JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هذه المخطوطة يصف الإجراءات لاختلاق وتميز ألياف اليكتروسبون تعديل جريفيثسين بولي (حمض اللبن-co-الجليكوليك) التي تبين نشاط لاصقة والأدوية المضادة للفيروسات القوية ضد الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 في المختبر. الأساليب المستخدمة لتجميع، تعديل السطح، وتميز مورفولوجية الناتجة، الاقتران، ووصف الامتزاز جريفيثسين من تعديل سطح الألياف.

Abstract

ألياف اليكتروسبون (EFs) وقد استخدمت على نطاق واسع في مجموعة متنوعة من التطبيقات العلاجية؛ ومع ذلك، أنها إلا في الآونة الأخيرة طبقت كما هي تقنية لمنع وعلاج الأمراض التي تنتقل (المنقولة). وعلاوة على ذلك، العديد من التكنولوجيات EF تركز على تغليف عامل نشط، بالنسبة للاستفادة من السطح لنقل بيوفونكتيوناليتي. هنا يصف لنا طريقة لاختلاق والسطح-تعديل poly(lactic-co-glycolic) الحمضية (بلجا) ألياف اليكتروسبون مع يكتين المضادة للفيروسات القوية جريفيثسين (جرفت). بلجا هو بوليمر وافقت إدارة الأغذية والعقاقير التي استخدمت على نطاق واسع في إيصال الأدوية بسبب خصائصه الكيميائية ومتوافق حيويا المعلقة. وهو جرفت الطبيعية، قوية، ويكتين الآمنة التي تمتلك نشاط واسع النطاق ضد فيروسات عديدة بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 (فيروس نقص المناعة البشرية-1). عندما يتم دمجها، أثبتت ألياف معدلة جرفت المنظمة القوية لفيروس نقص المناعة البشرية-1 في المختبر. هذه المخطوطة يصف الأساليب اختﻻق وتميز تعديل جرفت EFs. أولاً، هو بلجا اليكتروسبون لإنشاء سقالة ألياف. الألياف تعديل للسطح في وقت لاحق مع جرفت استخدام 1-إيثيل-3-(3-ديميثيلامينوبروبيل) كاربودييميدي (EDC) والكيمياء N-هيدروكسيسوكسينيميدي (NHS). واستخدمت المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM) لتقييم حجم ومورفولوجيا سطح تعديل الصيغ. بالإضافة إلى ذلك، gp120 أو هيماغلوتينين (ها)-أليسا أساس يمكن أن تستخدم لتحديد مقدار جرفت مترافق ل، فضلا عن الامتزاز جرفت من سطح الألياف. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على نطاق واسع اختﻻق الألياف التي يتم تعديل سطح مع مجموعة متنوعة من البروتينات المختلفة.

Introduction

وقد استخدام EFs كمنصة تسليم الموضعية يمكن أن تقلل إلى حد كبير من العداوي المنقولة جنسياً. حاليا، هناك ما يزيد على 36 مليون شخص يعيشون مع فيروس نقص المناعة البشرية، مع ما يزيد على 2 مليون من الحالات الجديدة المبلغ عنها في عام 2015 وحدها1،2. بالإضافة إلى ذلك، اكتب 2 (HSV-2) العدوى يؤثر على مئات الملايين من الناس في جميع أنحاء العالم فيروس الحلأ البسيط وقد ثبت أن تعزيز الحصول على فيروس نقص المناعة البشرية من 2-5 إضعاف3. بسبب هذه العلاقة بين عدوى HSV-2 واكتساب فيروس نقص المناعة البشرية، هناك اهتمام كبير بتطوير عناصر فاعلة جديدة توفر الحماية الفورية ضد العداوي المنقولة جنسياً متعددة. وعلاوة على ذلك، يوفر تطوير مركبات جديدة تحسين أداء هذه العوامل المضادة للفيروسات يمكن أن تزيد من تعزيز القدرة الوقائية والعلاجية. نحو تحقيق هذا الهدف، تم تحري EFs كمنصة تسليم جديدة للحد من انتشار الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 و 2-هامبورغ.

وخلال العقدين الماضيين، استخدمت EFs على نطاق واسع في الحقول لإيصال الأدوية، و هندسة الأنسجة4. وغالباً ما يتم اختيار البوليمرات متوافق حيويا أن يترجم بسهولة إلى التطبيقات العلاجية. لاختلاق EFs البوليمرية، هو حل البوليمر المحدد في حلاً مائي أو المذيبات عضوية، تبعاً لدرجة البوليمر هيدروفوبيسيتي5. ثم تضاف عناصر فاعلة لمصلحة حل المذيبات أو مائي قبل عملية اليكتروسبينينج. ثم يستنشق في محقن الحل البوليمر وإخراجه ببطء بينما تخضع لتيار كهربائي. وينتج هذه العملية عادة الألياف البوليمرية مع ورقة أو أسطواني ماكروستروكتوريس (الشكل 1)، والألياف بأقطار تتراوح بين الصغير إلى نانو الحجم6. للتطبيقات العلاجية الأكثر، مدرجة ضمن الألياف أثناء عملية اليكتروسبينينج عناصر فاعلة وتم إصدارها من الألياف عن طريق نشر وتدهور الألياف اللاحقة. يمكن تغيير معدل التدهور أو الإصدار باستخدام أنواع مختلفة من البوليمرات أو البوليمر يمزج بإنشاء ملف تعريف إصدار المطلوب، إضفاء خصائص كيميائية وفيزيائية فريدة من نوعها7، وتشجيع تغليف تقريبا أي مجمع. على هذا النحو، وقد أثبتت EFs مفيداً لإيصال الأدوية جزيء صغير والعوامل البيولوجية، بما في ذلك البروتينات، الببتيدات، النوكليوتيد، وعوامل النمو6،،من89.

في مجال الوقاية من الأمراض المنقولة جنسياً، EFs مؤخرا استخدمت لدمج وتوفير استدامة-أو إيندوسيبلي-الإفراج عن العوامل المضادة للفيروسات10،11،،من1213،14 ،،من1516،17،،من1819. في واحدة من الدراسات أقرب، وضعت ألياف المراعية للأس الهيدروجيني بالإفراج عن عناصر فاعلة في الاستجابة للتغيرات البيئية داخل المسالك التناسلية الأنثى (معاهدة سجل الأفلام)، كأسلوب الطلب على الحماية ضد فيروس نقص المناعة البشرية-111. منذ ذلك الحين، حققت دراسات أخرى يمزج بوليمر يتألف من البولي إيثيلين أكسيد (بيو) وحامض بولي-L-اللبن (ذات)، لتقييم الإصدار الانضباطي للعوامل المضادة للفيروسات واستخدام وسائل منع الحمل لفيروس نقص المناعة البشرية-1 الوقاية ومنع الحمل في المختبر 12-دراسات إضافية قد أثبتت جدوى EFs تقديم ما يلي: الإفراج عن جزيء صغير مضادات الفيروسات14، قوية ومرنة الخصائص الميكانيكية20، تسليم ثلاثي الأبعاد أبنية21 لفترات طويلة ، تثبيط من الحيوانات المنوية اختراق12، والقدرة على دمج مع سائر التكنولوجيات تسليم13. وأخيراً، تقييم الأعمال السابقة الألياف البوليمرية لإيصال المستدام للعوامل المضادة للفيروسات مكافحة الفيروسات كوينفيكتيفي المشتركة، هامبورغ-2 وفيروس نقص المناعة البشرية-114. في هذه الدراسة، تقدم الألياف البوليمرية نشاط مكمل لتقديم الأدوية المضادة للفيروسات بالإبقاء على الهيكل لمدة تصل إلى شهر واحد، وتوفير حاجز مادي لدخول الفيروسية. من هذه النتائج، فقد لوحظ أنه يمكن استخدام EFs جسديا وكيميائيا يحول دون الإصابة بعدوى الفيروس.

بينما جعل خصائص الإصدار الانضباطي EFs البوليمرية منصة تسليم جذابة للتسليم للجراثيم، وضعت EFs في تطبيقات أخرى لتكون بمثابة تعديل للسطح السقالات7. وقد استخدمت eFs لمحاكاة مورفولوجية المصفوفة خارج الخلية (ECM)، غالباً بوصفها السقالات تحسين التجدد الخلوية22، وزيادة فائدتها في الأنسجة الهندسة23،24. الألياف تتكون من البوليمرات مثل بولي-اليورو--كابرولاكتوني (PCL) وذات تم تعديل السطح مع عوامل النمو والبروتينات بعد اليكتروسبينينج نقل خصائص مثل إدارة المحتوى في المؤسسة بما في ذلك زيادة التصاق وانتشار الهاتف الخلوي25 , 26-وبالإضافة إلى ذلك، تم تقييمها EFs الميكروبات المعدلة السطح لمنع نمو البكتيريا المسببة للأمراض المحددة27،28. نظراً لهذا التنوع والقدرة على حمل الآثار البيولوجية، EF والتكنولوجيا لا يزال لتوسيع عبر مجموعة متنوعة من المجالات لتوفير وظائف ميكانيكية متعددة. حتى الآن، على الرغم من فائدتها في مجموعة متنوعة تطبيقات، إلا في الآونة الأخيرة تم استكشاف تعديل سطح الألياف في حقل الجراثيم29.

وقد وضعت بالتوازي مع تطوير تكنولوجيات تسليم جديدة لمنع وعلاج الأمراض المنقولة جنسياً، رواية العلاجات البيولوجية. أحد المرشحين للجراثيم الأكثر تبشيرا بالنجاح هو يكتين المضادة للفيروسات لاصقة، جرفت30. مستمد أصلاً من نوع من أنواع الطحالب الحمراء، جرفت أثبت النشاط كمثبط قوي لفيروس نقص المناعة البشرية، هامبورغ-2، والسارس، والتهاب الكبد الوبائي فيروس31،32،،من3334، 35 , 36-وفي الواقع، بين مثبطات المستندة إلى بيولوجيا، جرفت قد أقوى النشاط المضادة فيروس نقص المناعة البشرية، ويخمد فيروس نقص المناعة البشرية-1 على الفور تقريبا على اتصال30، مع الحفاظ على الاستقرار والنشاط حضور وسائل الإعلام ثقافة من المهبل الجراثيم لمدة تصل إلى 10 أيام37. في الآونة الأخيرة، أبدى جل جرفت 0.1% لحماية الفئران ضد مهبلي HSV-2 التحدي، مما يجعل من مرشح واعدة للسطر الأول من الحماية ضد كل من هامبورغ-2 وفيروس نقص المناعة البشرية-132, 38-"لفيروس نقص المناعة البشرية" على وجه التحديد، جرفت يمنع الإصابة جسديا ملزمة gp120 أو المحطة الطرفية من بقايا جليكان ن ربط يطلق على الأسطح الفيروسية المغلف لمنع دخول38،،من3940،41 ،42. هذا التثبيط قوية للغاية، مع s50IC تقترب من 3 نانوغرام/مليلتر43. بالإضافة إلى منع الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، بينت الدراسات أيضا أن يحمي جرفت HSV-2 العدوى عن طريق منع انتشار الفيروسات32خلية بخلية. وفي جميع الحالات، أظهرت جرفت لتكون مادة لاصقة للجسيمات الفيروسية، مع إظهار مقاومة عالية تمسخ. آخر، قد أثبتت جرفت نشاط تعاوني مع مزيج من التنفوفير (تفف) و مضادات الفيروسات الأخرى44، مما يجعل من الممكن والمحتمل مفيدة لإدارة التعاون مع EFs. خصائص قوية جرفت جعله بيولوجيا على الأدوية المضادة للفيروسات مرشح ممتاز، الذي قد تحسين الأداء مع التكنولوجيا EF.

الاستفادة من هذه المعرفة بخصائص مضادة للفيروسات لاصقة والفطرية جرفت، سقالة ألياف البوليمرية صمم، يجمع بين هذه الخصائص توفر الطبقة الأولى من دخول الفيروس تثبيط29. العثور على الإلهام في الطريق أن المخاط سيرفيكوفاجينال يعوق نقل الفيروس أساسا عن طريق التفاعلات الميوسين موكواديسيفي، افترضنا أن عن طريق استخدام EFs سقالة وتساهمي تعديل السطح مع جرفت، بكثافة عالية أن إضعاف جرفت سطح مترافق وإلغاء تنشيط الفيروس في46،،من45نقطة الإدخال في47. هنا وضعت سقالة ثابتة لتوفير أساس البروتين، والفيروسية، يخمد لاصقة حاجز منصة EFs. وسعينا إلى الجمع بين خصائص مضادة للفيروسات قوية جرفت مع منصة بوليمر متوافق حيويا وقابلة للتعديل، ودائم، لخلق فيروس رواية "فخ".

لتحقيق هذه الأهداف، كانت تتألف من بلجا ألياف اليكتروسبون، واستخدمت الكيمياء تنمية الصادرات--دائرة الصحة الوطنية في وقت لاحق تعديل السطح EF مع جرفت. بمثابة بلجا بوليمر نموذجي سبب استعماله واسعة النطاق في اليكتروسبينينج48، جنبا إلى جنب مع توافق مع الحياة والفعالية من حيث التكلفة. بالإضافة إلى ذلك، تعديل السطح يستغل مساحة كبيرة من EFs، وتوفر بديلاً مفيداً يمكن دمجها مع تغليف لتعظيم فائدة الألياف49. خلافا لأساليب التغليف التقليدية حيث جزء فقط من جرفت متوفر (ويقدم فقط عابر في معاهدة سجل الأفلام)، يمكن تعديل السطح جرفت الإبقاء على الحد الأقصى بيواكتيفيتي طوال مدة العلاج. وعلاوة على ذلك، قد يؤدي إدراج مركبات ماء مثل البروتينات، بالطرق التقليدية اليكتروسبينينج، أقل تغليف الكفاءة وفقدان البروتين نشاط50. ولذلك، جرفت تعديل سطح الألياف قد توفر أسلوب تسليم بديلة واعدة التي يمكن استخدامها منفردة أو مجتمعة مع اليكتروسبينينج لتعزيز الحماية ضد الإصابة بالأمراض المنقولة جنسياً.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1-إعداد وتصنيع "السقالة الألياف اليكتروسبون"

تنبيه: ينبغي إجراء جميع الأعمال بالمذيبات أو حلول البوليمر في غطاء الأبخرة كيميائية . الرجوع إلى ورقة بيانات السلامة المادية لكل كاشف قبل بدء تشغيل البروتوكول.

  1. إلى اليكتروسبين حل بوليمر 3 مل 15% w/w بلجا، تزن 720 ملغ من 50: 50 بولي (حمض اللبن-co-الجليكوليك) (بلجا؛ 0.55 إلى 0.75 dL/g, كاتشين 31-57) إلى 10 مل التﻷلؤ قنينة. حجم الحل يستند إلى حجم المجموعة النموذجية المستخدمة في الدراسات الحالية-
    ملاحظة: يجب احتساب كتلة البوليمر لإضافة إلى حجم معين من المذيب بأول تحديد كثافة المذيبات المستخدمة لإذابة البوليمر. كثافة المذيبات هيكسافلورو-2-بروبانول (هفيب) 1.59 غ/مل. وهكذا، وزن المذيب، استناداً إلى حجم 3.0 مل هفيب اللازمة، 4.8 ز (3.0 مل × 1.59 g/mL). لجزء 15% w/w من بلجا هفيب، يجب إضافة 720 ملغ بلجا إلى 3.0 مل هفيب (0.15 × 4,800 = 720 مجم بت). وميزة استخدام % w/w البوليمر/الحل، بدلاً من % w/v، أن يوفر هذا وزن محدد للحل النهائي. هذا الوزن محددة يمكن استبدال المذيبات أكثر دقة، في حالة تبخر المذيبات أثناء الخطوة 1.3.
    2. إضافة
  2. 3.0 مل هفيب إلى القنينة التﻷلؤ الزجاج الذي يتضمن بلجا (من الخطوة 1، 1) استخدام ماصة زجاجية مصلية. تغطي القنينة بغشاء بلاستيكي، ثم قياس وتسجيل القنينة ماساشوستس
  3. احتضان تعليق البوليمر بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية لضمان اكتمال انحلال البوليمر. إذا يتبخر أي مذيب، تتناقص كتلة قنينة، إضافة هفيب إلى القنينة يبلغ وزنها الأصلي في الخطوة 1.2.
  4. بعد الحضانة، إعداد الجهاز اليكتروسبينينج ( الشكل 2 أ). على الرغم من أن يمكن استخدام مغزل من أي حجم، مغزل فولاذ المقاوم للصدأ القطر الخارجي 25 مم الدورية استخدمت هنا كجامع.
    ملاحظة: إنقاص قطرها مغزل أكبر سمك الألياف، نظراً لحجم نفس الحل اليكتروسبينينج.
  5. نضح الحل البوليمر في محقن 3 مللي.
  6. توصيل طرف إبرة نصف بوصة 18-قياس، كليلة المحاقن والاستغناء عن الحل الزائدة (عادة 0.25 مل) لإزالة headspace فارغة في تلميح إبرة.
  7. مكان المحاقن على مضخة الحقن وضبط معدل تدفق صك لمل 2.0/ح.
    ملاحظة: هذا معدل التدفق كان سابقا الأمثل استناداً إلى اللزوجة البوليمر لصياغة هذا.
  8. الاتصال بمصدر الطاقة بإبرة المحقن واليكتروسبين الحل البوليمر باستخدام جهد من + 27 كيلو فولت. يجب تعيين المسافة بين الإبر وجامع لحوالي 25 سم ( الشكل 2 ب)-
    تنبيه: يقوم بعملية اليكتروسبينينج بخار المذيبات. استخدام غطاء دخان أو جهاز مغلقة ( الشكل 2) لإزالة البخار الضارة .
  9. مرة واحدة هو الحل الكامل اليكتروسبون، إيقاف تشغيل مصدر الطاقة وتسمح مغزل تدور 30 دقيقة إضافية الكامل تتبخر المذيبات.
  10. بدوره قبالة جامع مغزل الدورية، واستخدم شفرة حلاقة لقطع الألياف من مغزل. استخدام الشفرة لقشر الألياف من مغزل لطف.
  11. جمع الألياف بلجا اليكتروسبون إلى طبق بتري مسمى، ووضع في ديسيككاتوروفيرنيت لإزالة المذيبات المتبقية.

2. تعديل سطح الألياف مع جرفت

  1. تحضير حلول مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) 2-(ن-morpholino) وحمض اثانيسولفونيك (مس المخزن المؤقت). إعداد برنامج تلفزيوني بتذويب ز 8 كلوريد الصوديوم 0.2 ز بوكل، ز 1.44 غ 2 هبو 4 و 0.24 ز خ 2 ص 4 في 1 لتر الماء عالي النقاوة. وبالمثل، حل 19.52 ز مس (حمض الحرة، 195.2 ميغاواط) وز 29.22 كلوريد الصوديوم في 1 لتر الماء عالي النقاوة، إعداد مس المخزن المؤقت. ضمان درجة الحموضة النهائي من كل حل بين 7.2-7.5 و 5.0-6.0، على التوالي، باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني.
  2. إعداد الحلول العمل الفردية لتنمية الصادرات (2 مم) والمستشفيات (5 مم)-
    1. إزالة تنمية الصادرات والمستشفيات العامة من الثلاجة والسماح لهم بحجته إلى درجة حرارة الغرفة قبل وزنها.
    2. تزن 4 ملغ لتنمية الصادرات في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
    3. تزن 6 مغ من دائرة الصحة الوطنية في أنبوب ميكروسينتريفوجي أخرى.
      4. أضف 1 مل مس
    4. المخزن المؤقت لكل أنبوبة. دوامة أنابيب معا بنشاط لضمان الكواشف هي حلت تماما.
  3. تعد حلاً هيدروكسيلاميني التي تزن 70 ملغ في أنبوب الطرد مركزي مخروطية 50 مل.
  4. إضافة 20 مل برنامج تلفزيوني هيدروكسيلاميني ودوامه حل.
  5. الجماهيري بمبلغ مناسب من الألياف بلجا إلى أنبوب الطرد مركزي مخروطية 15 مل. نموذجياً، يتم استخدام 75 ملغ ألياف لكل دفعة رد فعل-
  6. إضافة 8 مل مس المخزن المؤقت إلى أنبوب 15 مل.
  7. إضافة 1 مل كل الحلول تنمية الصادرات والمستشفيات العامة أعدت في وقت سابق إلى الأنبوب. ينبغي أن يكون حجم الحل النهائي 10 مل. تركيزات نهائية لتنمية الصادرات ودائرة الصحة الوطنية ينبغي أن يكون 0.4 ملغ/مل و 0.6 ملغ/مل، على التوالي.
  8. إغلاق وختم أنبوب 15 مل مع الأفلام البلاستيكية والمكان المعني دوار للسماح بحل يكون مقلوب برفق لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ( الشكل 3 ب). هذه الخطوة تنشيط مجموعات الكربوكسيل في البوليمر تسمح بتعديل التساهمية مع البروتين جرفت ( الشكل 3 أ)-
  9. بعد عملية التنشيط، بعناية إخماد رد فعل عن طريق إضافة 14 ميليلتر من β-mercaptoethanol إلى الأنبوب. قلب الأنبوبة عدة مرات لضمان خلط كاملة-
    تنبيه: β-mercaptoethanol عالية السمية ويجب استخدامه فقط في غطاء الأبخرة كيميائية.
  10. تجاهل المادة طافية وشطف الألياف بلجا مرتين، مع 10 مل من برنامج تلفزيوني، لإزالة أي المتبقية β-ميركابتوثانول-
  11. بعد الشطف، إضافة مبلغ مناسب لحل الأسهم جرفت إلى الأنبوب. على سبيل المثال، يتطلب نمول 5 ملغ/جرفت الألياف ميليلتر 6.35 جرفت حل الأسهم (من أصل 10 ملغ/مل) كل ملغ ألياف. وبالتالي سيتطلب عينة ألياف 75 ملغ ميليلتر 476.25 10 ملغ/مل جرفت حل الأسهم.
    ملاحظة: الألياف جرفت مع أحمال النظرية من 0.05 و 0.5 و 5 نمول جرفت كل مغ الألياف كانت ملفقة.
  12. إضافة برنامج تلفزيوني ما يكفي لجعل وحدة التخزين النهائي لمل 8، إغلاق وعكس أنبوب لضمان خلط دقيق.
  13. ختم الأنبوب بغشاء بلاستيكي ووضع على دوار مرة أخرى، هذا الوقت حاء 2
    14. آرو
  14. بعد 2 ح الحاضنات، رد فعل بإضافة 2 مل من محلول هيدروكسيلاميني في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. كل إرشادات الشركة المصنعة، ينبغي أن يكون تركيز هيدروكسيلاميني النهائي أثناء عملية التفاعل التبريد 0.7 ملغ/مل.
  15. مزيج الحل جيد وتجاهل المادة طافية. شطف الألياف بلجا تعديل السطح مرتين مع 10 مل ماء عالي النقاوة لإزالة أي جرفت أونكونجوجاتيد.
  16. نقل الألياف إلى طبق بتري ومكان داخل مجفف حتى الألياف جافة تماما. نقل طبق بيتري إلى 4 درجة مئوية للتخزين.

3. SEM تعديل "توصيف سطح جرفت" ألياف

جبل
  1. مكان قطاع من الشريط الكربون على الوجهين في وزارة شؤون المرأة عينة. التسمية أسفل جبل العينة مع معلومات تعريف العينة باستخدام علامة دائمة-
  2. قص ثلاث عينات من الألياف تعديل سطح واحد ووضعها على عينة منفصلة يتصاعد. سمك كل عينة حوالي 0.5 ملم.
    3. معطف
  3. الرش العينات باستخدام ترسب الجسيمات الناجمة عن إلكترون من صفيحة الذهب. تفل معطف من 90 ثانية، في 2.4 كيلو فولت-
    ملاحظة: قد تختلف الوقت معطف الرش تبعاً لمعايير المعدات، بما في ذلك الجهد والتيار.
  4. صورة العينات في 8 كيلو فولت مع تكبير تتراوح من 000 1 إلى 5، 000 عاشرا-

4. استخراج جرفت من تعديل سطح ألياف

  1. الشامل من 2 مغ ألياف في ثلاث نسخ إلى أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
  2. إضافة 1 مل ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) إلى الأنبوبة، ثم دوامة واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإذابة الألياف تماما.
  3. بعد الحضانة، يضعف من قاسمة 10 ميليلتر من الحل [دمس]-الألياف من الخطوة 4-2، 100-fold على الأقل في تريس يدتا (TE) المخزن المؤقت (الرقم الهيدروجيني = 8.0).
  4. تخزين العينات في-20 درجة مئوية حتى تحميل توصيف مع أليسا-

5. قياس "الامتزاز جرفت" من ألياف

  1. لتقييم مقدار جرفت صدر أو ديسوربيد من الألياف، تزن 5-10 مغ بتعديل سطح الألياف ومكان في أنبوب ميكروسينتريفوجي. تسجيل كتلة الألياف في كل أنبوبة.
  2. إضافة 1 مل حل مناسب يحاكي البيئة الفسيولوجية (مثلاً، برنامج تلفزيوني، الشركة المصرية للاتصالات المخزن المؤقت، لمحاكاة السوائل المهبلية (التبرعات)، إلخ) لكل عينة.
  3. احتضان العينات ح 1 على شاكر الدورية 200 لفة في الدقيقة، 37 درجة مئوية.
  4. بعد أنابيب الحضانة، إزالة ما يقرب من 1 مل من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات التي تتضمن جرفت ديسوربيد من قنينة، وقاسمه للكتلة. مخزن في-20 درجة مئوية حتى الكمي البروتين.
  5. نقل العينة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة، وإضافة 1 مل من محلول العازلة الطازجة على الألياف داخل الأنبوب ميكروسينتريفوجي، واحتضان حتى النقطة المرة القادمة.
  6. تشمل النقاط الزمنية المعتادة المستخدمة لقياس الإصدار: 1، 2، 4، 6، 8، 24، 48، 72 wk. ح، و 1 الامتزاز ضئيلة وقد لوحظ في هذه الدراسات بعد حاء – 4

6. التحديد الكمي لاستخراج جرفت والامتزاز عبر أليسا

  1. معطف أليسا 96-جيدا لوحة مع 0.1 مل ها (10 ميكروغرام/مل) كل جيدا كما سبق وصف 51. ختم اللوحة مع الأفلام البلاستيكية واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية ( الشكل 4).
  2. إزالة المخزن المؤقت طلاء، وأضف 0.3 مل حجب المخزن المؤقت (2-3% البقري ألبومين المصل (BSA) في برنامج تلفزيوني مع 0.05% بوليسوربيت 20) لكل بئر. احتضان لوحة لمالا يقل عن 2 ح في درجة حرارة الغرفة-
  3. بعد الحضانة، شطف لوحة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1 x مع 0.1% بوليسوربيت 20 (برنامج تلفزيوني-P). بعد الشطف، الاستغناء عن 0.1 مل من عينة أو قياسي أو برنامج تلفزيوني كالمراقبة السلبية إلى الآبار الخاصة بكل منها. احتضان لوحة مرة أخرى ح 1 في درجة حرارة الغرفة-
  4. شطف لوحة 3 مرات مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني-ص وبعد الشطف، إضافة 0.1 مل جسم الأولية (الماعز جرفت مكافحة antiserum) في كل بئر واحتضانها لعلى الأقل 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. نموذجياً، هو تمييع الحل الأساسي جسم المضيفين في برنامج تلفزيوني.
  5. بعد حضانة العينات مع الشطف الابتدائي جسم اللوحات مرة أخرى 3 مرات مع برنامج تلفزيوني-ص إضافة 0.1 مل جسم الثانوي (الفجل البيروكسيديز (HRP)-الأرنب مترافق الماعز المضادة IgG) إلى كل خير واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة. الحل جسم الثانوي هو المخفف من المضيفين في برنامج تلفزيوني.
    6. أغسل
  6. اللوحة 3 مرات. إضافة 0.1 مل TMB 2-البيروكسيديز الركيزة لكل بئر. رصد التنمية اللون (حوالي 2 دقيقة)، ثم إضافة 0.1 مل ح 2 حتى 4 (1 ن) إخماد رد فعل. قراءة اللوحة في 450 نانومتر على قارئ لوحة.
  7. متوسط القيم OD الخلفية (الآبار التي لا يحصلون إلا على برنامج تلفزيوني)، وطرح هذا من المجموعات التجريبية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

مورفولوجيا الألياف له تأثير كبير على قدرة تعديل سطح EFs على توفير الحماية ضد الفيروسات. على الرغم من أن اليكتروسبينينج إجراء مناسب وواضحة، قد يؤدي تركيبات البوليمرات غير محسنة مورفولوجيا الألياف غير النظامية (الشكل 5ب-ج). غالباً ما تسبب تغييرات في...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

بسبب هياكلها المليئة بالثغرات والمساحات الكبيرة، وجدت EFs مجموعة متنوعة من التطبيقات في مجال الرعاية الصحية، ويتضمن أحد التي تخدم كوسائل إيصال العلاجية. المخدرات وعناصر فاعلة أخرى يمكن إدراجها ضمن EFs لإيصال الانضباطي، في حين يمكن أن يكون مترافق البيولوجي والكيميائي يغاندس على سطح الأليا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

ونحن ممتنون "صندوق التراث اليهودي" للتميز لتمويل هذه البحوث. ونحن نشكر الدكتور ستوارت وليامز الثاني لتوفير استعمال النظام اليكتروسبينينج بسخاء. كما نشكر الدكتور كينيث بالمر لتزويدنا جريفيثسين. بالإضافة إلى ذلك نحن نشكر الدكتور نوبويوكي ماتوبا ومختبرة لتدريب لنا في أليسا جرفت العمل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50LactelB6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP)Thermo Scientific 147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2Brico Medical SuppliesBN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tipVWR309657
Parafilm (plastic film)Sigma AldrichP7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer)Sigma AldrichM3671 
Sodium ChlorideSigma AldrichS7653
Potassium ChlorideSigma AldrichP9333
Sodium phosphate dibasicSigma AldrichS7907
Potassium phosphate monobasicSigma AldrichP0662
Hydroxysuccinimide (NHS)Thermo Scientific 24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC)Thermo Scientific 22980
2-MercaptoethanolFisherBP176
Griffithsin (GRFT)Kentucky BioprocessingNAcustom made, no product number
Dimethyl SulfoxideMilipore317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20)Sigma AldrichP9416 
Tris EDTA BufferSigma Aldrich93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well PlatesThermo Scientific 3355
Influenza Hemagglutinin (HA)Kentucky BioprocessingNAcustom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody)Kentucky BioprocessingNAcustom made, no product number
Rabbit anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody)Santa Cruz2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase SubstrateKPL52-00-00

References

  1. Gottlieb, S. L., et al. Toward global prevention of sexually transmitted infections (STIs): the need for STI vaccines. Vaccine. 32, 1527-1535 (2014).
  2. Fact sheet November 2016. , Available from: http://www.unaids.org/en/resources/fact-sheet (2016).
  3. Freeman, E. E., et al. Herpes simplex virus 2 infection increases HIV acquisition in men and women: systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. AIDS. 20, 73-83 (2006).
  4. Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
  5. Jiang, T., Carbone, E. J., Lo, K. W. H., Laurencin, C. T. Electrospinning of polymer nanofibers for tissue regeneration. Prog Polym Sci. 46, 1-24 (2015).
  6. Hu, X., et al. Electrospinning of polymeric nanofibers for drug delivery applications. J. Control. Release. 185, 12-21 (2014).
  7. Huang, Z. M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos Sci Technol. 63, 2223-2253 (2003).
  8. Son, Y. J., Kim, W. J., Yoo, H. S. Therapeutic applications of electrospun nanofibers for drug delivery systems. Arch. Pharmacal Res. 37, 69-78 (2014).
  9. Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
  10. Blakney, A. K., Ball, C., Krogstad, E. A., Woodrow, K. A. Electrospun fibers for vaginal anti-HIV drug delivery. Antiviral Res. 100, Suppl 9-16 (2013).
  11. Huang, C., et al. Electrospun cellulose acetate phthalate fibers for semen induced anti-HIV vaginal drug delivery. Biomaterials. 33, 962-969 (2012).
  12. Ball, C., Krogstad, E., Chaowanachan, T., Woodrow, K. A. Drug-eluting fibers for HIV-1 inhibition and contraception. PLoS One. 7, 49792(2012).
  13. Yohe, S. T., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. Superhydrophobic materials for tunable drug release: using displacement of air to control delivery rates. J. Am. Chem. Soc. 134, 2016-2019 (2012).
  14. Aniagyei, S. E., et al. Evaluation of poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(dl-lactide-co-epsilon-caprolactone) electrospun fibers for the treatment of HSV-2 infection. Mater. Sci. Eng. C Mater. Biol. Appl. 72, 238-251 (2017).
  15. Huang, C., et al. Electrospun polystyrene fibers for HIV entrapment. Polym. Advan. Technol. 25, 827-834 (2014).
  16. Carson, D., Jiang, Y., Woodrow, K. A. Tunable Release of Multiclass Anti-HIV Drugs that are Water-Soluble and Loaded at High Drug Content in Polyester Blended Electrospun Fibers. Pharm. Res. 33, 125-136 (2016).
  17. Chou, S. F., Carson, D., Woodrow, K. A. Current strategies for sustaining drug release from electrospun nanofibers. J. Control. Release. 220, 584-591 (2015).
  18. Ball, C., Woodrow, K. A. Electrospun solid dispersions of Maraviroc for rapid intravaginal preexposure prophylaxis of HIV. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 4855-4865 (2014).
  19. Blakney, A. K., Krogstad, E. A., Jiang, Y. H., Woodrow, K. A. Delivery of multipurpose prevention drug combinations from electrospun nanofibers using composite microarchitectures. Int. J. Nanomedicine. 9, 2967-2978 (2014).
  20. Li, C. M., Vepari, C., Jin, H. J., Kim, H. J., Kaplan, D. L. Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27, 3115-3124 (2006).
  21. Cai, S., Xu, H., Jiang, Q., Yang, Y. Novel 3D electrospun scaffolds with fibers oriented randomly and evenly in three dimensions to closely mimic the unique architectures of extracellular matrices in soft tissues: fabrication and mechanism study. Langmuir. 29, 2311-2318 (2013).
  22. Li, M. Y., et al. Electrospun protein fibers as matrices for tissue engineering. Biomaterials. 26, 5999-6008 (2005).
  23. Cui, W., Zhou, Y., Chang, J. Electrospun nanofibrous materials for tissue engineering and drug delivery. Sci. Technol. Adv. Mater. 11, 014108(2010).
  24. Zahedi, P., Rezaeian, I., Ranaei-Siadat, S. O., Jafari, S. H., Supaphol, P. A review on wound dressings with an emphasis on electrospun nanofibrous polymeric bandages. Polym. Advan. Technol. 21, 77-95 (2010).
  25. Vaidya, P., Grove, T., Edgar, K. J., Goldstein, A. S. Surface grafting of chitosan shell, polycaprolactone core fiber meshes to confer bioactivity. J Bioact Compat Pol. 30, 258-274 (2015).
  26. Rim, N. G., et al. Mussel-inspired surface modification of poly(L-lactide) electrospun fibers for modulation of osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Colloid Surface B. 91, 189-197 (2012).
  27. Yao, C., Li, X. S., Neoh, K. G., Shi, Z. L., Kang, E. T. Surface modification and antibacterial activity of electrospun polyurethane fibrous membranes with quaternary ammonium moieties. J Membrane Sci. 320, 259-267 (2008).
  28. Kangwansupamonkon, W., Tiewtrakoonwat, W., Supaphol, P., Kiatkamjornwong, S. Surface Modification of Electrospun Chitosan Nanofibrous Mats for Antibacterial Activity. J Appl Polym Sci. 131, (2014).
  29. Grooms, T. N., et al. Griffithsin-Modified Electrospun Fibers as a Delivery Scaffold To Prevent HIV Infection. Antimicrob. Agents Chemother. 60, 6518-6531 (2016).
  30. Emau, P., et al. Griffithsin, a potent HIV entry inhibitor, is an excellent candidate for anti-HIV microbicide. J. Med. Primatol. 36, 244-253 (2007).
  31. Meuleman, P., et al. Griffithsin has antiviral activity against hepatitis C virus. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 5159-5167 (2011).
  32. Nixon, B., et al. Griffithsin protects mice from genital herpes by preventing cell-to-cell spread. J. Virol. 87, 6257-6269 (2013).
  33. O'Keefe, B. R., et al. Broad-spectrum in vitro activity and in vivo efficacy of the antiviral protein griffithsin against emerging viruses of the family Coronaviridae. J. Virol. 84, 2511-2521 (2010).
  34. Ishag, H. Z., et al. Griffithsin inhibits Japanese encephalitis virus infection in vitro and in vivo. Arch. Virol. 158, 349-358 (2013).
  35. Ferir, G., et al. Combinations of griffithsin with other carbohydrate-binding agents demonstrate superior activity against HIV Type 1, HIV Type 2, and selected carbohydrate-binding agent-resistant HIV Type 1 strains. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 28, 1513-1523 (2012).
  36. Xue, J., et al. The Griffithsin Dimer Is Required for High-Potency Inhibition of HIV-1: Evidence for Manipulation of the Structure of gp120 as Part of the Griffithsin Dimer Mechanism. Antimicrob Agents Ch. 57, 3976-3989 (2013).
  37. Kouokam, J. C., et al. Investigation of griffithsin's interactions with human cells confirms its outstanding safety and efficacy profile as a microbicide candidate. PLoS One. 6, 22635(2011).
  38. Moulaei, T., et al. Monomerization of viral entry inhibitor griffithsin elucidates the relationship between multivalent binding to carbohydrates and anti-HIV activity. Structure. 18, 1104-1115 (2010).
  39. Barton, C., et al. Activity of and effect of subcutaneous treatment with the broad-spectrum antiviral lectin griffithsin in two laboratory rodent models. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 120-127 (2014).
  40. Mori, T., et al. Isolation and characterization of griffithsin, a novel HIV-inactivating protein, from the red alga Griffithsia sp. J. Biol. Chem. 280, 9345-9353 (2005).
  41. Ziolkowska, N. E., et al. Domain-swapped structure of the potent antiviral protein griffithsin and its mode of carbohydrate binding. Structure. 14, 1127-1135 (2006).
  42. Ziolkowska, N. E., et al. Crystallographic, thermodynamic, and molecular modeling studies of the mode of binding of oligosaccharides to the potent antiviral protein griffithsin. Proteins. 67, 661-670 (2007).
  43. O'Keefe, B. R., et al. Scaleable manufacture of HIV-1 entry inhibitor griffithsin and validation of its safety and efficacy as a topical microbicide component. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 6099-6104 (2009).
  44. Ferir, G., Palmer, K. E., Schols, D. Synergistic activity profile of griffithsin in combination with tenofovir, maraviroc and enfuvirtide against HIV-1 clade C. Virology. 417, 253-258 (2011).
  45. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hanes, J. Mucus-penetrating nanoparticles for drug and gene delivery to mucosal tissues. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 158-171 (2009).
  46. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hida, K., Cone, R., Hanes, J. Nanoparticles reveal that human cervicovaginal mucus is riddled with pores larger than viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 598-603 (2010).
  47. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Wirtz, D., Hanes, J. Micro- and macrorheology of mucus. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 86-100 (2009).
  48. Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An Overview of Poly(lactic-co-glycolic) Acid (PLGA)-Based Biomaterials for Bone Tissue Engineering. Int J Mol Sci. 15, 3640-3659 (2014).
  49. Repanas, A., Andriopoulou, S., Glasmacher, B. The significance of electrospinning as a method to create fibrous scaffolds for biomedical engineering and drug delivery applications. J Drug Deliv Sci Tec. 31, 137-146 (2016).
  50. Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 1033-1042 (2009).
  51. Barton, C., Kouokam, J. C., Hurst, H., Palmer, K. E. Pharmacokinetics of the Antiviral Lectin Griffithsin Administered by Different Routes Indicates Multiple Potential Uses. Viruses. 8, (2016).
  52. Sawicka, K., Gouma, P., Simon, S. Electrospun biocomposite nanofibers for urea biosensing. Sensor Actuat B-Chem. 108, 585-588 (2005).
  53. Ramakrishna, S., et al. Electrospun nanofibers: solving global issues. Mater Today. 9, 40-50 (2006).
  54. Liu, X., et al. Electrospinnability of Poly Lactic-co-glycolic Acid (PLGA): the Role of Solvent Type and Solvent Composition. Pharm. Res. 34, 738-749 (2017).
  55. Bhardwaj, N., Kundu, S. C. Electrospinning: A fascinating fiber fabrication technique. Biotechnol Adv. 28, 325-347 (2010).
  56. Fong, H., Chun, I., Reneker, D. H. Beaded nanofibers formed during electrospinning. Polymer. 40, 4585-4592 (1999).
  57. Zong, X. H., et al. Structure and process relationship of electrospun bioabsorbable nanofiber membranes. Polymer. 43, 4403-4412 (2002).
  58. Rodoplu, D., Mutlu, M. Effects of Electrospinning Setup and Process Parameters on Nanofiber Morphology Intended for the Modification of Quartz Crystal Microbalance Surfaces. J Eng Fiber Fabr. 7, 118-123 (2012).
  59. Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-Length Crosslinking Procedure with the Use of Active Esters. Anal Biochem. 185, 131-135 (1990).
  60. Staros, J. V., Wright, R. W., Swingle, D. M. Enhancement by N-Hydroxysulfosuccinimide of Water-Soluble Carbodiimide-Mediated Coupling Reactions. Anal Biochem. 156, 220-222 (1986).
  61. Tan, S. H., Inai, R., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer. 46, 6128-6134 (2005).
  62. Spasova, M., Stoilova, O., Manolova, N., Rashkov, I., Altankov, G. Preparation of PLLA/PEG Nanofibers by Electrospinning and Potential Applications. J Bioact Compat Pol. 22, 62-76 (2007).
  63. Boland, E. D., et al. Electrospinning polydioxanone for biomedical applications. Acta Biomater. 1, 115-123 (2005).
  64. Senecal, A., Magnone, J., Marek, P., Senecal, K. Development of functional nanofibrous membrane assemblies towards biological sensing. React Funct Polym. 68, 1429-1434 (2008).
  65. Zhang, Y. Z., Venugopal, J., Huang, Z. M., Lim, C. T., Ramakrishna, S. Characterization of the surface biocompatibility of the electrospun PCL-collagen nanofibers using fibroblasts. Biomacromolecules. 6, 2583-2589 (2005).
  66. Gupta, D., Venugopal, J., Mitra, S., Giri Dev, V. R., Ramakrishna, S. Nanostructured biocomposite substrates by electrospinning and electrospraying for the mineralization of osteoblasts. Biomaterials. 30, 2085-2094 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

128 co

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved