الدولة الأرض استنفاد القرار فائقة التصوير في خلايا الثدييات

Summary

توضح هذه المقالة بروتوكول للكشف عن واحد أو أكثر من البلازما أو بروتينات الغشاء داخل الخلايا باستخدام مجهرية فائقة القرار استنزاف الدولة الأرض (GSD) في خلايا الثدييات. وهنا، نحن نناقش المنافع والاعتبارات المتعلقة باستخدام هذه النهج للتصور والتقدير الكمي للبروتينات الخلوية.

Abstract

التقدم في علم الأحياء المجهري وخلية الفلورسنت ارتباطاً وثيقا، مع تعزيز القدرة على تصور الأحداث الخلوية التي غالباً ما تؤدي إلى قفزات هائلة في فهمنا لكيفية الخلايا الدالة. تطوير وتوافر مجهرية فائقة القرار وسعت إلى حد كبير حدود الدقة البصرية من ~ 250--20 نانومتر. علماء الأحياء لم تعد تقتصر على وصف التفاعلات الجزيئية من حيث كولوكاليزيشن ضمن منطقة حيود محدودة، بل من الممكن الآن لتصور التفاعلات الدينامية للجزيئات الفردية. هنا، فإننا مخطط بروتوكول للتصور والتقدير الكمي للبروتينات الخلوية باستنزاف الأرض-دولة مجهرية لتصوير الخلية الثابتة. نحن نقدم أمثلة من بروتينات الغشاء مختلفة اثنين، وعنصر ترانسلوكون هيولى، sec61β، والمترجمة بغشاء البلازما عن طريق بوابة الجهد Ca L من نوع^{2 +} قناة (Ca_V1.2). وناقش مجهر محددة المعالم، أساليب التثبيت، وتبديل الصورة وضع المخزن المؤقت، والمزالق والتحديات لمعالجة الصور.

Introduction

ترجمة ردود فعل الإشارات الخلوية تغير البيئات الداخلية والخارجية لبدء استجابة خلوية. أنها تنظم جميع جوانب الفسيولوجيا البشرية، كأساس لهرمون وناقل عصبي الإفراج عن نبضات القلب، الرؤية، التسميد، والوظائف المعرفية. يمكن تعطيل هذه الشلالات مما يشير إلى عواقب وخيمة في شكل الظروف الفيزيولوجية المرضية بما في ذلك السرطان، باركنسون، ومرض الزهايمر. على مدى عقود، المحققين البيولوجية والطبية استخدمت بنجاح البروتينات الفلورية والمجسات وأجهزة استشعار العوامل البيولوجية مقترنة بالفحص المجهري الأسفار كأدوات أساسية لفهم المنظمة المكانية والزمانية الدقيقة لهذه الخلايا الإشارات.

نقاط قوة التقنيات البصرية مثل ابيفلوريسسينسي، [كنفوكل]، أو انعكاس الداخلية مجموع الأسفار (TIRF) مجهرية من حساسية، والسرعة، والتوافق مع التصوير خلية حية، في حين أن القيد الرئيسي بهم لا يمكن حل القرار حيود محدودة، وهياكل معنى أو مجمعات البروتين أقل من 200-250 نيوتن متر. مع التطور النظري والعملي للقرار فائقة القطعية (مثلاً، حفز الانبعاثات استنفاد مجهرية (STED¹)، منظم إضاءة مجهرية (سيم²) أو العشوائية دقة فائقة (مثلاً ، فوتواكتيفاتيد التعريب مجهرية (النخيل³)، أو أرض الدولة نضوب (جيرمن شيبرد^4،5))، تم تمديد القرار الأفقي ومحوري في الفحص المجهري الأسفار خارج الحاجز الحيود، بأمر من عشرات نانومتر. وهكذا، أن المحققين لديهم الآن لا مثيل لها القدرة على تصور وفهم كيف يترجم ديناميات البروتين والمنظمة لوظيفة على المستوى الجزيئي بالقرب.

أرض الدولة نضوب مجهرية متبوعاً بالعودة الفردية جزيء (جسديم)، أو ببساطة الديمقراطيين الاشتراكيين كما هو معروف، تلتف الحد حيود بتخفيض العدد من انبعاث فلوروفوريس^4،5في وقت واحد. ويستخدم ضوء الليزر ذات الطاقة العالية لتثير عينة المسمى فلوروفوري، قصف الإلكترونات مع الفوتونات وزيادة احتمال أنهم سوف يخضع 'تدور الوجه' وأدخل الثلاثي أو 'الظلام--الدولة' من الدولة متحمس⁴. وهذا يستنزف فعالية الدولة الأرض، ومن ثم الاسم 'البري استنزاف الدولة'. في حالة الثلاثي، فلوروفوريس لا تنبعث الفوتونات والعينة تظهر باهتة. ومع ذلك، هذه فلوروفوريس ستوتشاستيكالي العودة إلى أرض الدولة ويمكن أن تذهب من خلال عدة فوتون انبعاث انتقالات الحالة متحمس للأرض قبل أن تعود إلى الدولة الثلاثي. مع أقل تلويثاً فلوروفوريس في أي وقت من الأوقات، ينبعث فوتون رشقات نارية من fluorophores الفردية تصبح متميزة مكانياً وزمنياً من المجاورة فلوروفوريس. يمكن احتواء انفجار الفوتونات مع وظيفة غاوسي، centroid المحسوب الذي يتوافق مع موقف فلوروفوري مع دقة ترجمة التي تعتمد على (غ) الفتحة العددية للعدسة، والطول الموجي للضوء المستخدم الإثارة، ومن الأهمية بمكان عدد الفوتونات المنبعثة لكل فلوروفوري. واحد الحد من الديمقراطيين الاشتراكيين أنه، نظراً لمجموعة فرعية فقط من فلوروفوريس بنشاط تنبعث منه في أي وقت، يجب جمع آلاف صور خلال عدة دقائق لبناء خريطة كاملة تعريب. الوقت اكتساب طويلة جنبا إلى جنب مع اشتراط ليزر عالية الطاقة، يعني أن الديمقراطيين الاشتراكيين أكثر ملاءمة لثابت بدلاً من عينات حية.

توضح هذه المقالة، إعداد العينات الثابتة لتصوير مجهرية فائقة القرار بغشاء هيولى (ER)-البروتينات المقيم (للحصول على قائمة من المواد الاستهلاكية الضرورية والمواد الكاشفة انظر الجدول للمواد). أمثلة لكيفية هذا البروتوكول يمكن بسهولة تكييفها لقياس حجم ودرجة تجميع لتر من نوع الجهد-قنوات عن طريق بوابة Ca^{2 +} (Ca_v1.2) في ساركوليما myocytes القلب، أو المستخدمة لتصور توزيع الخلوية للائحة، وأظهرت. فهم توزيع وتنظيم هذه المكونات الخلوية من الأهمية بمكان فهم الشروع، والترجمة، وفي نهاية المطاف الدالة من كاليفورنيا العديد من^{2 +}-تعتمد الشلالات إرسال الإشارات. على سبيل المثال، Ca_v1.2 القنوات ذات أهمية أساسية للإثارة-تقلص اقتران, بينما ربما بوساطة مستقبلات Ca^{2 +} الإصدار لائحة تتالي إرسال الإشارات في كل مكان آخر في خلايا الثدييات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1-"غسل الزجاج كوفيرسليبس"

1. قبل تجهيز عينة، اليوم تنظيف الزجاج #1.5 كوفيرسليبس سونيكاتينج في حل م 1 من كوه ح 1. يؤدي هذا إلى إزالة أي ملوثات الفلورسنت التي قد تكون موجودة في كوفيرسليبس.
   1. جيدا شطف كوه من كوفيرسليبس مع الماء المتأين دي-
   2. بعد تنظيفها في كوه، تخزين كوفيرسليبس في الإيثانول 70% حتى جاهزة للاستخدام-

2. طلاء "الزجاج كوفيرسليبس"

ملاحظة: ينبغي إجراء الخطوات المذكورة في هذا المقطع في غطاء ثقافة خلية لمنع التلوث.

استخدام الملقط لإزالة ساترة فردية من الحل الإيثانول 70%

1. وسرعة اللهب لإزالة الزائدة. مكان كوفيرسليبس في لوحة 6-جيدا. إذا المشتعلة في غطاء ثقافة ليس خياراً، تنظر في التعقيم كوفيرسليبس بعد الشطف بالماء المتأين إزالة و/أو التعقيم تحت الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة في هود الثقافة لمالا يقل عن 30 دقيقة
2. لمساعدة التصاق الخلايا، معطف كوفيرسليبس مع العقيمة 0.01 ٪ بولي-L-يسين ح 1 في درجة حرارة الغرفة-
3. نضح بولي-L-يسين وشطف كوفيرسليبس مع الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS). الهواء الجاف، وتضع في الثلاجة بين عشية وضحاها.
4. في صباح اليوم التالي، إزالة كوفيرسليبس من الثلاجة وإضافة 300 ميليلتر من لامينين، بتركيز 50 ميكروغرام/مل، لمالا يقل عن 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ضمان أن لامينين يوضع بعناية مباشرة على ساترة-
   ملاحظة: هذه الخطوة laminin ليس ضروريا كوس-7 الخلايا أو الخلايا HEK293 غير مطلوب من أجل myocytes البطين المعزولة. الخلايا الأولية الأخرى مثل خلايا العضلات الملساء والأوعية الدموية أو الخلايا العصبية قد تنضم أفضل للكولاجين أو فيبرونيكتين المغلفة كوفيرسليبس.

3. إعداد الخلايا

1. 1. من الخلايا المستزرعة تنمو كوس-7 خلايا (أو خط الخلية المفضل) على طبق ثقافة 10 سم في 10 مل دولبيكو ' s تعديل النسور المتوسطة (دميم) الثقافة المتوسطة وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، و 1% البنسلين/ستربتوميسين (PS) الحل. تنمو الخلايا في حاضنة ثقافة خلية في 37 درجة مئوية و 5% CO ₂-
   2. عندما تصل الخلايا إلى 90% كونفلوينسي، حصادها من طبق 10 سم يسفط وسائط الإعلام دميم وإضافة 5 مل محلول التربسين-عطا 0.05%. حالما تبدأ الخلايا التقريب وفصل، تحييد فورا التربسين مع دميم المكملة.
      1. 5 مل استخدام ماصة المصلية لإزالة الخلايا من الطبق. "الماصة؛" المتوسط ضد قاعدة للطبق عدة مرات لإزالة أي الخلايا التي تظل ملتصقة وتوزيع الخلايا في جميع أنحاء المتوسط الثقافة المتجانسة.
   3. لوحة الخلايا على أطباق الثقافة 35 ملم لتحقيق كونفلوينسي 70% تعداء. جعل حجم متوسطة في الطبق يصل إلى 2 مل مع الطازجة دميم/FBS/PS الحل.
   ثوابت
   4. الخلايا ترانسفيكت كوس-7 مع بلازميد المطلوب الحمض النووي (مثلاً، sec61β-مشري بلازميد)، باستخدام كاشف تعداء مناسبة ووفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s.
      ملاحظة: قد تستغرق 24-48 ح للبروتين للتعبير، اعتماداً بلازميد و/أو استخدام الكاشف تعداء.
2. ميوسيتيس البطين الماوس الكبار
   1. عزل myocytes البطين الماوس الكبار باستخدام أسلوب من نضح لانجيندورف راسخة ⁶. إعادة تعليق بيليه الناتجة من ميوسيتيس في المتوسط 199 (M199) وتستكمل مع 2.5% FBS و 1% س.

4. طلاء الخلايا

1. 1. من الخلايا Transfected كوس-7 نضح 2 مل الحل دميم/FBS/PS من طبق 35 ملم وإضافة 1 مل Ca ^{2 +}-مجاناً برنامج تلفزيوني. العودة الطبق إلى حاضنة للحد الأدنى 2 الخلايا الحصاد من الطبق بأول يسفط Ca ^{2 +}-مجاناً برنامج تلفزيوني ومن ثم إضافة 1 مل من محلول التربسين-عطا 0.05%.
      1. مرة واحدة تبدأ الخلايا حتى الجولة وفصلها، وتحييد التربسين مع 1 مل دميم تستكمل فورا. "الماصة؛" بلطف صعودا وهبوطاً عدة مرات لضمان transfected الخلايا هي موزعة بالتساوي في جميع أنحاء تعليق 2 مل التربسين-عطا-دميم.
   2. لوحة transfected الخلايا كوس-7 على كوفيرسليبس بولي-L-يسين المغلفة كثافة مناسبة حيث أن خلايا مفردة يمكن تصور، وملء حجم صحن يصل إلى 2 مل مع دميم/FBS/PS (مثلاً، إضافة تعليق خلية ميليلتر 90 إلى ساترة ثم إضافة تكملة ميليلتر 1,910 دميم، ودوامه طبق لتوزيع الخلايا بالتساوي).
      ملاحظة: الخلايا لا تحتاج لحسابها ولكن ستختلف حجم الخلايا المراد إضافتها إلى كل طبق كونفلوينسي الخلايا.
   3. عودة مطلي الخلايا إلى حاضنة الثقافة الخلية بين عشية وضحاها للسماح للخلايا للتقيد واسترداد.
2. ميوسيتيس البطين الماوس الكبار
   1. اعقلوها myocytes laminin ولوحة مباشرة على كوفيرسليبس المغلفة كثافة مناسبة حيث أنه يمكن تصور الخلايا الفردية. وهذا يعتمد على كثافة خلايا قابلة للحياة التي تم الحصول عليها من العزلة.
   2. التوازن بين تعليق خلية في قبة ساترة ومكان في حاضنة ثقافة خلية في 37 درجة مئوية و 5% CO ₂ ~ 45 دقيقة للسماح بانضمام-

5. تثبيت خلايا

1. إزالة خلايا من الحاضنة ونضح بدقة المتوسطة.
   1. شطف الخلايا ملتصقة مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
   إصلاح الخلايا مع مثبت الأمثل للتطبيقات الفردية والأجسام المضادة
   2. .
      ملاحظة: هو معيار مهم لأن نأخذ في الاعتبار عند اختيار مثبت الحفاظ على البنية الخلوية للعينة، بينما تكفل أيضا أنه لم يحدث أي تغيير كونفورماشونال في antigen للفائدة. لأغراض هذا البروتوكول التثبيت مع 3% paraformaldehyde/0.1% جلوتارالديهيدي (PFA/GA) والتثبيت مع 100 ٪ الميثانول هو ناقش.
2. التثبيت PFA/GA transfected كوس-7 خلايا معربا عن Sec61β-مشري
   1. مزيج 1.9 مل 16% 20 GA 50% ميليلتر ومنهاج عمل بيجين وإضافة برنامج تلفزيوني لجعل وحدة تخزين نهائي من 10 مل.
   2. إضافة 1 مل طازج PFA/GA الحل لكل طبق من الخلايا والإصلاح لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة-
   3. نضح الخلايا PFA/GA وشطف 3 مرات مع PBS.
   أغسل
   4. الخلايا التقيد بها مع برنامج تلفزيوني، 5 مرات لمدة 5 دقائق. تنفيذ كافة الخطوات الغسيل على دوار تعيين إلى سرعة معتدلة (مثلاً، 50 دورة في الدقيقة)-
   5. المقبل، خفض مجموعات ألدهيد مجاناً مع 1 مل طازج بورهيدريد الصوديوم كتلة/حجم 0.1% في الماء المتأين دي-
   6. الخلايا شطف مرتين ثم يغسل 3 مرات لمدة كل 5 دقائق في برنامج تلفزيوني لإزالة جميع آثار بورهيدريد الصوديوم والكحول وتنتج عند فإنه يتفاعل مع الألدهيدات الحرة-
3. التثبيت الميثانول من الماوس الكبار البطين ميوسيتيس
   1. بعناية إضافة 1 مل من المثلج 100 ٪ الميثانول إلى الخلايا. إمالة لوحة 6-جيدا و "الماصة؛" الميثانول ضد الجدار الجانبي بدلاً من مباشرة على ساترة. ثم إمالة لوحة 6-جيدا مرة أخرى إلى أفقي للسماح الميثانول يغسل بالتساوي عبر الخلايا. إصلاح لمدة 5 دقائق في-20 درجة مئوية.
   2. نضح الخلايا مثبت وشطف 3 مرات مع PBS.
   3. تغسل الخلايا التقيد بها مع برنامج تلفزيوني، 5 مرات لمدة كل 5 دقائق على المدورة.

6. حظر الملزمة الخاصة بعدم

1. كتلة ح 1 في درجة حرارة الغرفة في حل حظر (انظر الجدول للمواد)-
   ملاحظة: يمكن استخدام مختلف الحلول كتلة جسم غير محددة ملزمة بما في ذلك 3% ألبومين المصل البقري (BSA) أو المصل غير المتمتعين بالمناعة من نفس النوع كجسم الأولية.

7. الكشف عن

1. الاحتضان الابتدائي جسم
   1. أسبيراتي حل حظر. عدم غسل أو شطف.
   إعداد
   2. الحل جسم الابتدائي كما يلي (راجع الخطوة 7.1.5): تضعف جسم الأولية لتركيز من 10 ميكروغرام/مل (أو الشركة المصنعة ' s اقترح تركيز) في حل حضانة جسم (انظر الجدول "للمواد" ). التوازن هذا الحجم الصغير على ساترة ومجموعة مربع من البارافين البلاستيك الفيلم بعناية في الأعلى. وهذا تساعد على نشر وحدة صغيرة من جسم أكثر ساترة وحراس ضد التبخر.
   3. بوضع لوحة 6-جيدا في دائرة رطوبة واحتضانها طوال الليل في الثلاجة.
   4. في الصباح، وإزالة الخلايا من قاعة الرطوبة، بعناية إزالة الفيلم البارافين مربعة من سطح ساترة ونضح الحل جسم الأولية.
   5. شطف 3 مرات مع برنامج تلفزيوني، ثم يغسل 5 مرات لمدة 5 دقائق مع الغسيل الحل الكتلة (انظر الجدول للمواد) على محور دوار.
      ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول التالي الأجسام المضادة، ومكافحة-RFP الماوس [مونوكلونل] جسم للصور المعروضة في الشكل 2 وارنب [بولكلونل] FP1 ⁷ مكافحة Ca _V 1.2 جسم (هدية من زين. يوهانس الجحيم، جامعة كاليفورنيا ديفيس) للصور المعروضة في الشكل 3. فيما يتعلق بدائرة الرطوبة، اصطف علبة بلاستيكية طعام غداء مع غطاء ضيقة، مع مناشف ورقية رطبة الأشغال. يمكن استخدام برنامج تلفزيوني للغسيل الخطوات، بيد أن هذا البروتوكول يحسن خصوصية وضع العلامات، ويقلل من الخلفية باستخدام حل حظر مخفف للغسيل الخطوات.
2. حضانة جسم الثانوية
   1. نضح الحل الغسيل وإضافة 200 ميليلتر مترافق جسم الثانوي حل المخفف 1:1,000 في جسم الاحتضان الحل. ضع مربع من البارافين الفيلم على رأس ساترة (راجع الخطوة 7.1.2)-
   2. إينكوباتي ح 1 في درجة حرارة الغرفة في الظلام-
   3. جسم أسبيراتي الثانوية وشطف 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
   4. تغسل الخلايا مع حل حظر المخفف 5 مرات لمدة 5 دقائق في الروك.
   5. الغسيل 3 مرات لمدة 5 دقائق مع PBS.
      ملاحظة: هذا البروتوكول وصف استخدام الماوس المضادة 647 أليكسا مترافق جسم الثانوية وارنب المضادة 647 أليكسا مترافق جسم الثانوية الشكل 2 و الشكل 3، على التوالي. لوسم البروتين وحيد، هو 647 أليكسا fluorophore المفضل نظراً لعد فوتون عالية (يحسن الدقة التعريب) ودورة العمل منخفضة (يحسن الأزمنة) ⁸. تتوفر العديد من خيارات مترافق fluorophore جسم الثانوية الأخرى، مثل أتو أو صبغات قبرصي،. الرجوع إلى ديمبسي et al. ⁸ وتشوزينسكي et al. ⁹ تقييمات شاملة لمدى ملاءمة عدة fluorophores/الأصباغ لتصوير فائقة القرار.

8. بعد انتهاء التثبيت (خطوة اختيارية)

1. تمييع 50 ميليلتر GA 50% في 10 مل برنامج تلفزيوني للحصول على حل GA 0.25%. بعد إصلاح الخلايا لمدة 10 دقائق في هذا الحل في درجة حرارة الغرفة-
2. يغسل مع برنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 5 دقائق على المدورة.

9. تخزين العينات

1. تخزين العينات في الثلاجة (4 درجات مئوية) في حاوية ألومنيوم إحباط مبطنة لحماية من الضوء حتى التصوير-
2. تخزين للتخزين على المدى الطويل من عينات (تصل إلى عدة أشهر)، في برنامج تلفزيوني يتضمن أزيد الصوديوم 3 مم لمنع نمو البكتيريا.

10. الديمقراطيين الاشتراكيين القرار فائقة "التصوير إعداد المخزن المؤقت فوتوسويتشينج"

1. إعداد مسح الأكسجين ' جلو ' الحل كما يلي:
   1. في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، إضافة 12.5 ميليلتر كاتالاز (الأسهم 34 ملغ/مل)، 3.5 ملغ أوكسيديز الجلوكوز، و 0.5 ميليلتر م 1 تريس (pH = 8) إلى 49.5 ميليلتر PBS.
   2. دوامة بإيجاز تذوب المكونات في الحل ثم الطرد المركزي في 20,800 س ز لمدة 3 دقائق على 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: تم إيجاد حلول المسح الأكسجين مثل جلو، معارضة فوتوبليتشينج. ينبغي أن تظل جلو في الثلاجة لمدة تصل إلى أسبوع واحد. كرر الخطوة أجهزة الطرد المركزي في كل مرة يتم استخدامه-
2. تحضير فوتوسويتشينج الذي يحفز ثيول الحل كما يلي:
   1. إعداد 100 مم β-ميركابتوثيلاميني (طيران الشرق الأوسط) الحل في برنامج تلفزيوني وتعديل درجة الحموضة pH 8 أو استخدام β-ميركابتوثانول (βME) بدلاً من ذلك. تخزين الكوتيد شركة طيران الشرق الأوسط الحل في الثلاجة (-20 درجة مئوية) لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
3. فورا قبل التصوير، إعداد المخزن المؤقت التحويل النهائي على الجليد بإضافة ثيول ومكونات الأكسجين المسح معا. عن 500 ميليلتر جلوكس-الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف، إضافة 5 ميليلتر جلوكس ميليلتر 50 شركة طيران الشرق الأوسط (pH = 8) و 445 ميليلتر المالحة في المخزن المؤقت (2.5 مل م 1 تريس الأس الهيدروجيني = 8، مغ 29.22 كلوريد الصوديوم (10 ملم تركيز النهائي)، الجلوكوز 5 غ و 47.5 مل من الماء). وبدلاً من ذلك، لحل βME جلوكس إضافة 5 ميليلتر جلوكس إلى 5 ميليلتر βME وميليلتر 490 المالحة المخزن المؤقت-
   1. تبقى الحلول على الجليد واستخدامها حسب الحاجة لتحميل عينات على الشرائح الزجاجية الاكتئاب.
      ملاحظة: حمل ثيول الحلول التي تحتوي على مثل βME أو شركة طيران الشرق الأوسط فوتوسويتشينج المستندة إلى cyanine الأصباغ مثل 647 أليكسا ¹⁰ أو على أساس xanthene الأصباغ مثل أليكسا 568. ΒME يؤدي إلى نتائج أفضل مع 647 أليكسا حين اتفاق بيئي متعدد الأطراف المفضل ل 568 أليكسا أو عندما تكون البروتينات 2 تصويرها بنهج وضع العلامات مزدوجة تستخدم أليكسا 568 و 647. المخزن المؤقت سوف تتدهور خلال فترة ساعات بسبب التحمض. سوف يؤدي هذا إلى انخفاض في عدد فوتون متوسط العينة. لمنع هذا، من المستصوب جعل المخزن المؤقت فوتوسويتشينج جديدة بعد ح 2-3 أو إذا لوحظ انخفاضا في عدد فوتون متوسط أو ملحق ملحوظا من الوقت الذي يستغرقه فوتوسويتشينج المستحث. ووصف مقال نشر مؤخرا تصوير المخزن مؤقت جديد ثور-عصام الذي نحن لم تختبر بعد ولكن يقال أن المعروضات الأس الهيدروجيني مستقرة المستويات لعدة أيام، وأداؤها أفضل من جلوكس ل تطبيقات التصوير متعدد الألوان ¹¹-

11. تركيب عينات

1. كوفيرسليبس جبل مع الخلايا المسماة (انظر الأقسام 1-9) في الاكتئاب الشرائح، باستخدام 100 ميليلتر المخزن المؤقت للتصوير-
2. ختم حواف ساترة مع غراء سيليكون لمنع الأكسدة السريعة للمخزن المؤقت للتصوير. انتظر عدة دقائق حتى يشفي الغراء سيليكون قد تماما وإلا ساترة الانجراف عند التصوير-
   ملاحظة: سوف لا تتصلب غراء السيليكون إذا أنه يأتي في اتصال مع βME. ومن المؤكد أن تجف حواف ساترة للحيلولة دون الاتصال المخزن المؤقت التصوير الغراء سيليكون.

12. التقاط صور

1. انظر الجدول 1 للاطلاع على قائمة التصوير المعلمات المستخدمة في الشكل 2 و الشكل 3-
   1. للبدء، حدد الليزر مناسبة لإلقاء الضوء على العينة اعتماداً على فلوروفوري المحددة. الديمقراطيين الاشتراكيين ريال النظام المستخدم في هذا البروتوكول مجهز بأشعة الليزر عالية الطاقة (488 نانومتر، 1.4 كيلو واط/سم ²؛ 532 نانومتر، 2.1 كيلو واط/سم ²؛ 561 نانومتر، 2.1 كيلو واط/سم ² 642 نانومتر، 2.1 كيلو واط/سم ²). الشكل 2 استخدام الليزر نانومتر 642.
2. استخدام عدسة هدف نفط-غمر مع na عالية. الديمقراطيين الاشتراكيين ريال النظام المتبع هنا مجهزة الاشتقاق رر HC 160 X/1.43 الهدف غ.
3. اختيار المكعب التصوير مزدوج اللون المناسب. نظام ريال-الديمقراطيين الاشتراكيين في هذا البروتوكول مجهزة 488 إتش تي، 532 إتش بي تي، 568 إتش تي، تي إتش 642 مع مرشحات تمرير الفرقة الانبعاثات نانومتر 505-605 و 550-650 نانومتر 660-760 نانومتر.
4. تحديد وضع اقتناء 2D. تعيين الكاميرا إلى وقت التعرض ووضع الإطار ونقل إلى 10 مللي ثانية (100 هرتز). تعيين كسب م إلى 300. حدد عتبة الكشف.
   ملاحظة: عتبات منخفضة إنتاج الصور مع خلفية عالية. يمكن تصفية عتبات عالية الإشارة للفائدة. تحديد العتبة استناداً إلى عناصر سلبية مثل التصوير كوفيرسليبس غير transfected الخلايا أو الخلايا المحتضنة مع الجسم المضاد الثانوي فقط.
5. تشغيل التحكم التلقائي بالحدث والأحداث تعيين كل الصور إلى 8-
أدخل
6. حجم بكسل في علامة التبويب الديمقراطيين الاشتراكيين-اقتناء (تبدأ مع 10 نانو متر أو 20 حجم بكسل في شمال البحر الأبيض المتوسط). التأكد من أن " "وضع الرسم البياني" " المحدد في علامة التبويب أدوات الديمقراطيين الاشتراكيين ضمن خيارات حساب الصورة قبل الحصول على صورة عالية الدقة-
7. لصورة البروتينات في غشاء البلازما وحدد وضع TIRF وتعديل زاوية السقوط لتحديد عمق الاختراق.
8. لإرسال الإلكترونات للدولة الظلام (تسمى ضخ)، تعيين كثافة الليزر إلى 100%-
9. حدد الكشف عن جزيء واحد بينما الضخ وتعيين إلى اكتساب تلقائياً عندما يكون الارتباط الإطار 0.20.
10. لاقتناء، تعيين كثافة الليزر إلى 50%-
11. تعيين عدد الإطارات التي تم اقتناء إلى 60 ألفا-
    ملاحظة: قد تجد المحقق أن عينة يتطلب أكثر أو أقل من الإطارات من هذا. تعديل عدد الإطارات استناداً إلى الملاحظات لاقتناء فلوروفوري فوتوبليتشينج وتوقف عند أي أحداث أخرى قابلة للاكتشاف.
12. اقتناء ابدأ.
    ملاحظة: في بداية اقتناء، جميع صبغ الجزيئات في الحالة الفلورسنت وثم التبديل إلى حالة الظلام. عندما تصل العلاقة الإطار إلى 0.20، سوف تبدأ الصور للحصول عليها. عندما يتم الكشف عن أحداث أقل من 8 لكل إطار، ستتحول الليزر 405، تشجيع fluorophores للانتقال من حالة الظلام إلى أرض الدولة. عند الحصول على صور لمجموعة من n = x الخلايا من n = y الحيوانات، معلمات مثل TIRF عمق الاختراق، وعتبة الكشف، وعدد الإطارات التي تم الحصول عليها يجب أن تبقى ثابتة.

13. صورة التحليل

1. لقياس حجم كتلة البروتين، استخدم ' تحليل الجزيئات ' ميزة إيماجيج.
   ملاحظة: قد إجراء المزيد من التحليل استخدام تحليل التعريب النسبي القائم على الفحص المجهري التعمير البصرية العشوائية (العاصفة-RLA) أو مماثلة ¹³.
   1. إجراء تحليل الكتلة ( الشكل 3) استخدام إيماجيج كالتالي:
   2. فتح ملف الصورة يتم تحليلها. ينبغي أن يكون هذا مخطط تعريب جزيء واحد الرسم بياني شمال البحر الأبيض المتوسط 10 يتم إنشاؤها في برامج التصوير المذكورة أعلاه (المادة 12)-
   3. ضبط السطوع والتباين لتصور الصورة: انقر فوق في القائمة صورة، حدد ضبط، ثم السطوع والتباين. انقر فوق الخيار التلقائي.
   4. تغيير نوع الصورة إلى 8-بت: حدد القائمة صورة، ثم حدد نوع، واختيار 8 بت-
   5. تعيين حجم الصورة: فتح القائمة تحليل، انقر فوق تعيين مقياس وإدخال المعلمات التالية: المسافة = 1، تعرف المسافة = 10، 1 بيكسل = 10 نانومتر.
   6. لتحديد القياسات للحصول عليها، افتح قائمة تحليل، حدد مجموعة من القياسات، وعلامة في المربع بجانب خيار المنطقة.
   7. ضبط الحد الأدنى الصورة. فتح القائمة صورة، حدد ضبط ثم قم بتحديد العتبة، حدد أكثر من/تحت. تحريك الحد الأقصى للقيمة إلى 255، وتحريك الحد الأدنى للقيمة إلى 1 ثم انقر فوق تطبيق.
   8. لتحليل الجزيئات، افتح قائمة تحليل، حدد تحليل الجزيئات. ضع علامة اختيار تحديد وحدات بكسل وعرض النتائج وتلخيصها. تعيين الحجم إلى 4-انفينيتي (نظراً لقرار ~ 20 nm)، حدد الخيار الخطوط العريضة العارية وانقر فوق موافق. سيتم إنشاء ملف موجزة التي سوف تحتوي على تفاصيل التحليل مثل حجم الكتلة متوسط وعدد الكتل في الصورة-
      ملاحظة: يجب توخي الحذر عند تقديم استنتاجات حول عدد البروتينات داخل مجموعة معينة، كعدد النقاط المترجمة لا يرتبط خطيا مع عدد البروتينات. الديمقراطيين الاشتراكيين يموضع الأصباغ التي هي مترافق للأجسام المضادة، نتج عنه خطأ ربط التي تحل محل التسمية الفلورسنت من بيفرتون من > 10 نانومتر في أي اتجاه. بالإضافة إلى ذلك، إذا استخدمت [بولكلونل] أجسام، يمكن ربط جسم واحد أو أكثر مستضد واحد والخلط بين مسألة أبعد والتجارية الثانوية هي مترافق الأجسام المضادة، في المتوسط، 3-6 جزيئات من صبغة فلوروفوري واحدة لا تساوي دائماً بروتين واحد. يمكن تقليل الخطأ الربط بالتصريف صبغة مباشرة إلى جسم الأولية (القضاء على الثانوية) أو بواسطة استخدام نظام وضع العلامات على أساس نانوبودي ¹⁴-

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وكما هو موثق في المقدمة، هناك العديد من دقة فائقة مختلفة مجهرية التصوير الطرائق. ويركز هذا البروتوكول، تصوير فائقة القرار الديمقراطيين الاشتراكيين. وترد في الشكل 2 و الشكل 3الصور التمثيلية وخرائط التعريب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

عرضت التفجير الأخير للتكنولوجيات التي تسمح لتصوير خارج حدود حيود نوافذ جديدة إلى تعقيدات الثدييات الخلية إشارات في الزمان والمكان. وتشمل هذه التكنولوجيات العاصفة، STED والنخيل، والديمقراطيين الاشتراكيين، سيم وأشكالها (مثلاً، دستورم، فبالم). إبداع العلماء وراء هذه التقنيات قد سمح لن?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOH	Thermo Scientific	P250-500	To clean coverglass
#1.5 coverglass 18 x 18 mm	Marienfeld Superior	0107032)	To grow/process/image cells
10x PBS	Thermo Scientific	BP3994	Dilute to 1x with de-ionized water
Poly-L-Lysine	Sigma	P4832	Aids with cell adhesion to cover glass
laminin	Sigma	114956-81-9	Aids with cell adhesion to cover glass
Medium 199	Thermo Scientific	11150-059	Ventricular myocyte culture media
DMEM 11995	Gibco	11995	Cell culture media
Fetal bovine Serum (FBS)	Thermo Scientific	10437028	Media supplement
Penicillin/streptomycin	Sigma	P4333	Media supplement
0.05% trypsin-EDTA	Corning	25-052-CL	Cell culture solution
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transient transfection reagent
Ca2+-free PBS	Gibco	1419-144	Cell culture
100 % Methanol	Thermo Fisher Scientific	A414-4	Cell Fixation
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Cell Fixation
Glutaraldehyde	Sigma Aldrich	SLBR6504V	Cell Fixation
SEAblock	Thermo Scientific	37527	BSA or other blocking solution alternatives exist
Triton-X 100	Sigma	T8787	Detergent to permeabilize cells
Rabbit anti-CaV1.2 (FP1)	Gift	N/A	Commercial anti-CaV1.2 antibodies exist such as Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003)
Mouse monoclonal anti-RFP	Rockland Inc.	200-301-379	Primary antibody
Alexa Fluor 647 donket anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen (Thermo Scientific)	A31573	Secondary antibody
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen (Thermo Scientific)	A11031	Secondary antibody
Sodium azide	Sigma	S2002	Prevents microbial growth for long term storage of samples
Catalase	Sigma	C40	Photoswitching buffer ingredient
Glucose oxidase	Sigma	G2133	Photoswitching buffer ingredient
Tris	Sigma	T6066	Photoswitching buffer ingredient
beta-Mercaptoethylamin hydrochloride	Fisher	BP2664100	Photoswitching buffer ingredient
β-mercaptoethanol	Sigma	63689	Photoswitching buffer ingredient
NaCl	Fisher	S271-3	Photoswitching buffer ingredient
Dextrose	Fisher	D14-212	Photoswitching buffer ingredient
Glass Depression slides	Neolab	1 – 6293	To mount samples
Twinsil	Picodent	13001000	To seal coverglass
sec61β-mCherry plasmid	Addgene	49155
Leica SR GSD 3D microscope	Leica
ImageJ
Washing block solution			20 % SEAblock in PBS
Primary antibody incubation solution			0.5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, in PBS
Secondary antibody incubation solution			1:1000 in PBS