروز: 30٪ ث / س السكروز في برنامج تلفزيوني.
  3. إعداد بست: 0.1٪ V / V تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني.
  4. إعداد حجب الحل: 10٪ الخامس / الخامس الحرارة المعطل مصل الماعز (Hإيغس) في بست.
  5. إعداد حل دابي: 1: 1000 V / V 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (دابي) في بست.
حضانة الأجنة في نقص الأكسجين لإدماج إيدو
1. ملء غرفة الحضانة الغاز مع 400-500 مل من 5 ملي إيدو حل تستكمل مع 1٪ V / V دمسو. قبل موازنة الحل مع نفس خليط الغاز المستخدمة في التجربة لمدة 15 دقيقة قبل التجربة. لاحظ أن حجم الحل الحضانة يمكن التقليل من خلال ربط قضبان أقصر ( الشكل 1E ) إلى لوحة شبكة أسفل.
2. توصيل أنابيب الغاز إلى اسطوانة الغاز التي تحتوي على خليط الغاز من 5٪ O ₂ و 95٪ N ₂ . احتضان الحل لمدة 15 دقيقة.
3. نقل الأجنة إلى غرفة الأكسجين، وتوزيعها بالتساوي بين الآبار واحتضان لمدة 2 ساعة. كل بئر يمكن أن يصلح ما يصل إلى 5 الأجنة الضفدع من المرحلة 38 أو ما يصل إلى 7 الأجنة الزرد 4 دبف.
4. تحليل الجنينs ل إيدو التأسيس.
الوقت بالطبع من حضانة الجنين في نقص الأكسجة وإيدو التأسيس
1. ملء غرفة الحضانة الغاز مع 500 مل من المتوسطة الجنين في الاختيار. توصيل أنابيب الغاز إلى اسطوانة الغاز التي تحتوي على خليط الغاز من 5٪ O ₂ و 95٪ N ₂ وتتوازن المتوسطة مع خليط الغاز لمدة 15 دقيقة.
2. نقل الأجنة إلى غرفة الأكسجين، وتوزيعها بالتساوي بين الآبار واحتضان لفترة زمنية المطلوب تصل إلى 48 ساعة. لآخر 1 ساعة، استبدال المتوسطة الجنين مع 5 ملي إيدو حل تستكمل مع 1٪ V / V دمسو.
3. نقل الأجنة مرة أخرى إلى طبق نورموكسيك وتحليل ل إيدو التأسيس.
إيدو كشف الكشف والتحليل
1. تخدير الأجنة عن طريق الاستحمام في 0.4 ملليجرام / مل MS222 الحل.
2. نقل الأجنة إلى قارورة زجاجية مناسبة وإصلاح عن طريق الحضانة في حل التثبيت لمدة 2 هكتارt رت أو O / N عند 4 درجات مئوية. اتبع مع 3 × 10 دقيقة يغسل في برنامج تلفزيوني. نقل بعناية الأجنة إلى حل السكروز ل كريوبروتكتيون الأنسجة. احتضان لمدة 4 ساعات أو حتى الأجنة تغرق إلى أسفل القارورة الزجاجية.
3. تضمين الأجنة في تضمين المتوسطة (الأمثل مجمع درجة الحرارة قطع). كتل كريوسكتيون مع الأجنة فورا أو تخزين لمدة تصل إلى 14 د في -80 درجة مئوية.
4. كريوسكتيون الكتل التي تحتوي على الأجنة باستخدام ناظم البرد. جمع أقسام من 12 ميكرون (الأجنة الزرد) أو 16 ميكرون (الأجنة الضفدع) سمك على الشرائح المجهر والسماح الجافة. عملية كريوسكتيونس فورا أو تخزين في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
5. كشف إيدو التأسيس بواسطة تلطيخ إمونوفلورسنت باستخدام كيت الكيمياء التجارية. إعداد كمية إيدو رد الفعل مزيج اللازمة لعدد كريوسكتيونس في التجربة، كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
  1. ل 500 ميكرولتر من إيدو رد فعل ميكس، استخدم 430 ميكرولتر من 1X رد فعل رد الفعل إيدو، 20 ميكرولتر من كسو ₄ ، 1.2 ميكرولتر من اليكسا فلور أزيد، 50 ميكرولتر من 1X إيدو العازلة المضافة.
6. غسل كريوسكتيونس مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني لإزالة المتوسطة تضمين و 3 × 5 دقيقة مع بست ل بيرمابيليز الأنسجة. احتضان كريوسكتيونس في حجب الحل لمدة 30 دقيقة.
7. احتضان كريوسكتيونس مع إيدو رد الفعل ميكس لمدة 1 ساعة تليها 3 × 10 دقيقة يغسل في بست. كوستين كريوسكتيونس مع حل دابي لمدة 15 دقيقة، تليها 3 × 10 دقيقة يغسل في بست. جبل الشرائح مع كريوسكتيونس الملون في تصاعد المتوسطة، وتغطي مع كوفرسليبس وترك لتجف قبل تحليل تحت المجهر الفلورسنت أو تخزين في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 سنة.
8. تحليل كريوسكتيونس مع تلطيخ مكافحة إيدو تحت مقلوب المجهر المسح متحد البؤر وتحديد عدد من الخلايا إيجابية إيدو باستخدام الكمي الرقمي.

النتائج

توظيف نظام غرفة نقص الأكسجة التي نقدمها هنا يسمح لدراسة آثار نقص الأكسجين بشكل فردي وفي الجسم الحي في الحيوانات الحية كلها. نقص الأكسجين يمكن أن يتسبب عن طريق وضع الأجنة الضفدع أو الزرد كامل في غرفة نقص الأكسجين ( الشكل 1 )، ويتم ?...

Discussion

هنا قدمنا طريقة جديدة سهلة ولكنها قوية للحث على نقص الأكسجة التي يتم تعديلها للاستخدام مع الأجنة الضفدع والزرد ولكن يمكن أيضا أن تكون مناسبة للكائنات المائية الأخرى. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة تكمن في بساطته وكفاءته من حيث التكلفة. ومع ذلك، فإن النتائج التي ت?...

Disclosures

ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل بدعم من جائزة ويلكوم ترست سيا 100329 / Z / 12 / Z إلى واه وزمالة دفغ خ 376 / 1-1 منحت لهونغ كونغ

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Sigma	S7653	NaCl/0.1x MBS, Embryo medium, 10x TBST
Potassium chloride	Sigma	P9333	KCl/0.1x MBS, Embryo mediu,
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	NaHCO₃/0.1x MBS
HEPES	Sigma	H3375	0.1x MBS
Magnesium sulfate	Sigma	M7506	MgSO₄/0.1x MBS, Embryo medium
Calcium nitrate	Sigma	202967	Ca(NO₃)₂/0.1x MBS
Calcium chloride	Sigma	C1016	CaCl₂/0.1x MBS, Embryo medium
Methylene blue	Sigma	M9140	Embryo medium
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)	Sigma	CG10	Frog fertilization
Zebrafish breeding tank	Carolina	161937	Gas chamber construction
24-well plate	Thermo Scientific	142475	Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction
Epoxy resin	RS Components UK	Kit 199-1468
Gas distributor valve	WPI Luer Valves	Kit 14011	Aquatic tank attachment (Schema 1, H)
High precision gas valve	BOC	200 bar HiQ C106X/2B	Gas tank attachment (Schema 1, I)
5% oxygen and 95% N₂ gas tank	BOC	226686-L	Hypoxic gas mixture
ceramic disc diffuser	CO₂ Art	Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005	Schema 1, J
silicone grease	Scientific Laboratory Supplies	VAC1100	Schema 1, K
oxymeter	Oxford Optronix	Oxylite, CP/022/001	Hypoxic chamber setup
fibre-optic dissolved oxygen sensor	Oxford Optronix	HL_BF/OT/E	Hypoxic chamber setup
plastic pasteur pipette	Sterilin	STS3855604D	For embryo transfer
MS222	Sigma Aldrich	E10521-50G	Embryo anesthetic
RIPA buffer	Sigma	R0278-50ML	Tissue homogenization
Protease inhibitor	Sigma	P8340	Tissue homogenization
Tris	Sigma	77-86-1	4x Laemmli loading buffer, 10x TBST
Glycerol	Sigma	G5516	4x Laemmli loading buffer
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Sigma	L3771	4x Laemmli loading buffer, 5x Running buffer
beta-Mercaptoethanol	Sigma	M6250	4x Laemmli loading buffer
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126	4x Laemmli loading buffer
Trizma base	Sigma	77-86-1	5x Running buffer, Transfer buffer
Glycine	Sigma	G8898	5x Running buffer, Transfer buffer
Methanol	Sigma	34860	Transfer buffer
Tween 20	Sigma	P2287-500ML	10x TBST
skim milk powder	Sigma	70166	Blocking Solution
Eppendorf microcentrifuge tube	Sigma	T9661
tissue homogenizer	Pellet Pestle Motor Kontes	Z359971	Tissue homogenization
pellet pestles	Sigma	Z359947-100EA	Tissue homogenization
precast 12% gel	Biorad	Mini-ProteinTGX, 456-1043	Western Blot
protein ladder	Amersham	Full-Range Rainbow ladder, RPN800E	Western Blot
nitrocellulose membrane (0.45 µm)	Biorad	162-0115	Western Blot
anti-HIF-1α antibody	Abcam	ab2185	Western Blot
anti-α-tubulin antibody	Sigma	T6074	Western Blot
goat anti-rabbit antibody	Abcam	ab6789	Western Blot
goat anti-mouse antibody	Abcam	ab97080	Western Blot
Pierce ECL 2 reagent	Thermo Scientific	80196	Western Blot
ECL films Hyperfilm	GE Healthcare Amersham	28906837	Western Blot
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine	santa cruz	CAS 61135-33-9	EdU, EdU incorporation
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Oxoid	BR0014G	1x
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908	Fixation solution
Sucrose	Fluka	S/8600/60	Solution solution
Triton X-100	Sigma	T9284-500ML	PBST
Heat-inactivated Goat Serum (HiGS)	Sigma	G6767-100ml	Blocking solution (EdU incorporation)
4',6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher Scientific	D1306	DAPI, EdU incorporation
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Molecular Probes	C10338	EdU incorporation
glass vial	VWR	98178853	EdU incorporation analysis
Tissue-Plus optimal cutting temperature compound	Scigen	4563	Embedding medium, EdU incorporation analysis
cryostat Jung Fridgocut 2800E	Leica	CM3035S	EdU incorporation analysis
microscope slides Super-Frost plus Menzel glass	Thermo Scientific	J1800AMNZ	EdU incorporation analysis
EdU Click-iT chemistry kit	Molecular Probes	C10338	EdU incorporation analysis
FluorSave	Calbiochem	D00170200	Mounting medium, EdU incorporation analysis
coverslips	VWR	ECN631-1575	EdU incorporation analysis
fluorescent microscope	Nikon	Eclipse 80i	EdU incorporation analysis
confocal scanning microscope	Olympus	Fluoview FV1000	EdU incorporation analysis
Volocity software	PerkinElmer	Volocity 6.3	EdU incorporation analysis

References

Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine. Crit Care. 11 (1), 203 (2007).
Grant, S., et al. Sea level and acute responses to hypoxia: do they predict physiological responses and acute mountain sickness at altitude?. Brit J Sport Med. 36 (2), 141-146 (2002).
Kajimura, S., Aida, K., Duan, C. Insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) mediates hypoxia-induced embryonic growth and developmental retardation. PNAS. 102 (4), 1240-1245 (2005).
Ong, K. K., Dunger, D. B. Perinatal growth failure: the road to obesity, insulin resistance and cardiovascular disease in adults. Best Pact Res Clin Endocrinol Metab. 16, 191-207 (2002).
Maxwell, P., Salnikow, K. HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor. Cancer Bio Ther. 3 (1), 29-35 (2004).
Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L. Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 269 (38), 23757-23763 (1994).
Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., Millhorn, D. E. Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha. J Biol Chem. 278 (18), 15911-15916 (2003).
Elks, P., Renshaw, S. A., Meijer, A. H., Walmsley, S. R., van Eeden, F. J. Exploring the HIFs, buts and maybes of hypoxia signalling in disease: lessons from zebrafish models. Disease Models & Mechanisms. 8, 1349-1360 (2015).
Guo, M., et al. Hypoxia-mimetic agents desferrioxamine and cobalt chloride induce leukemic cell apoptosis through different hypoxia-inducible factor-1alpha independent mechanisms. Apoptosis. 11 (1), 67-77 (2006).
Woods, I. G., Imam, F. B. Transcriptome analysis of severe hypoxic stress during development in zebrafish. Genom Data. 6, 83-88 (2015).
Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
Stevenson, T. J., et al. Hypoxia disruption of vertebrate CAN pathfinding through EphrinB2 is rescued by magnesium. PLoS Genet. 8 (4), e1002638 (2012).
Khaliullina, H., Love, N. K., Harris, W. A. Nutrient-Deprived Retinal Progenitors Proliferate in Response to Hypoxia: Interaction of the HIF-1 and mTOR Pathway. J Dev Biol. 4 (2), (2016).
Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, D. P., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).
Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
Kohn, D. F., Wixson, S. K., White, W. J., Benson, G. J. . Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , (1997).
McDonough, M. J., et al. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. JoVE. (70), (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

124

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: