JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تنظيم متعدية الجنسيات دوراً هاما في السيطرة على وفرة البروتين. هنا، يمكننا وصف أسلوب الفائق للتحليل الكمي للترجمة في مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

ترجمة مرناً إلى البروتينات عملية معقدة تنطوي على عدة طبقات من اللائحة. كثيرا ما يفترض أن تعكس التغييرات في النسخ مرناً التغييرات في تخليق البروتين، ولكن الكثير من الاستثناءات قد لوحظت. في الآونة الأخيرة، برزت تقنية تسمى الريبوسوم التنميط (أو Seq ريبو) كطريقة قوية تتيح تحديد الهوية، مع درجة عالية من الدقة، أي مناطق مرناً يتم ترجمتها إلى بروتينات والتحديد الكمي للترجمة على مستوى المنظومة الجينوم. نقدم هنا، بروتوكول معممة على نطاق الجينوم التقدير الكمي للترجمة باستخدام Seq ريبو في مهدها الخميرة. وباﻹضافة إلى ذلك، الجمع بين البيانات ريبو-Seq مع قياسات الوفرة مرناً يسمح لنا بقياس كفاءة الترجمة الآلاف من النصوص مرناً في نفس العينة في وقت واحد، ومقارنة التغيرات في هذه المعلمات في الاستجابة إلى تجريبية التلاعب أو في حالات فسيولوجية مختلفة. يصف لنا بروتوكول مفصل لجيل أقدام الريبوسوم باستخدام نوكلاس الهضم، عزل مجمعات البصمة الريبوسوم سليمة عن طريق تجزئة السكروز التدرج، وإعداد مكتبات الحمض النووي لتسلسل العميقة جنبا إلى جنب مع المناسبة نوعية الضوابط اللازمة لضمان دقة التحليل في فيفو الترجمة.

Introduction

الترجمة مرناً هو إحدى العمليات الأساسية في الخلية، والتي تلعب دوراً هاما في تنظيم التعبير البروتين. ولذلك، الترجمة مرناً مراقبة شديدة واستجابة لمختلف المحفزات الفسيولوجية الداخلية والخارجية 1،2. ومع ذلك، تظل آليات التنظيم متعدية المداريين. هنا، نحن تصف البروتوكول للتحديد الكمي للترجمة في مهدها الخميرة على نطاق الجينوم بالتنميط الريبوسوم. والهدف العام لأسلوب التنميط الريبوسوم هو دراسة وتحديد مقدار ترجمة مرناس محددة تحت ظروف مختلفة الخلوية. هذا الأسلوب يستخدم التسلسل الجيل القادم لتحليل كمي شغل الريبوسوم في جميع أنحاء الجينوم ويتيح رصد معدل البروتين التوليف في فيفو كودون واحد القرار 3،4. حاليا، هذا الأسلوب يوفر الوسائل الأكثر تقدما لقياس مستويات البروتين الترجمة، وقد ثبت أن تكون أداة اكتشاف مفيدة توفر معلومات يمكن الكشف عنها بغيرها من التقنيات المتوفرة حاليا، مثل [ميكروارس] أو ترجمة الدولة مصفوفة تحليل (تسا) 5. الريبوسوم التنميط تقارير عن التغيرات مجتمعة في مستويات النص والإخراج متعدية الجنسيات، كما أنه يوفر الكثير من حساسية أكبر مقارنة بالأساليب الأخرى.

يقوم هذا النهج على تسلسل العميقة المحمية الريبوسوم مرناً شظايا 3. أثناء ترجمة البروتين، حماية ريبوسوم ~ 28 nt أجزاء من مرناً (تسمى أقدام) 6. قبل تحديد تسلسل أجزاء محمية الريبوسوم، يمكن تعيين موضع ريبوسوم في مرناً المترجمة Seq ريبو وتحديد المناطق التي من مرناً يرجح أن تترجم بنشاط البروتين 3،7. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن نقيس الكمية ترجمة مرناً بإحصاء عدد المسارات التي تتوافق مع نسخة مرناً معين.

بغية عزل الأجزاء المحمية الريبوسوم، تعامل ليساتيس خلية في البداية مع مثبط ترجمة إلى المماطلة ريبوسوم تليها الهضم ريبونوكليسي. بينما هي أفسدتها الحرة مرناً وأجزاء من مرناس المترجمة التي لا تحميها ريبوسوم ribonuclease، يمكن استرداد الشظايا مرناً محمية الريبوسوم بتنقية مجمعات البصمة الريبوسوم سليمة. هذه آثار أقدام مرناً ثم تحويلها إلى مكتبة كدنا وتحليلها بواسطة تسلسل العميق (الشكل 1). وبالتوازي مع الريبوسوم التنميط، المستخرجة من نفس العينة سليمة مرناً ومتسلسلة. بمقارنة مستوى الترجمة التي حددها ريبو-Seq مع قياسات الوفرة مرناً، يمكننا تحديد الجينات التي هي على وجه التحديد أعلى أو أسفل-التنظيم على مستوى الترجمة وحساب كفاءة الترجمة مرناً على مستوى المنظومة الجينوم. بينما البروتوكول الموصوفة في هذه المقالة محددة للخميرة، ينبغي أيضا مفيدة للباحثين الذين سيحاولون وضع البروتوكول ريبو-Seq في النظم الأخرى.

Protocol

1-استخراج إعداد

  1. الانتصارات سلالات الخميرة من الأرصدة المجمدة للمستعمرات واحدة في لوحات YPD (استخراج الخميرة 1%، ببتون 2% والجلوكوز 2% واجار 2%). احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمدة يومين.
  2. تطعيم الخميرة من لوحة YPD (استخدام مستعمرة واحدة) إلى 15 مل متوسطة YPD (استخراج الخميرة 1%، ببتون 2%، 2% جلوكوز) في أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي وتنمو بين عشية وضحاها بالهز (200-250 لفة في الدقيقة) في 30 درجة مئوية.
  3. تمييع الثقافة إلى 500 مل متوسطة YPD في ل 2 قارورة معقمة، حيث أن التطوير التنظيمي600 < 0.1. تنمو خلايا الخميرة مع تهتز عند 30 درجة مئوية ح 3-5 حتى OD600 = 0.5 (سجل منتصف المرحلة).
  4. جمع الخلايا بعملية التصفية من خلال 0.45 ميكرومتر غشاء مرشحات استخدام تجمع تصفية حامل زجاج. كشط بيليه مع ملعقة، فلاش التجميد في النيتروجين السائل، وتخزينها في-80 درجة مئوية. الحجم المتوقع لبيليه المجمدة ~ 0.2-0.5 ز.
    تنبيه: النتروجين السائل درجة حرارة منخفضة للغاية؛ ملابس الحماية المناسبة.
  5. إعداد "المخزن المؤقت تحلل" الطازجة (140 ملم بوكل، 5 ملم مجكل2، 100 ميكروغرام/مل سيكلوهيكسيميدي، 0.5 مم DTT، 1% 20 مم تريس-HCl pH 8.0، Triton X-100) مباشرة قبل الاستخدام، الحفاظ على الجليد.
  6. وضع الخرز الصلب الكروم 3 (3.2 ملم) في أنبوب فولاذ المقاوم للصدأ 1.8 مل. قبل البرد في النتروجين السائل وإضافة الكريات المجمدة، وتغطي بغطاء مطاط سيليكون. مجانسة العينة قبل كريوجريندينج ل 10 s عند 4200 دورة في الدقيقة؛ كرر 10 مرات. البرد الأنبوبة في النيتروجين السائل لمالا يقل عن 10 ق بين كل جولة.
    ملاحظة: من المهم أن تبقى دائماً العينة المجمدة.
  7. أضف 1 مل من "المخزن المؤقت لتحلل"، ومزيج جيد من قبل بيبيتينج. نقل إلى أنبوب 1.5 مل جديدة.
  8. أجهزة الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. بينما كان يعمل على الجليد، نقل المادة طافية في أنبوب 1.5 مل جديدة. نقل 100 ميكروليتر من ليستي إلى أنبوب 1.5 مل جديد لعزل مرناً poly(A). الشروع فورا في عزل الحمض النووي الريبي أو تجميد فلاش الأنبوبة في النيتروجين السائل. قياس OD260 من بقية، التي سيتم استخدامها لاستخراج البصمة، وفلاش تجميد الأنابيب في نيتروجين سائل. تخزين ليساتيس في-80 درجة مئوية.

2-البصمة استخراج

  1. إعداد التدرجات السكروز
    1. إعداد حلول لنسبة 50%، 40%، 30%، 20%، والسكروز 10% في "المخزن المؤقت للتدرج" (20 مم تريس-HCl pH 8.0، 140 ملم بوكل، 5 مم مجكل2، 100 ميكروغرام/مل سيكلوهيكسيميدي، 0.5 مم DTT).
    2. "الماصة؛" مل 2.2 العازلة السكروز 50% مستعدة للجزء السفلي من أنبوب بوليالومير 13.2 مل رقيقة الجدار وتجميد الحل لمدة 10 دقائق في-80 درجة مئوية (الشكل 2). ثم طبقة مل 2.2 من المخزن المؤقت السكروز 40% على رأس المخزن المؤقت السكروز 50% المجمدة، وتجميد لمدة 10 دقائق في-80 درجة مئوية. في أعقاب نفس التعليمات، السكروز طبقة 30%، ثم نسبة 20 في المائة، وأخيراً 10% المخازن فوق بعضها البعض. تجنب الوقوع في فقاعات الهواء بينما طبقات. الاحتفاظ التدرجات في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام. ينبغي إعداد يوم واحد على الأقل قبل التجربة التدرجات السكروز وتخزينها في-80 درجة مئوية.
  2. الهضم نوكلاس
    1. ذوبان الجليد التدرجات السكروز في الليلة التي سبقت التجارب عند 4 درجة مئوية.
    2. ذوبان الجليد خلية ليستي (بصمة عينة) على الجليد. نقل قاسمة للخلية التي تحتوي على 50 وحدة260 OD إلى أنبوب 1.5 مل جديدة وإضافة جديدة "تحلل العازلة" تصل إلى 1 مل. تخزين المتبقي في-80 درجة مئوية. إضافة 10 ميكروليتر رناسي أنا (100 يو/ميكروليتر) واحتضان ح 1 في درجة حرارة الغرفة مع تناوب لطيف على المدورة الرأس-أكثر-الكعب.
    3. (اختياري) توضيح العينات من 20,000 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية واسترجاع المادة طافية في أنبوب 1.5 مل جديدة.
  3. تنبيذ فائق
    1. بلطف طبقة عينات ليستي إلى الأعلى من التدرج السكروز 10-50%.
    2. أنابيب أولتراسينتريفوجي بوليالومير في 210,000 س ز (35,000 لفة في الدقيقة) في 4 درجات مئوية عن 3 ح "تي" ف-41 دوار باستخدام.
  4. إنشاء نظام تجزئة التدرج
    1. تشغيل المكونات والسماح لرصد الأشعة فوق البنفسجية للاحماء لمدة 30 دقيقة على الأقل.
    2. في حالة استخدام برنامج مسجل رقمي، بدء تشغيل البرنامج على الكمبيوتر، تعيين حدود تحجيم الرسم البياني إلى-0.01 و 1.
    3. ملء المحاقن مع "تشيس الحل" (20 ملم تريس-HCl pH 8.0، 140 ملم بوكل، 5 ملم مجكل2، السكروز 60 في المائة)، وإزالة أي فقاعات الهواء داخل محقن وقنية.
    4. تركيب أنبوب ultracentrifuge مليئة بالمياه خالية من رناسي. بيرس الأنبوب مع القنية حتى يمكن رؤية علامات سوداء اثنين. بدء ضخ حقنه في 1 مل/دقيقة.
    5. كما يمر الماء من خلال تدفق الخلية، اضغط الزر "السيارات الصفر" على رصد الأشعة فوق البنفسجية لضبط خط الأساس إلى 0. تعيين الحساسية لرصد الأشعة فوق البنفسجية إلى "2.0 الاتحاد الأفريقي". بعد أن تم إنشاء خط أساس مستقر، وقف ضخ حقنه. استرداد "الحل تشيس" وإزالة أنبوب أولتراسينتريفوجي.
  5. عزل مونوسومي
    1. تثبيت وبيرس ultracentrifuge الأنبوبة المحتوية على التدرج السكروز. بدء ضخ حقنه في 1 مل/دقيقة، وجمع الكسور 1 مل مراقبة قيم254 . تجمع الكسور تمثل ذروة مونوسومي 80S في أنبوب واحد، والحفاظ على الجليد (الشكل 3).
    2. بمجرد "حل تشيس" يصل إلى الخلية تدفق، وقف ضخ حقنه. استرداد "الحل تشيس" وإزالة أنبوب أولتراسينتريفوجي. كرر تجزئة لبقية العينات بدءاً من الخطوة 2.5.1.
      ملاحظة: عند الانتهاء من تنظيف نظام تجزئة مع مالا يقل عن 30 مل من المياه خالية من رناسي. دقة غسل الأنابيب والمحاقن وكافة المكونات القابلة للإزالة بالماء الدافئ.
    3. تصفية الكسور من خلال مرشحات الطرد المركزي 0.5 مل (100 كاتشين موكو) في 12,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية وتجاهل في التدفق من خلال، وكرر حتى يتم تخزين < 100 ميكروليتر. إضافة 400 ميكروليتر من "الإصدار المخزن المؤقت" (20 مم تريس-HCl pH 7.0، 2 مم يدتا، مثبط رناسي U/mL 40). مزيج من بيبيتينج، تبني على الجليد 10 دقيقة ونقل الوحدة إلى أنبوب جمع جديدة. الطرد المركزي في س 12,000 ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية، وجمع في التدفق من خلال.
  6. تنقية يفتت البصمة
    1. نقل من خلال تدفق تحتوي على بصمة الحمض النووي الريبي الشظايا أنبوب مل 1.5 جديدة، وإضافة 20 ميكروليتر من 20% الحزب الديمقراطي الصربي (إلى تركيز نهائي من 1%)، مزيج من بيبيتينج.
    2. إضافة إلى حجم 1 حمض-الفينول: كلوروفورم (pH 4.5)، ودوامه لمدة 10 ق.
      تنبيه: حمض-الفينول: كلوروفورم السامة، وتجنب ملامسة الجلد والاستنشاق.
    3. الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وضع على الجليد للحد الأدنى 1 أجهزة الطرد المركزي العينة في س 12,000 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ونقل المرحلة المائية (أعلى) إلى أنبوب 1.5 مل جديدة.
    4. يعجل ببصمة الحمض النووي الريبي الشظايا بإضافة المجلد 1/10 من نواك (pH 5.5)، المجلد 1/100 من الجليكوجين (10 مغ/مل)، ووحدات تخزين 2.5 من الإيثانول 100%.
احتضان في-20 درجة مئوية على الأقل ح 1.

3-Poly(A) مرناً الاستخراج

  1. مجموع استخراج الحمض النووي الريبي
    1. ذوبان الجليد قاسمة 100 ميكروليتر من الخلية ليساتي (الرنا مجموع العينة) على الجليد، وإضافة 300 ميكروليتر من عيار 20 ملم تريس-HCl pH 7.0 و 20 ميكروليتر من 20% الحزب الديمقراطي الصربي (إلى تركيز نهائي من 1%)، مزيج من بيبيتينج.
    2. إضافة إلى حجم 1 (400 ميكروليتر) حمض-الفينول: كلوروفورم (pH 4.5) ودوامه لمدة 10 ق.
    3. الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وضع على الجليد للحد الأدنى 1 أجهزة الطرد المركزي العينة في س 12,000 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ونقل المرحلة المائية (أعلى) إلى أنبوب 1.5 مل جديدة.
    4. القيام استخراج فينول ثانية. إضافة إلى حجم 1 حمض-الفينول: كلوروفورم (4.5 درجة الحموضة)، دوامة للحرارة 10 س. عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وضعت على الجليد للحد الأدنى 1 أجهزة الطرد المركزي العينة في س 12,000 ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ونقل المرحلة المائية إلى أنبوب 1.5 مل جديدة.
    5. يعجل بالجيش الملكي النيبالي. هذا إضافة إلى حجم 1/10 من 3 م نواك (pH 5.5)، المجلد 1/100 من الجليكوجين (10 مغ/مل)، ووحدات تخزين 2.5 من الإيثانول 100%. احتضان في-20 درجة مئوية على الأقل ح 1.
  2. Poly(A) مرناً العزلة
    1. الطرد المركزي عينات الحمض النووي الريبي في العاشر 20,000 ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة الإيثانول. زيادة ونقصان لأسفل 30 s بأقصى سرعة، إزالة بقية الإيثانول مع تلميح جل في التحميل، والهواء الجاف بيليه لمدة 5 دقائق.
    2. حل بيليه في 300 ميكروليتر من المخزن المؤقت لتحلل/ملزمة من عدة عزل مرناً poly(A). نشرع في استخراج مرناً poly(A) وفقا لبروتوكول poly(A) مرناً العزلة طقم الخاص بالشركة المصنعة.
    3. يعجل بالعينات مرناً بإضافة المجلد 1/10 من 3 م نواك (pH 5.5)، المجلد 1/100 من الجليكوجين (10 مغ/مل)، ووحدات تخزين 2.5 من الإيثانول 100%. احتضان في-20 درجة مئوية على الأقل ح 1.
  3. تجزئة مرناً
    1. الطرد المركزي في نماذج مرناً في العاشر 20,000 ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة الإيثانول. زيادة ونقصان لأسفل 30 ثانية، وإزالة بقية الإيثانول مع هلام-تحميل تلميح، والهواء الجاف بيليه لمدة 5 دقائق.
    2. ريسوسبيند مرناً في ميكروليتر 18 من المياه خالية من رناسي، إضافة 2 ميكروليتر من 10 × الجيش الملكي النيبالي تجزئة المخزن المؤقت. احتضان 5 دقيقة في 94° C. نقل أنبوب للجليد.
    3. يعجل بإضافة المجلد 1/10 من 3 م نواك (pH 5.5)، المجلد 1/100 من الجليكوجين (10 مغ/مل)، ووحدات تخزين 2.5 من الإيثانول 100%. احتضان في-20 درجة مئوية على الأقل ح 1.

4-ديفوسفوريليشن

  1. علاج البصمة وعينات مرناً مجزأة مع T4 بولينوكليوتيدي كيناز. ولهذا الغرض، الطرد المركزي العينات من 20,000 x ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة الإيثانول. زيادة ونقصان لأسفل 30 s بأقصى سرعة، إزالة بقية الإيثانول مع هلام تحميل تلميح. الهواء الجاف بيليه لمدة 5 دقائق.
  2. ريسوسبيند بيليه في 7.75 ميليلتر من الماء، إضافة 1 ميليلتر كيناز المخزن المؤقت بولينوكليوتيدي x T4 10، 1 ميليلتر من T4 بولينوكليوتيدي كيناز (10,000 U/mL)، وميليلتر 0.25 من رناسي المانع (يو 20/ميليلتر). احتضان ح 1 في 37 درجة مئوية.
  3. (اختياري) قبل تشغيل هلام يوريا TBE 15% على 180 الخامس لمدة 15 دقيقة باستخدام المخزن المؤقت x TBE 1.
  4. إضافة 10 ميليلتر من 2 × اليوريا TBE عينة المخزن المؤقت إلى 10 ميليلتر من كل عينة البصمة ومرناً. إعداد عينة عنصر تحكم يحتوي على 1 ميليلتر من 10 ميكرون حجم العلوي علامة اليغنوكليوتيد (32 nt)، 1 ميليلتر من 10 ميكرون انخفاض حجم اليغنوكليوتيد ماركر (28 nt)، 8 ميليلتر المياه، و 10 ميليلتر من 2 × اليوريا TBE العازلة عينة لعينات البصمة. إعداد عينة عنصر تحكم يحتوي على 1 ميليلتر من 10 ميكرون رنا اليغنوكليوتيد ماركر (63 nt)، 9 ميليلتر المياه، و 10 ميليلتر من 2 × اليوريا TBE العازلة عينة لعينات مرناً.
  5. احتضان عينات وضوابط دقيقة 3 في 75 درجة مئوية، تدور إلى أسفل، ووضعت على الجليد للحد الأدنى 1 تحميل كل عينة في الآبار 2 جل اليوريا TBE 15%، أجزاء منفصلة من الجيش الملكي النيبالي بالتفريد جل في 180 الخامس ح 1.
  6. وصمة عار للهلام لمدة 5 دقائق مع وصمة عار جل حمض النووي (س 10,000 مخفف بالمياه)، وحماية من الضوء.
  7. استخدام ترانسيلوميناتور ضوء أزرق، قطع الفرقة السليم بين 28 و 32 من علامات nt لعينات البصمة (الشكل 4A) وحوالي 50-70 nt مرناً عينات (الشكل 4) مع شفرة حلاقة نظيفة. تجميد القطع polyacrylamide هلام في-80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على الأقل.
  8. استخراج الحمض النووي الريبي من هلام بولياكريلاميدي كما يلي. حرارة قطع جل على 70 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، وطحن الجل باستخدام المدقات بيليه المتاح. الوتي الجيش الملكي النيبالي مع 300 ميليلتر شطف العازلة (20 مم تريس-HCl pH 7.0، 2 مم يدتا) وإضافة 1 ميليلتر رناسي المانع (يو 20/ميليلتر)، واحتضان في 37 درجة مئوية ح 3.
  9. الطرد المركزي العينة في 12,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وجمع المادة طافية، ويعجل بإضافة المجلد 1/10 من ناواك (pH 5.5)، بحجم 1/100 من الجليكوجين (10 مغ/مل)، ووحدات تخزين 2.5 من الإيثانول 100%. احتضان في-20 درجة مئوية على الأقل ح 1.

5-3-محول ربط

  1. الطرد المركزي عينات البصمة ومرناً في العاشر 20,000 ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة الإيثانول. زيادة ونقصان لأسفل 30 s بأقصى سرعة، إزالة بقية الإيثانول مع تلميح جل في التحميل. الهواء الجاف بيليه لمدة 10 دقائق.
  2. ريسوسبيند بيليه في ميليلتر 4.75 المياه خالية من نوكلاس، 2 ميليلتر من 50% PEG8000، 1 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي T4 X 10 ليجاسى المخزن المؤقت، 1 ميليلتر من 3 '--محول (100 نانوغرام/ميليلتر)، ميليلتر 0.25 من رناسي المانع (يو 20/ميليلتر)، 1 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي T4 ليجاسى 2 اقتطاع خمس (200,000 U/mL). تبني بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية.
  3. في صباح اليوم التالي، إزالة فائض المحول بإضافة 0.5 ميليلتر من 5 '--ديادينيلاسي (يو 10/ميليلتر) و 0.5 ميليلتر من"تفصيل ي" [ااكسونوكلس] (يو 10/ميليلتر) إلى رد فعل ربط مباشرة. احتضان لمدة 30 دقيقة في 30 درجة مئوية.
  4. يعجل بالعينات. لهذا، أضف 30 ميليلتر من المياه خالية من نوكلياسي، 1 ميليلتر الجليكوجين (10 مغ/مل)، المجلد 1/10 من ناواك (pH 5.5)، وحجم 2.5 من الإيثانول 100%. احتضان في-20 درجة مئوية على الأقل ح 1.

6-عكس النسخ

  1. الطرد المركزي في العينات من 20,000 x ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة الإيثانول. زيادة ونقصان لأسفل 30 s بأقصى سرعة، إزالة بقية الإيثانول مع تلميح جل في التحميل. الهواء الجاف بيليه لمدة 10 دقائق.
  2. ريسوسبيند بيليه في ميليلتر 11.5 المياه خالية من نوكلاس، إضافة 0.5 ميليلتر من 8 ميكرومتر النسخ العكسي التمهيدي (RT التمهيدي) و 1 ميليلتر من دنتب ميكس (10 مم). احتضان لمدة 5 دقائق عند 65 درجة مئوية، ومكان على الجليد.
  3. إضافة 4 ميليلتر من 5 × أول حبلا العازلة، 2 ميليلتر من 0.1 م DTT، 0.5 ميليلتر من رناسي المانع (يو 20/ميليلتر)، 0.5 ميليلتر من المنتسخة العكسية (200 يو/ميليلتر). احتضان لمدة 30 دقيقة عند 48 درجة مئوية، 1 دقيقة في 65 درجة مئوية، 5 دقيقة عند 80 درجة مئوية.
  4. لا يعجل والشروع فورا التحلل من الجيش الملكي النيبالي، بإضافة ميليلتر 0.8 من هيدروكسيد الصوديوم م 2، احتضان 30 دقيقة عند 98 درجة مئوية. إضافة ميليلتر 0.8 م 2 HCl لتحييد رد فعل.
  5. يعجل بالعينات.
لهذا، أضف 20 ميليلتر من المياه خالية من نوكلياسي، 1 ميليلتر الجليكوجين (10 مغ/مل)، المجلد 1/10 من ناواك (pH 5.5)، وحجم 2.5 من الإيثانول 100%. احتضان في-20 درجة مئوية على الأقل ح 1.
  • الطرد المركزي في العينات من 20,000 x ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة الإيثانول. زيادة ونقصان لأسفل 30 s بأقصى سرعة، إزالة بقية الإيثانول مع تلميح جل في التحميل. الهواء الجاف بيليه لمدة 10 دقائق.
  • ريسوسبيند بيليه في 5 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس، إضافة 5 ميليلتر من 2 × اليوريا TBE العازلة عينة. احتضان 3 دقيقة عند 75 درجة مئوية، تدور إلى أسفل، ووضعت على الجليد لمدة 1 دقيقة.
  • (اختياري) قبل تشغيل هلام TBE-يوريا 10% على 180 الخامس لمدة 15 دقيقة باستخدام 1 X TBE العازلة.
  • تحميل العينة في 1 جيدا من جل TBE-اليوريا 10%. فصل المنتجات من رد فعل عكسي النسخ بالتفريد جل في 180 الخامس لمدة 50 دقيقة. كعنصر تحكم، إعداد عينة تحتوي على 1 ميليلتر من 2.5 ميكرون RT التمهيدي، 1 ميليلتر من 2.5 ميكرون 128 nt علامة اليغنوكليوتيد، 3 ميليلتر المياه، و 5 ميليلتر TBE X 2-اليوريا العينة المخزن المؤقت، وتشغيل على ممر منفصل من الجل.
  • وصمة عار للهلام لمدة 5 دقائق مع وصمة عار جل حمض النووي (س 10,000 مخفف بالمياه)، وحماية من الضوء. استخدام ترانسيلوميناتور ضوء أزرق، قطع الفرقة حوالي 128 nt وأعلى مع شفرة حلاقة نظيفة (الشكل 5). تجميد القطع polyacrylamide هلام في-80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على الأقل.
  • حرارة قطع جل على 70 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، وطحن الجل باستخدام المدقات بيليه المتاح. الوتي الحمض النووي مع 300 ميليلتر من عيار 20 ملم تريس-HCl pH 7.0، واحتضان في 37 درجة مئوية ح 3.
  • الطرد المركزي العينة في 12,000 س ز، لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وجمع المادة طافية، ويعجل بإضافة المجلد 1/10 من ناواك (pH 5.5)، بحجم 1/100 من الجليكوجين (10 مغ/مل)، ووحدات تخزين 2.5 من الإيثانول 100%. احتضان في-20 درجة مئوية على الأقل ح 1.

    • 7-على

    1. الطرد المركزي في العينات من 20,000 x ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة الإيثانول. زيادة ونقصان لأسفل 30 s بأقصى سرعة، إزالة بقية الإيثانول مع تلميح جل في التحميل، والهواء الجاف بيليه لمدة 10 دقائق.
    2. ريسوسبيند بيليه في ميليلتر 16.75 المياه خالية من نوكلاس. إضافة 2 ميليلتر من 10 × واحد-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي (ssDNA) ليجاسى المخزن المؤقت، 1 ميليلتر من 50 مم الحركة ميليلتر2، 0.25 من سدنى ليجاسى (100 يو/ميليلتر). احتضانها ح 1 في 60 درجة مئوية، 10 دقيقة عند 80 درجة مئوية. لا يعجل، وتخزين المنتج رد فعل ربط ssDNA عند-20 درجة مئوية.

    8-بكر مكتبة التضخيم

    1. بينما العامل في الجليد، وخلط ما يلي في أنبوب PCR: 146 ميليلتر من المياه خالية من نوكلياسي، 2 ميليلتر من 20 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام، 2 ميليلتر من 20 ميكرومتر "فهرسة عكس" التمهيدي، 40 ميليلتر من 5 × عالية الدقة الحمض النووي بليميراسي المخزن المؤقت، 4 ميليلتر من دنتبس (10 ملم)، 4 ميليلتر من سدنا ربط رد الفعل الناتج ، و 2 ميليلتر من عالية الدقة بوليميريز الحمض النووي. اختر تمهيدي "فهرسة عكس" مختلف لكل عينة وسوف يكون متعدد للتسلسل. نقل من قاسمة 50 ميليلتر من خليط PCR إلى 4 أنابيب PCR جديدة.
    2. أداء [بكر] تضخيم مع اختلاف عدد الدورات (8، 10، 12، 14) باستخدام الإعدادات التالية:
      1 دقيقة في تمسخ الأولى 98 درجة مئوية
      دورات 8 إلى 14:
      15 s في 94 درجة مئوية
      5 s في 55 درجة مئوية
      10 s عند 65 درجة مئوية
      2 دقيقة في التمديد النهائي 65 درجة مئوية
    3. يعجل بالمنتج بكر بإضافة المجلد 1/10 من 3 م نواك (pH 5.5)، المجلد 1/100 من الجليكوجين (10 مغ/مل)، ووحدات تخزين 2.5 من الإيثانول 100%. احتضان في-20 درجة مئوية على الأقل ح 1.
    4. الطرد المركزي في العينات من 20,000 x ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة الإيثانول. زيادة ونقصان لأسفل 30 s بأقصى سرعة، إزالة بقية الإيثانول مع تلميح جل في التحميل، والهواء الجاف بيليه.
    5. ريسوسبيند بيليه في 8 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس، إضافة 2 ميليلتر من غير يشوه 5 × المخزن المؤقت لعينات الحمض النووي. تحميل العينة في 1 جيدا من جل TBE 8% غير يشوه. فصل المنتجات الحمض النووي بالتفريد جل 150 الخامس لمدة 35 دقيقة. كعنصر تحكم، إعداد عينة تحتوي على 0.5 ميليلتر bp 10 سلم الحمض النووي (1 ميكروغرام/ميليلتر)، 7.5 ميليلتر المياه و 2 ميليلتر من غير يشوه 5 × المخزن المؤقت لعينات الحمض النووي، وتشغيل على ممر منفصل من الجل.
    6. وصمة عار للهلام لمدة 5 دقائق مع وصمة عار جل حمض النووي (س 10,000 مخفف بالمياه)، وحماية من الضوء. استخدام ترانسيلوميناتور ضوء أزرق، قطع الفرقة حوالي 150 شركة بريتيش بتروليوم لعينات البصمة وحوالي 180 شركة بريتيش بتروليوم لعينات مرناً (الشكل 6) مع شفرة حلاقة نظيفة. تخزين قطع جل في-80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على الأقل.
    7. حرارة قطع جل على 70 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، وطحن الجل باستخدام المدقات بيليه المتاح. الوت الحمض النووي مع 300 ميليلتر من عيار 20 ملم تريس-HCl pH 7.0، واحتضان في 37 درجة مئوية ح 3.
    8. الطرد المركزي العينة في 12,000 س ز، لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وجمع المادة طافية، ويعجل بإضافة المجلد 1/10 من نواك (pH 5.5)، بحجم 1/100 من الجليكوجين (10 مغ/مل)، ووحدات تخزين 2.5 من الإيثانول 100%. احتضان في-20 درجة مئوية على الأقل ح 1.
    9. الطرد المركزي في العينات من 20,000 x ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وإزالة الإيثانول. زيادة ونقصان لأسفل 30 s بأقصى سرعة، إزالة بقية الإيثانول مع تلميح جل في التحميل، والهواء الجاف بيليه. وأخيراً، ريسوسبيند المكتبات في 20 ميليلتر من المياه خالية من نوكلاس والمضي قدما للقياس الكمي، ومراقبة الجودة والتسلسل.

    9-مكتبة القياس الكمي والتسلسل الفائق

    1. قبل إرسال العينات للتسلسل، تحديد العائد ونوعية المكتبات تضخيم PCR. تظهر ملامح الممثل للبصمة ومكتبات تسلسل مرناً في الشكل 7. هو الحجم المتوقع للمكتبة بكر تضخيم bp 148-152 لعينات البصمة، وشركة بريتيش بتروليوم 170-190 لعينات مرناً.
    2. إذا كان سيتم تجميع عدة عينات مع مختلف رموز شريطية للتسلسل، أداء دقيقة التحديد الكمي للمكتبات باستخدام تحليل الكمي مكتبة تسلسل القائم على قبكر.
    3. تجمع المكتبات في نسب اكويمولار. حساب الحجم الإجمالي للمجمع ميليلتر 3 × العدد الإجمالي للعينات تجميع. تحديد حجم كل مكتبة يحتاج إلى إضافة بحيث تختلط المكتبات في نسب اكويمولار لتحقيق 10 نانومتر التركيز النهائي تجمع. إضافة أحجام المحسوبة لكل مكتبة في أنبوب 1.5 مل جديدة، مزيج من بيبيتينج. إضافة المياه تحقيق الحجم الإجمالي المحسوب. تخزين المكتبات المجمعة في-20 درجة مئوية.
    4. إرسال قاسمة مكتبة المجمعة لتكون متسلسلة باستخدام 50 بي بي واحد في نهاية تسلسل تشغيل على منصة تسلسل إيلومينا. ونحن بشكل روتيني متعدد عينات 12 في تسلسل واحد تشغيل، الغلات التي ~ 200 مليون يقرأ كل حارة التسلسل.
      ملاحظة: العدد النهائي لقراءة البصمة التي جمعت كل كل عينة يعتمد على كمية المواد المدخلة ومستوى التلوث الرنا الريباسي.

    النتائج

    كانت خطوط الأنابيب مفصلة لتحليل بيوينفورماتيك من الريبوسوم التنميط البيانات المذكورة سابقا 8،9. وباﻹضافة إلى ذلك، وضعت عدة مجموعات بحثية أدوات المعلوماتية الحيوية لتحليل التعبير الجيني التفاضلي وتجهيز البيانات التسلسل، التي محددة الري...

    Discussion

    النهج Seq ريبو الذي برز كتقنية قوية لتحليل مرناً الترجمة في فيفو على نطاق الجينوم المستوى 3. الدراسات باستخدام هذا النهج، الذي يسمح برصد الترجمة مع القرار كودون واحد، قد ساهم في فهمنا للتنظيم متعدية الجنسيات. وعلى الرغم من مزاياه، Seq ريبو نقائص عديدة. شظايا الريباسي الحمض ا...

    Disclosures

    الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

    Acknowledgements

    وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة منح AG040191 و AG054566 على VML. أجرى هذا البحث في حين كان VML مستلم عفر "منحة بحثية" من "الاتحاد الأمريكي" "بحوث الشيخوخة".

    Materials

    NameCompanyCatalog NumberComments
    0.45 μM membrane filtersMilliporeHVLP04700
    0.5 M EDTAInvitrogenAM9261
    0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO)MilliporeUFC510024
    1 M Tris-HCl, pH 7.0InvitrogenAM9850G
    1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C)Invitrogen15567-027
    10X TBE bufferInvitrogenAM9863
    10% TBE-urea gelInvitrogenEC6875BOX
    15% TBE-urea gelInvitrogenEC6885BOX
    2 M MgCl2RPIM24500-10.0
    2X TBE-urea sample bufferInvitrogenLC6876
    3M NaOAc, pH 5.5InvitrogenAM9740
    5' Deadenylase (10 U/μL)EpicentreDA11101K
    5X Nucleic acid sample loading bufferBio-Rad161-0767
    8% TBE gelInvitrogenEC6215BOX
    Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)InvitrogenAM9722
    Blue light transilluminatorClare Chemical ResearchDR-46B
    Chrome-steel beads, 3.2 mmBioSpec Products11079132c
    CryogrinderBiospec product3110BX
    CycloheximideRPIC81040-5.0
    Data Acquisition SystemDATAQ InstrumentsDI-245
    Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)NEBN0447L
    GlycogenInvitrogenAM9510
    Gradient fractionation systemBrandelBR-184X
    High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL)NEBM0530SSupplied with 5X Phusion HF Buffer
    Next-generation sequencing library quantification kitKapa BiosystemsKK4824
    Nucleic acid gel stainInvitrogenS11494
    Optima XE-90 ultracentrifugeBeckman CoulterA94471
    Poly(A) mRNA isolation kitInvitrogen61011
    Rec J exonuclease (10 U/μL)EpicentreRJ411250
    Reverse transcriptase (200 U/μL)Invitrogen18080093Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT
    RNA fragmentation bufferNEBE6186A
    RNase I (100 U/μL)InvitrogenAM2295
    RNase inhibitor (20 U/μL)InvitrogenAM2696
    Silicone rubber capsBioSpec Products2008
    ssDNA ligase (100 U/μL)EpicentreCL9021KSupplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2
    Stainless steel microvials, 1.8 mLBioSpec Products2007
    SucroseRPIS24060-5000.0
    SW-41 Ti rotorBeckman Coulter331362
    Syringe pumpNew Era Pump SystemsNE-300
    T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL)NEBM0201SSupplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer
    T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL)NEBM0373SSupplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000
    Thermal cyclerBio-Rad1851148
    Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mLBeckman Coulter331372
    Triton X-100Sigma AldrichX100-100ML
    UV monitorBio-Rad7318160
    Saccharomyces cerevisiae strain BY4741Open BiosystemsYSC1048

    References

    1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
    2. Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
    3. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
    4. Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).
    5. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
    6. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).
    7. Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).
    8. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
    9. Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling. Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).
    10. Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).
    11. Zhong, Y., et al. RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints. Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).
    12. Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data. Nat Commun. 7, 11194 (2016).
    13. Chung, B. Y., et al. The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis. RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).
    14. Popa, A., et al. RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing. F1000Res. 5, 1309 (2016).
    15. Dunn, J. G., Weissman, J. S. Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data. BMC Genomics. 17 (1), 958 (2016).
    16. Baranov, P. V., Michel, A. M. Illuminating translation with ribosome profiling spectra. Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).
    17. Calviello, L., et al. Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).
    18. Michel, A. M., et al. RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data. RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).
    19. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).
    20. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
    21. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
    22. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
    23. van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).
    24. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
    25. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
    26. Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).
    27. Weinberg, D. E., et al. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation. Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).
    28. Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle. Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).
    29. Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability. J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).
    30. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic Acids Res. 45 (2), e6 (2017).
    31. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Res. 42 (17), e134 (2014).
    32. O'Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nat Commun. 7, 12915 (2016).

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Explore More Articles

    130 Saccharomyces cerevisiae

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Privacy

    Terms of Use

    Policies

    Contact Us

    Recommend to library

    JoVE NEWSLETTERS

    Research

    Education

    Authors

    Librarians

    ABOUT JoVE

    Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved