جمع الأنسجة الدهنية للماوس وتجهيزها لتحليل الحمض النووي الريبي

Summary

والغرض من هذه الورقة تقديم إجراء خطوة بخطوة جمع مختلف الأنسجة الدهنية البيضاء من الفئران وتجهيز العينات الدهون واستخراج الحمض النووي الريبي.

Abstract

مقارنة بالانسجة الأخرى، لديه الأنسجة الدهنية البيضاء محتوى الرنا والبروتين أقل بكثير للمتلقين للمعلومات من تطبيقات مثل PCR الوقت الحقيقي ولطخة الغربية، نظراً لأن معظمها يحتوي على الدهون. هو أيضا تحدي عزل الحمض النووي الريبي من عينات الأنسجة الدهنية كخطوات إضافية مطلوبة لتفادي هذه الدهون. نقدم هنا، إجراء لجمع الأنسجة الدهنية البيضاء مختلفة تشريحيا ثلاثة من الفئران، لمعالجة هذه العينات وإجراء عزل الحمض النووي الريبي. يصف لنا كذلك تجميع لتجارب التعبير كدنا والجينات باستخدام PCR الوقت الحقيقي. وصف بموجب هذا البروتوكول يسمح للحد التلوث من الشعر والدم على منصات الدهون، فضلا عن التلوث المتبادل بين مختلف منصات الدهون أثناء جمع الأنسجة للحيوان. كما أنه تم الأمثل لضمان كمية كافية ونوعية من الحمض النووي الريبي المستخرج. هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على نطاق واسع لأي نموذج الماوس حيث عينات الأنسجة الدهنية مطلوبة لتجارب روتينية مثل PCR الوقت الحقيقي ولكن ليس المقصود لعزله من ثقافة الخلية adipocytes الأولية.

Introduction

وتعد السمنة وباء في جميع أنحاء العالم التي يمكن أن تؤدي إلى مضاعفات مثل نوع 2 من داء السكري¹. كثيرا ما تستخدم النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا والسمنة المفرطة الناجمة عن النظام الغذائي للبحوث في السمنة والمضاعفات المرتبطة به. تقليديا، النسيج الدهني الأبيض المعروف حجرة تخزين للطاقة الزائدة، وهي في معظمها تتألف من الدهون بينما النسيج الدهني البنى تحويل الطاقة إلى حرارة^2،3. الأنسجة الدهنية الحيوية وسيتم توسيع ويتقلص تبعاً للعديد من العوامل مثل تناول الغذاء والنشاط البدني. ومن ثم لتحديد العوامل المساهمة في هذه التغيرات، هي مجموعة كافية من الأنسجة الدهنية ومعالجة المطلوبة⁴.

بين الأنسجة الدهنية البيضاء، ومن المقبول عموما أن مستودعات الدهون تحت الجلد والبطن لها خصائص مختلفة مثل التعريب التشريحية ووظيفة^2،5. ونتيجة لذلك، لتجنب نتائج متضاربة أو تقلب كبير، يحتاج الاهتمام الواجب اتخاذها لتجنب التلوث المتبادل بين هذه المستودعات فات مختلفة عند تجميع منصات الدهون.

وعلاوة على ذلك، هناك ثلاثة تحديات رئيسية عند عزل الحمض النووي الريبي أو البروتين من الأنسجة الدهنية في الفئران البيضاء. أولاً، جمع منصات الدهون في الفئران السمنة ليست مهمة سهلة الحدود التي تفصل بين مختلف مخازن الدهون البيضاء ليست دائماً واضحة، خلافا للأجهزة الأخرى مثل الكليتين والقلب⁶. ثانيا، بسبب المحتوى الدهني المرتفع من الأنسجة الدهنية، من خلال عزل الحمض النووي الريبي أو البروتين، يطفو على أعلى طبقة من الدهون ويمنع الوصول المباشر للعينة. ثالثا، بدلاً من النسيج الدهني البنى أو الأنسجة الأخرى، قد الأنسجة الدهنية البيضاء أقل بكثير من محتوى البروتين والحمض النووي الريبي وهذا مصدر قلق كبير عند استخدام الفئران الصغار وتغذية الفئران اتباع نظام غذائي عادي (ن) والفئران التي من المتوقع أن يكون منخفض الدهون الجماهير (أي ممارسة نماذج كو، والعلاج بالعقاقير، والتدريب، إلخ.) ^{7 , 8}.

ولذلك، اختيار الطريقة المناسبة لعزل الحمض النووي الريبي من الأنسجة الدهنية أمر بالغ الأهمية. أساليب بديلة لاستخراج الفينول/كلوروفورم مجموعات تجارية. أنها تقوم عادة على خطوة استخراج فينول أولى، تليها تنقية الحمض النووي الريبي في عمود⁹. هذه المجموعات عادة ما تكون أكثر تكلفة وإعطاء عينات من انخفاض الغلة، في حين قد تكون نوعية الحمض النووي الريبي متغير ولكن هي أقل استهلاكاً للوقت. بيد واحدة من أكبر مزايا لاستخراج الحل/كلوروفورم الفينول الموصوفة هنا هو إمكانية عزل الحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين من عينة واحدة¹⁰. منذ منصات الفئران الدهون عادة ما تكون صغيرة، وإعطاء كمية صغيرة من الجيش الملكي النيبالي، والبروتينات (خاصة في نماذج الفأر الهزيل)، تعظيم هذه البروتوكولات البيانات واحدة يمكن الحصول على الخروج من عينة صغيرة.

والهدف من هذه الورقة تقديم وصف مفصل عن طريقة لضمان تحصيل عينة كافية من مستودعات الأنسجة الدهنية ثلاثة فئران بيضاء، فضلا عن كمية ونوعية لعزل الحمض النووي الريبي. يمكن استخدام الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها عن طريق اتباع هذا البروتوكول لإجراء فحوصات PCR الوقت الحقيقي. وليس المقصود هذا البروتوكول لعزل الحمض النووي الريبي من المستزرعة adipocytes الرئيسي.

Protocol

رعاية الفئران المستخدمة في الإجراءات الامتثال لمعايير لرعاية واستخدام الحيوانات التجريبية التي حددها "المجلس الكندي" "حماية الحيوانات". وافق جميع الإجراءات بالجامعة رعاية الحيوان واستخدام اللجنة في مركز الأبحاث الصاحب.

1-نيكروبسي وجمع الأنسجة الدهنية من الفئران الذكور

1. جعل المجموعات التجريبية وفقا لأهداف الدراسة. في هذه الدراسة، تم جمع عينات من مجموعتين من الفئران الذكور على خلفية C57Bl/6 (n = مجموعة/12-14). ضمان أن الفئران المستخدمة هنا هي أسابيع 12-15 من العمر وهي الحفاظ على دورة الضوء/الظلام 12-ح مع الوصول إلى عادي (ن) أو النظام الغذائي عالية من الدهون (HF) والمياه libitum الإعلانية لمدة 10 أسابيع¹¹.
2. Euthanize ماوس بوضع الماوس في دائرة مغلقة حيث يتعرض إلى 6% CO₂ خلال 10 دقائق.
3. إجراء ثقب القلب بإدخال حقنه 1 مل مزودة بإبرة 1/2po ز 26 فقط إلى يسار القص للحيوان ببطء وسحب المكبس لإزالة معظم دم الحيوان ببطء. تأكد من أن المحاقن موازية لجسم الحيوان. تدوير حقنه ببطء بينما سحب المكبس إذا كان الدم لا يأتي في المحاقن.
   ملاحظة: ثقب القلب الناجحة (بين 0.8 و 1 مل حجم الدم) سينخفض تلوث أنسجة الدهنية بالدم.
4. وتكمن الفئران على ظهرها ودبوس كل مخلب على لوحة المفاتيح باستخدام الإبر ز 22 كما هو مبين في الشكل 1.
5. مع شاش، فرك الجلد الماوس مع الكحول عدة مرات بدءاً من الرقبة على طول الطريق وصولاً إلى الأجهزة التناسلية باتباع اقتراح أحادي الاتجاه، وهذا ما يضمن أن الشعر لا يزال مسطحة ويقلل من تلوث عينات الأنسجة الدهنية للشعر دون إزالة الشعر.
6. استخدام نظيف لكن عقيمة لا الملقط، والمقص الجراحي، رفع الجلد الوسطى بالقرب من الأجهزة التناسلية وشق صغير 0.3 مم.
7. إدراج المقص أفقياً في الحفرة المفتوحة وفصل جلد البطن من جدار البطن.
   ملاحظة: ويتم هذا بالتشريح صراحة في المسافة بين الجلد وجدار البطن وليس بقطع الأغشية التي وجدت في هذا الفضاء.
8. استخدام الملقط، رفع الجلد الوسطى بالقرب من الحفرة المفتوحة، وقطع الجلد على لينيا ألبا حتى أنت قرب القفص الصدري (~ 4 سم تبعاً لحجم الماوس).
   ملاحظة: تجنب قطع عضلة البطن كهذا قد فضح الأنسجة الدهنية الحشوية في الهواء وتؤدي إلى تجفيف منصات الدهون التي قد تغير من سلامة الأنسجة ومحتواه.
9. من منتصف القفص الصدري، قطع الجلد نحو الذراع الأيمن في ~ 2 سم. من القرب من الأجهزة التناسلية، قطع الجلد أعلاه أطرافهم هند الحق في ~ 2 سم.
10. تمتد أحد أركان فتح الجلد ودبوس على لوحة المفاتيح باستخدام إبرة ز 22. كرر مع الزاوية الأخرى.
    ملاحظة: الأنسجة الدهنية لعرضه على الجلد من الدهون تحت الجلد في منطقة البطن (SCF) (الشكل 1أ).
11. جمع صندوق إنقاذ الطفولة تشريح حادة وقطع من الجلد باستخدام مقص جراحي المتمركزة في شقة ممكن ضد الجلد. بمجرد جمعها، وضع في صندوق إنقاذ الطفولة على رقائق الألومنيوم التي تم تحديدها مسبقاً.
    ملاحظة: جمع أو تلويث ستغير الأنسجة الدهنية بالجلد أو الشعر عينة من الجودة والغلة الجيش الملكي النيبالي بسبب رنسيس. إذا كانت تنفق الكثير من الوقت جمع الأنسجة الدهنية، قد أيضا جاف العينة التي يمكن أيضا تغيير نوعية العينة.
12. كرر الخطوات من 1.9 إلى 1.11 في الجانب الأيسر من الحيوان. تجمع منصات كل من اليسار واليمين من الدهون في رقائق الألومنيوم وتجميد العينة في نيتروجين سائل.
13. للحصول على إمكانية الوصول إلى الأنسجة الدهنية الحشوية، قطع عضلة البطن باستخدام مقص جراحي نظيفة ولكن ليست عقيمة والملقط على طول لينيا ألبا، على سم ~ 4، تبعاً لحجم الماوس، من الأعضاء التناسلية إلى القفص الصدري. قم بإجراء شق في عضلات البطن من الأعضاء التناسلية نحو الجزء الخلفي الماوس على سم ~2.5 الوصول إلى جانب أعضاء البطن.
14. الدهون حول الأعضاء التناسلية هي الدهون المحيطة جونادال (PGF) (الشكل 1ب). كما PGF موصولة البربخ وفي الخصية و القناة ديفيرينس، فصل لوحة الدهون الأيسر من هذه الهياكل بعناية ووضعت على رقائق الألومنيوم التي تم تحديدها مسبقاً. كرر على الجانب الأيسر. حالما يتم جمع كلا بجفس، تجميد العينة في نيتروجين سائل.
15. بدءاً من الجانب الأيسر، تعرض الكليتين بتحريك الأمعاء خارج تجويف البطن إلى الجانب الأيسر. الأنسجة الدهنية المحيطة بالكلى من الدهون المحيطة الكلوي (PRF) (الشكل 1ج). كما يحيط PRF الغدد الكظرية (الشكل 1د).
16. عزل وإزالة الغدد الكظرية قبل جمع PRF. وهذا يمكن أن تكون مملة كما فقط وردي قليلاً من الأنسجة الدهنية.
    ملاحظة: لا يجب إزالة الكليتين أثناء هذه الخطوة قد تلوث في الأنسجة الدهنية للدم وتجعل من الصعب أكثر تحديد الغدد الكظرية داخل هذه اللوحة الدهون.
17. عزل PRF من الجدار العضلي مرة أخرى، تنتهي بقطع الحالب، وشريان كلوي، والسياق الذي يفصل PRF والكلى من بقية الجسم. عزل PRF من الكلي عن طريق قطع وإزالة الكبسولة الكلوي. PRF يبقى المرفقة بالكبسولة.
18. كرر الخطوتين 1.15 و 1.17 للجانب الأيسر. وضع كلا PRF في رقائق الألومنيوم وتجميد العينة في نيتروجين سائل.
19. كرر الإجراء من الخطوات 1.2 إلى 1.18 لجميع الفئران التي سيتم جمعها.
20. عند هذه النقطة، المضي قدما في الأنسجة الدهنية لطحن أو تخزين العينات في ثلاجة-80 درجة مئوية لاستخراج لاحقة. ويمكن تخزين العينات ستابلي في-80 درجة مئوية لعدة سنوات⁴.

2-إعداد الأرض البيضاء الأنسجة الدهنية لعزل الحمض النووي الريبي

ملاحظة: ارتداء قفازات لكل خطوة كما يحتوي الجلد على رنسيس التي يمكن أن تعزز تدهور الجيش الملكي النيبالي وعلى هذا النحو، يغير نوعية العينة والجيش الملكي النيبالي الغلة بعد عزلة.

1. إعداد وتحديد ثلاثة خالية رناسي 1.5 مل ملولبة مخروطية أنابيب كل الماوس، واحد لكل نوع من الأنسجة الدهنية البيضاء، ووضعها على رف.
   ملاحظة: الحيوانات يعانون من السمنة المفرطة قد تتطلب أنابيب إضافية كما أنها زادت الدهون الجماهير. وهذا لا سيما الحقيقية لصندوق إنقاذ الطفولة التي تصل إلى 7 أنابيب للماوس واحد تم الحصول عليها.
2. تنظيف مقاعد البدلاء مع الإيثانول 70% ووضع ورقة البدلاء نظيفة وجديدة على السطح.
3. ما إذا كانت الأنسجة الدهنية وجمعت حديثا من الفئران أو المخزنة مسبقاً في ثلاجة-80 درجة مئوية، جمع جميع العينات في حاوية مليئة بالنيتروجين السائل واحد حتى بداية الإجراء.
4. تجميد قذائف الهاون والمدقة والملعقة عن طريق وضعها في حاوية نيتروجين سائل. عند توقف النتروجين السائل '' تغلي ''، يمكن بدء طحن من الأنسجة الدهنية.
   ملاحظة: من هذه الخطوة، ومدافع الهاون، والبسط، الأنبوبة المخروطية والأنسجة الدهنية بحاجة إلى البقاء مبردة خلال العملية بأكملها. أي الحرارة سوف تذوب في الأنسجة الدهنية ويجعل من الصعب على استخراج الجيش الملكي النيبالي. أيضا، إذا كان استخدام السيراميك هاون ومدقة، قد أحد استخدام الثلج الجاف و/أو النتروجين السائل للحفاظ على البارد.
5. ضع جميع خالية رناسي 1.5 مل ملولبة مخروطية أنابيب إعدادها في الخطوة 2، 2 في الثلج الجاف يبرد لهم.
6. لتجنب فروستبيتيس على يدي، استخدم عدة طبقات من الورق البنى لرفع قذائف الهاون من النيتروجين السائل ووضعها على منضدة عمل.
7. استخدام الملقط جمع عينات أنسجة الدهنية من النيتروجين السائل ووضعها في الهاون. بسرعة بسط رقائق الألومنيوم وإسقاط العينة في مركز قذائف الهاون.
   ملاحظة: إذا كانت العينة الأنسجة الدهنية كبيرة جداً، كما الحال بالنسبة للفئران السمنة، كسر العينات في أجزاء أصغر في رقائق الألومنيوم استخدام الإبهام ويطحنون كل جزء على حدة.
8. استخدام عدة طبقات من الورق البنى لرفع المدقة من النيتروجين السائل وأنها تناسب في الهاون. حين عقد المدقة مع ورقات براون، استخدم المطرقة لتصل إلى أعلى من المدقة مرة أو مرتين. اضغط المدقة ضد قذائف الهاون مع الدورية التماسات لطحن العينة حتى يتم الحصول على مسحوق ناعم.
   ملاحظة: هذه الخطوة غير الحرجة للحصول على عزل الحمض النووي الريبي كاف. وفي الواقع، وجود شظايا أكبر سوف تعرقل عزل الحمض النووي الريبي وخفض العائد.
9. حالما يتم الحصول على مسحوق ناعم، إزالة المدقة والتقاط الملعقة من النيتروجين السائل واستخدامه لنقل العينة في أنبوب مخروطي مبردة مسبقاً 1.5 مل المقابلة.
   ملاحظة: وتراجع الملعقة العودة إلى النيتروجين السائل من وقت لآخر الحيلولة دون ذوبان العينة. أيضا، أن نضع الأنبوبة المخروطية في الثلج الجاف دائماً لمنع العينة من ذوبان الجليد. أنبوب مخروطي مليئة بعينه الأرض بقدرة حوالي 2/3 (~ 1 مل) مطلوب لكافية الغلة الجيش الملكي النيبالي والكمية.
10. بمجرد ملء لحوالي 1 مل، إغلاق الأنبوب وأسقطه في حاوية مليئة بالنيتروجين السائل الأخرى.
    ملاحظة: يمكن وضعها في منفصلة مبردة مسبقاً خالية رناسي 1.5 مل مخروطية أنابيب العينات الزائدة والمخزنة في ثلاجة-80 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.
11. تنظيف قذائف الهاون والمدقة ملعقة مع ورقات براون لتجنب الترحيل إلى عينة الأنسجة الدهنية القادم. وضع مدقة وملعقة مرة أخرى إلى النيتروجين السائل لالبرد. على الرغم من أن الورقة البنى رناسي خالية، لا نستخدم طازجة فتح علبة الورق البنى لكل يوم من عزل الحمض النووي الريبي.
12. كرر الخطوات من 2.4 إلى 2.11 مع العينة التالي.
13. حالما تتم معالجة جميع العينات، بدء عزل الحمض النووي الريبي أو تخزين العينات في ثلاجة-80 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.
    ملاحظة: لمنع انفجار الأنابيب، تجميد مربع نموذج بواسطة غمر تماما أنه في حاوية نيتروجين سائل. عندما تبرد يكفي إزالة النيتروجين الزائد من المربع واسمحوا أنها تطفو فوق النتروجين السائل. فرز العينات داخل المربع ووضعه في ثلاجة-80 درجة مئوية.

3-الجيش الملكي النيبالي في معزل عن الأنسجة الدهنية للأرض

تنبيه: الحل الفينول مضر للجلد. ارتداء معطف مختبر، والقفازات، ونظارات السلامة وتنفيذ الإجراء تحت غطاء كيميائية. ويبين الشكل 2مخطط انسيابي خطوة بخطوة.

1. إعداد وتحديد مجموعتين من أنابيب مخروطية 1.5 مل رناسي خالية ووضعها على حامل.
2. ما إذا كانت الأنسجة الدهنية طازجة الأرض أو المخزنة مسبقاً في ثلاجة-80 درجة مئوية، جمع جميع العينات في حاوية مليئة بالنيتروجين سائل حتى بدء الإجراء الذي يتم في معظم الأحيان في درجة حرارة الغرفة.
3. استخدام الملقط لتحديد عينة أنسجة الدهنية لأرض من النيتروجين السائل ووضعه على حامل أنبوب. يجب أن تحتوي على الأنابيب ~ 1 مل مسحوق، الذي يتوافق مع حوالي 100 ملغ مسحوق الأنسجة.
4. فتح الأنبوب ببطء.
   ملاحظة: قد يؤدي ترك أنبوب مغلق في درجة حرارة الغرفة أو فتح غطاء للأنبوب بسرعة كبيرة جداً إلى عينة خسارة أو إصابة الضغط من النيتروجين يميل إلى الهروب من الأنبوب.
5. إضافة 500 ميليلتر من الفينول الحل للعينة (نسبة 1:2 لحل الفينول: مسحوق الأنسجة).
6. إغلاق غطاء أنبوب ودوامه بأقصى سرعة ممكنة لحوالي 5 س. ببطء وعناية بفتح أنبوب للإفراج عن الضغط من النيتروجين (يمكن سماع صوت هواء يخرج من الأنبوب).
7. كرر الخطوات من 3-5 و 3.6. حجم الحل النهائي الفينول إضافة إلى العينة من 1 مل.
8. كرر الخطوة 3، 6 حتى يذوب تماما العينة.
   ملاحظة: من المهم أن الإفراج عن جميع الضغوط من الأنبوب قبل المضي قدما للحيلولة دون انفجار الأنبوب.
9. واسمحوا العينة الوقوف عند درجة حرارة الغرفة بينما تكرار الخطوات من 3.4 إلى 3.8 للعينات القادمة.
10. مرة واحدة جميع العينات التي يتم معالجتها، بإيجاز دوامة بأقصى سرعة ممكنة واحتضان جميع العينات 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
11. الطرد المركزي 10 دقيقة في 12 000 س ز في 4 درجات مئوية. جلب هذه الأنابيب إلى درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي، 3 مراحل موجودة كما هو مبين في الشكل 2: الدهون (أعلى)، والجيش الملكي النيبالي (الأوسط) وبيليه (أسفل).
12. لكل عينة، نقل قدر الجيش الملكي النيبالي (طبقة وسطى الوردي) ممكن في أول مجموعة من أنابيب المقابلة مع ماصة P1000 استخدام تلميح التي تمت تصفيتها. تغيير نصائح بين العينات.
13. لضمان الحد الأدنى من التلوث من الحمض النووي الريبي (الطبقة الوسطى) بالدهن (الطبقة العليا)، بيرس في مرحلة أعلى مع تلميح قرب الجانب للأنبوب. الاستغناء عن الجيش الملكي النيبالي في أنابيب مخروطية الشكل الجديد دون لمس الجانبين من أنبوب جديد لمنع نقل الدهون التي قد تكون خارج الحافة.
14. إضافة 200 ميليلتر من كلوروفورم نقية لكل عينة ومزيج من انعكاس لمدة 10 احتضان س. 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
15. الطرد المركزي 15 دقيقة في 12 000 س ز في 4 درجات مئوية وجلب الأنابيب إلى درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي، توجد ثلاث مراحل: الحمض النووي الريبي (أعلى)، الطور البيني التي تحتوي على الحمض النووي (وسط) وأحمر الفينول كلوروفورم التي تحتوي على بروتينات (أسفل).
16. لكل عينة، نقل كمرحلة شفافة كثير المائية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي (المرحلة العليا) قدر الإمكان للمجموعة الثانية من أنابيب مخروطية الشكل المطابق مع ماصة P1000 استخدام النصائح التي تمت تصفيتها. تغيير نصائح بين كل عينة.
    ملاحظة: الطور البيني لا يزال هشا، ويمكن أن تلوث في مرحلة أعلى إذا كان الشفط يتم بسرعة كبيرة جداً. وكبديل لذلك، استخدم ماصة P200 لتقليل فرص مثيرة للقلق في الطور البيني.
17. إضافة 500 ميليلتر من الايزوبروبانول 100% لكل عينة ومزيج من انعكاس لمدة 15 ثانية.
18. احتضان 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة
19. الطرد المركزي 10 دقيقة في 12 000 س ز في 4 درجات مئوية وجلب الأنابيب إلى درجة حرارة الغرفة. تجاهل الايزوبروبانول بعكس كل أنبوبة.
    ملاحظة: بيليه الحمض النووي الريبي بيضاء صغيرة يمكن أن ينظر إليه عادة ولكن في بعض الأحيان قد لا.
20. أضف 1 مل إيثانول 75 في المائة (من إعداد من الإيثانول 100% والمياه خالية من رناسي) لكل عينة ودوامه بإيجاز كل أنبوبة بأقصى سرعة ممكنة.
21. الطرد المركزي 5 دقائق في 7 500 س ز في 4 درجات مئوية وجلب الأنابيب إلى درجة حرارة الغرفة.
22. تجاهل الإيثانول 75% بعكس كل أنبوبة والاستفادة من جروح طفيفة ضد ورقة براون لإزالة أي بقايا.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، استخدم تلميح تصفيتها لإزالة الكحول قرب بيليه الجيش الملكي النيبالي. تغيير تلميح بين العينات.
23. إجازة فتح الغطاء والهواء الجاف بيليه الحمض النووي الريبي لحوالي 15-20 دقيقة.
    ملاحظة: وقد تصبح الكريات الحمض النووي الريبي شفافة أثناء هذه الخطوة.
24. كما تعتمد على حجم solubilization الجيش الملكي النيبالي من بيليه، تقييم حجم بيليه لتحديد حجم المياه خالية من رناسي لاستخدامها لجعل الجيش الملكي النيبالي. قم بتدوين الحجم (10 إلى 25 ميليلتر) لكل عينة.
    ملاحظة: هذه الخطوة مجرد النوعي. إذا كان لا يمكن رؤية بيليه الجيش الملكي النيبالي، إضافة 10 ميليلتر من المياه خالية من الحمض النووي الريبي للعينة.
25. إضافة 10-25 ميليلتر من المياه خالية من رناسي لكل عينة (وحدة التخزين المحددة مسبقاً في الخطوة 3.24).
26. احتضان العينة 5 دقيقة في كتلة حرارة في 60 درجة مئوية. باختصار من دوامة الأنابيب.
27. احتضان العينة 5 دقائق إضافية في نفس الكتلة الحرارة عند 60 درجة مئوية.
28. سريع--تدور تدور الطرد المركزي جميع العينات في مصغرة وفورا على الجليد.
29. تحديد تركيز الحمض النووي الريبي والنقاء. إجراء النسخ العكسي (RT) الحصول على كدنا أو تخزين العينات في ثلاجة-80 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.
    ملاحظة: تجنب عدة دورات تجميد/ذوبان الجليد هذا يحط عينات الحمض النووي الريبي.

4-تحديد تركيزات الأنسجة الدهنية للجيش الملكي النيبالي ونقاء

1. ما إذا كانت عينات الأنسجة الدهنية للجيش النيبالي الملكي الطازج المستخرج و solubilized أو المخزنة مسبقاً في ثلاجة-80 درجة مئوية، جمع جميع العينات والسماح لها بالذوبان في الجليد حتى بدء الإجراء. ينبغي أن يتم ذلك قبل بدء الخطوة التالية أو في نهاية للعزلة لتجنب عدة دورات تجميد/ذوبان الجليد.
2. إعداد وتحديد مجموعتين من أنابيب مخروطية 1.5 مل رناسي خالية ووضعها في رف أنبوبة.
3. عند إذابة جميع عينات الحمض النووي الريبي تماما، دوامة عينة 1 s ووضعها مرة أخرى على الجليد.
4. تمييع حلك TE 100-fold س 1 في الجيش الملكي النيبالي في المجموعة الأولى من خالية رناسي 1.5 مل مخروطية أنابيب باستخدام تصفية نصائح مجانية رناسي (وضع ميليلتر 99 حل الشركة المصرية للاتصالات 1 x و 1 ميليلتر من الحمض النووي الريبي للأنبوب).
5. كرر لكل عينة.
   ملاحظة: قد تكون الأحجام مختلفة لكل جهاز المطياف الضوئي تبعاً ومبومو المستخدمة.
6. حالما تتم معالجة جميع العينات، تضعف دوامة كل عينة.
7. يتبع البروتوكول من جهاز المطياف الضوئي لمعايرة الصك باستخدام قرص فارغ (1 x TE) قبل معالجة عينات الحمض النووي الريبي المخفف.
8. نقل عينات الحمض النووي الريبي المخفف ومبومو الكوارتز وتحديد تركيز كل عينة في 260 نيوتن متر.
   ملاحظة: إذا لم توفر جهاز المطياف الضوئي تركيز الحمض النووي الريبي النهائي، باستخدام هذه الصيغة لحساب: الحمض النووي الريبي (ميكروغرام/ميليلتر) = OD₂₆₀ × معامل التخفيف × (40 ميكروغرام الحمض النووي الريبي/1 000 ميليلتر).
9. تحديد نقاء الحمض النووي الريبي لكل عينة بحساب نسبة OD₂₆₀/OD₂₈₀.
   ملاحظة: ويعتبر عموما نقية للحمض النووي الريبي¹²نسبة OD₂₆₀/OD₂₈₀ حول 2.0. من المستحسن جداً أن يتم التحقق من نوعية الجيش الملكي النيبالي. وللقيام بذلك، وضع 1 ميكروغرام من الجيش الملكي النيبالي على 1% [اغروس] هلام التبييض مع المخزن المؤقت x TBE 1 (قاعدة تريس 89 مم، 89 مم الماء المقطر و 2 مم يدتا، pH 8.0) والتبييض 1% حل¹³ (الشكل 3). الجيش الملكي النيبالي نوعية جيدة جداً يظهر العصابات الرنا الريباسي 28S و 18S والفرقة 28S ينبغي أن تكون أكثر كثافة من 18S. نوعية الحمض النووي الريبي مقبول عند كلا العصابات الرنا الريباسي مرئية في كثافة مماثلة. نوعية الحمض النووي الريبي يصبح ناقص لحظة الفرقة 18S أكثر كثافة من الفرقة 28S، وعندما تشويه مرئية، يدل على تدهور الجيش الملكي النيبالي.
10. لكل عينة، وإعداد 10 ميليلتر من 0.5 ميكروغرام/ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي من المخزون في المجموعة الثانية من خالية رناسي 1.5 مل مخروطية أنابيب استخدام مياه خالية من رناسي لتمييع العينات حسب الحاجة. وتستخدم هذه العينات ل RT الحصول على كدنا.
11. حالما تتم معالجة جميع العينات، بدء RT أو تخزين العينات في ثلاجة-80 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.

5-عكس النسخ (RT)

1. ما إذا كانت عينات الأنسجة الدهنية للجيش النيبالي الملكي الطازج المخفف إلى 0.5 ميكروغرام/ميليلتر أو المخزنة مسبقاً في ثلاجة-80 درجة مئوية، جمع جميع العينات، والكاشفات والسماح لها بالذوبان في الجليد حتى بدء الإجراء.
2. وضع على الرف قطاع أنابيب PCR على الجليد. بمجرد إعداد الباردة ما فيه الكفاية وتحديد مجموعة واحدة من أنبوب بكر خالية من رناسي شرائط ووضعها على الرف. إدراج قرص فارغ.
3. تعد رد فعل لمعاملة الدناز من الجيش الملكي النيبالي: جعل مزيج رئيسي (للمبلغ المطلوب للعينة + 1 عينة) ما يلي (الكميات للعينة 1): 1 ميليلتر من 10 س رد فعل المخزن المؤقت مع مجكل₂، 0.5 ميليلتر من الدناز أنا (يو 1/ميليلتر) و 7.5 ميليلتر من رناسي خالية المياه باستخدام النصائح التي تمت تصفيتها. الاستغناء عن 9 ميليلتر في كل أنبوبة.
4. إضافة 1 ميليلتر من 0.5 ميكروغرام/ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي من كل عينة للأنبوب المقابلة، وضع القبعات على كل قطاع وسريعة-تدور جميع الشرائط في تدور ميني الطرد المركزي لإحضار العينة إلى الجزء السفلي من الأنبوب. أضف 1 ميليلتر من المياه خالية من الحمض النووي الريبي للفراغ.
5. احتضان جميع شرائط أنبوب في cycler حرارية أو كتلة تدفئة في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 30 وضع قطاع الأنبوب مرة أخرى على الرف على الجليد.
6. أضف 1 ميليلتر يدتا (50 ملم) لكل أنبوبة واحتضان جميع شرائط أنبوب في cycler حرارية أو كتلة تدفئة عند 65 درجة مئوية للحد الأدنى 10 وضع قطاع الأنبوب مرة أخرى على الرف على الجليد.
7. جعل مزيج رئيسي (للحصول على العدد المطلوب من العينات بالإضافة إلى نموذج 1) مما يلي (الكميات للعينة 1): 1 ميليلتر hexamers عشوائية (0.2 ميكروغرام/ميليلتر) و 1 ميليلتر من مزيج دنتب (يحتوي على كل من deoxynucleotides الأربعة بتركيز 10 ملم). الاستغناء عن 2 ميليلتر من مزيج الرئيسي في كل أنبوبة استخدام النصائح التي تمت تصفيتها. تغيير تلميح بين العينات.
8. احتضان جميع شرائط أنبوب في cycler حرارية أو كتلة تدفئة عند 65 درجة مئوية للحد الأدنى 5 وضع قطاع الأنبوب إلى رف على الجليد.
9. جعل مزيج رئيسي (للحصول على العدد المطلوب من العينات بالإضافة إلى نموذج 1) مما يلي (الكميات للعينة 1): 4 ميليلتر من 5 x RT المخزن المؤقت، 1 ميليلتر من رناسي المانع (يو 20/ميليلتر)، ميليلتر 0.25 لعكس المنتسخة (200 يو/ميليلتر) وميليلتر 1.75 المياه خالية من نوكلياسي. الاستغناء عن 7 ميليلتر في كل أنبوبة استخدام النصائح التي تمت تصفيتها. تغيير تلميح بين العينات.
10. تنفيذ RT في cycler حرارية بواسطة إعداد البرنامج التالي: 10 دقيقة عند 25 درجة مئوية، 30 دقيقة عند 50 درجة مئوية، مدة 5 دقائق في 85 درجة مئوية. وضع الشرائط الأنبوب الحامل على الجليد مرة أخرى.
11. إعداد وتحديد مجموعة واحدة من الشرائط أنبوب بكر خالية من رناسي ووضعها على الرف.
12. لكل عينة، وإعداد وحدة التخزين المطلوبة من 1:5 كدنا المخفف من المخزون في شرائط أنبوب جديد باستخدام الماء عالي النقاوة. سيتم استخدام العينات كدنا المخفف 1:5 لبكر في الوقت الحقيقي.
13. حالما تتم معالجة جميع العينات، بدء PCR الوقت الحقيقي أو تخزين العينات (الأسهم وعينات المخفف) في ثلاجة-20 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.

6-في الوقت الحقيقي PCR للتعبير الجيني في الأنسجة الدهنية

ملاحظة: تجنب تعريض صبغة الفلورسنت للضوء. البروتوكول أدناه يصف التضخيم s16 الجينات مرجع¹⁴. ينبغي تعديل الإشعال وظروف PCR وفقا للجينات للفائدة.

1. ما إذا كانت العينات كدنا الطازج المخفف 1:5 أو المخزنة مسبقاً في ثلاجة-20 درجة مئوية، جمع جميع العينات والمواد الكاشفة والسماح لها بالذوبان في الجليد حتى بدء الإجراء.
2. وضع على الرف لشرائط أنبوب PCR الوقت الحقيقي على الجليد. وبمجرد الباردة ما يكفي إعداد وتحديد مجموعة واحدة من الوقت الحقيقي أنبوب PCR شرائط ووضعها على الرف. إعداد كل عينة والفراغ في مكررة.
3. جعل مزيج رئيسي (للحصول على العدد المطلوب من العينات بالإضافة إلى نموذج 1) مما يلي (الكميات للعينة 1): 1.9 ميليلتر الماء عالي النقاوة وميليلتر 5 من صبغة الفلورسنت (مثل سيبر الأخضر) وميليلتر 0.3 من التمهيدي إلى الأمام وميليلتر 0.3 من التمهيدي عكس. الاستغناء عن 7.5 ميليلتر في كل أنبوبة.
4. إضافة 2.5 ميليلتر من كدنا المخفف 1:5 من كل عينة للأنبوب المقابلة. إضافة 2.5 ميليلتر من الماء عالي النقاوة للفراغات. وضع القبعات في كل قطاع.
5. اتبع إرشادات الشركة المصنعة لإعداد البرنامج التالي في PCR الوقت الحقيقي: 10 دقيقة في 95 درجة مئوية ودورات 40 15 s عند 50 درجة مئوية، 30 ثانية عند 60 درجة مئوية، 30 s عند 70 درجة مئوية. وضع الشرائط عينة في دوار الجهاز PCR الوقت الحقيقي وبدء تشغيل البرنامج.
   ملاحظة: قد تختلف الشروط cycler الحرارية اعتماداً على جهاز المستخدم والجينات للفائدة. مرناً التعبير النتائج المعروضة في الشكل 3 إظهار اللبتين مرناً التضخيم تطبيع بالجينات مرجع مرناً S16 التضخيم^14،15.

النتائج

تبعاً لهذا الإجراء نيكروبسي، وجمعت ثلاثة من الأنسجة الدهنية البيضاء ومرجح من المجموعتين من الفئران (N والتردد ذلك من الفئران تغذية النظام الغذائي). كما هو متوقع، قد زادت الفئران في النظام الغذائي HF وزن الجسم النهائي وزيادة الوزن مقارنة مع ليتيرماتيس على نظام غذائي N (...

Discussion

التالي التردد-الحمية التغذية، تم العثور على الفئران السمنة زادت الجسم والأنسجة الدهنية البيضاء الأوزان مقارنة بالفئران التي تغذت ن. الجيش الملكي النيبالي المستخرجة باستخدام الفينول الحل أسفرت عن عينات بنقاوة جيدة. اللبتين هو أديبوكيني الدرجة الأولى التي تنتجها الأنسجة الدهنية وهو معرو...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL seringes
1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0)
22 G needles
26 G needles
75% Ethanol
Block heater (dry bath)
Chloroform	Sigma	C2432-500mL
dATP	Thermo scientific	R0141
dCTP	Thermo scientific	R0151
dGTP	Thermo scientific	R0161
DNase I (1 U/µl)	Thermo scientific	EN0521
dTTP	Thermo scientific	R0171
Faststart Universal SYBR green Master (Rox)	Roche	4913922001
Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye	Roche	4913914001
Filtered tips
Forceps	Instrumentarium	HB275
Gauze
Hammer
High fat rodent diet	Bio-Serv, Frenchtown, NJ	F3282
Isopropanol	Laboratoire MAT	IH-0101
Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM
Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM
Liquid nitrogen
Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer)	Thermo scientific	EP0742
Nanopure water (referred as ultrapure water)
Nitrile examination gloves
Nitrile gloves
Normal rodent diet	Harlan Laboratories, Madison, WI	Harlan 2018
P1000 pipetman
P2 pipetman
P20 pipetman
P200 pipetman
Phenol solution (TRIzol)	Ambion Life Technologies	15598018
Pre-identified aluminium foil
Quartz spectrophotometer cuvette
Rack for PCR tube strips
Racks for RT-PCR tube strips
Random hexamers	Invitrogen	58875
Real-time PCR Rotor Gene system	Corbett research	RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler
Refrigerated bench-top centrifuge
RiboLock RNase Inhibitor	Thermo scientific	EO0381
RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes
RNase-free 1.5 mL screw cap tubes
RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps
RNase-free water	Hyclone	SH30538.02
RT-PCR machine	Qiagen	Rotor-Gene Corbett 3000
RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps
S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM
S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM
Spectrophotometer	Biochrom	Ultrospec 3100 pro
Stainless steel mortar and pestle
Surgical pads	Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad
Surgical scissors	Intrumentarium	130.450.11
Thermal cycler
Thermal cycler	Biometra	Thermocycler
Vortex mixer
Weighing spatula