نظام ميكروبيوميتشانيكال لدراسة تشكيل فاريكوسيتي والانتعاش في محاور عصبية من الخلايا العصبية المركزية

Summary

ويصف هذا البروتوكول نهج السائل المضغوط فسيولوجيا ذات الصلة لتحريض فاريكوسيتيس في الخلايا العصبية السريعة وعكسها.

Abstract

Varicosities محواري هياكل الموسع على طول مهاوي من محاور عصبية بدرجة عالية من عدم التجانس. أنها موجودة فقط في العقول مع إصابات أو أمراض الأعصاب، بل أيضا في الدماغ العادي. هنا، نحن تصف نظام ذبابة المنشأة حديثا للحث على سرعة وموثوقية وعكسية محواري varicosities، مما يسمح لنا بفهم الآليات التي تحكم تشكيل فاريكوسيتي وتكوين البروتين غير متجانسة. ويمثل هذا النظام وسيلة مبتكرة لتقييم آثار إجهاد القص والضغط على الأقسام المختلفة سوبسيلولار من الخلايا العصبية، تختلف عن الأخرى في المختبر النظم التي تركز أساسا على تأثير تمتد. الأهم من ذلك، ونظرا للخصائص الفريدة لنظامنا، قدمنا مؤخرا اكتشاف رواية تبين أن تطبيق السائل المضغوط يمكن أن يستحث varicosities محواري من خلال تفعيل مستقبلات عابرة قناة المحتملة بسرعة وشكل قابل للعكس. ويمكن استخدام نظامنا النشاط الحيوي مريح في تركيبة مع نضح المخدرات وتصوير الخلايا الحية وتصوير الكالسيوم وتسجيل المشبك التصحيح. ولذلك، يمكن اعتماد هذا الأسلوب لدراسة قنوات أيون ميتشانوسينسيتيفي وتنظيم النقل محواري وديناميات cytoskeleton محواري، الكالسيوم إشارات وإصابة في الدماغ المتصلة بالصدمة التغييرات الشكلية.

Introduction

تشكيل فاريكوسيتي، أو تورم/الديكور، على طول محاور عصبية، سمة بارزة من نيوروديجينيريشن التي لوحظت في العديد من الاضطرابات أو إصابات الجهاز العصبي المركزي، بما في ذلك التصلب المتعدد، مرض الزهايمر، مرض باركنسون، والصدمات الدماغ إصابة^1،2. وعلى الرغم من الآثار الفسيولوجية ل varicosities محواري في نشر إمكانيات العمل وانتقال متشابك³، كيف يتم إنشاؤها في فاريكوسيتيس لا يزال غير معروف. في الآونة الأخيرة، استخدام الإنزيم ميكروبيوميتشانيكال المنشأة حديثا في الخلايا العصبية هيبوكامبال مثقف من القوارض، وجدنا أن المنبهات الميكانيكية يمكن أن تحدث فاريكوسيتيس في هذه الخلايا العصبية مع فضول ميزات عالية. أولاً، تحريض فاريكوسيتي السريع (< 10 ق) وهذه العملية لا يمكن عكسها بشكل غير متوقع. ثانيا، الشروع في فاريكوسيتي تعتمد على قوة ضغط النفخ: ارتفاع الضغط، والبدء بشكل أسرع. ثالثا، بدء فاريكوسيتي يعتمد على سن الخلايا العصبية. محاور عصبية من الخلايا العصبية الأصغر سنا تظهر أكثر استجابة للضغوط الميكانيكية، مقارنة بتلك الخلايا العصبية القديمة. رابعا، عرض النموذج فاريكوسيتيس على طول محاور عصبية الخلايا العصبية هيبوكامبال، بينما dendrites وشرائح إكسون الأولية من هذه الخلايا العصبية لا تغيير تحت نفس الشرط النفخ. وهكذا كشفت دراستنا سمة رواية من الأقطاب العصبية. هذه النتائج مع النظام في المختبر الناحية الفسيولوجية ذات الصلة. استخدام نموذج في فيفو لإصابات الدماغ الرضية خفيفة (mTBI)، واظهرنا أن varicosities محواري المتقدمة بطريقة تنسيق متعددة في قشرة somatosensory الفئران فورا بعد إغلاق الجمجمة أثر، اتساقا مع جهودنا في المختبر ⁴من النتائج. من المهم أن نلاحظ أن لدينا المصبوغة والتصوير من الفئران متبي توفر فقط رصاصة المفاجئة من التغييرات الشكلية العصبية، منذ أداء في فيفو الوقت الفاصل بين التصوير مورفولوجيا الخلايا العصبية خلال تأثير ميكانيكية لا تزال غير مجدية.

هذا نظام النفخ السائل أتاح لنا ليس فقط لالتقاط السمات الفريدة المرتبطة بتشكيل فاريكوسيتي الميكانيكية الناجمة عن الإجهاد، ولكن أيضا لتحديد الآلية الأساسية. عن طريق اختبار مختلف الحلول خارج الخلية، محصرات وفتاحات المرشحين مختلف قنوات أيون ميتشانوسينسيتيفي، والكهربية الخلوية، حددنا أن القناة الموجبة المحتملة عابر مستقبلات الفصيلية V الأعضاء 4 (TRPV4) القناة التي يسهل اختراقها إلى Ca^{2 +} و Na⁺ وتنشيطه بواسطة النفخ المسؤولة أساسا عن الكشف عن الإجهاد الميكانيكية الأولى أثناء تشكيل محواري فاريكوسيتي⁴. وأكد كذلك مع نهج siRNA خروج المغلوب. أخذت معا، هذا النظام الجديد للمقايسة وقد وضعنا مع ثقافة العصبية هيبوكامبال، هو قيمة للغاية لدراسة خصائص ذبابة الخلايا العصبية المركزية، لا سيما في تركيبة مع تقنيات أخرى.

هذا النظام ذبابة أنشأنا فريد من نوعه ويختلف عن النظم الموجودة سابقا في عدة جوانب رئيسية. أولاً، تجربة الخلايا العصبية في هذا النظام، الخروج من الطائرة الإجهاد الميكانيكية في أشكال الضغط والقص. خلال تأثير الميكانيكية، لا تزال تعلق على السطح ساترة العمليات العصبية ولا تتحرك. وهذا يختلف عن سائر نظم تنطوي أساسا على الانحناء وتمتد في الطائرة التجريبية (أو التوتر)، على سبيل المثال، مثل الانحراف من محاور عصبية المجمعة نقل سلاسل^5،6 أو تمتد محاور عصبية نمت في ميكروباتيرنيد القنوات والأغشية المط^7،8. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن varicosities محواري يمكن أن يتسبب أيضا في هذه الاختبارات مثل في نظامنا النفخ السائل، بعملية في هذه الإعدادات يأخذ وقتاً أطول بكثير (من 10 دقيقة إلى عدة ساعات^6،،من⁷⁸) ويظهر لا رجعة فيه. وأخيراً، يسمح نظامنا استخدام النفخ السوائل المحلية دراسة السمات المكانية لتشكيل فاريكوسيتي (مثلاً.، dendrites، العمود الفقري الجذعية، سوما، الأجزاء الأولى محواري، محطات محواري)، إلى جانب ميزاته الزمانية. باستخدام هذا النظام، فقد اكتشفنا عدة غير متوقعة وفريدة من نوعها ميزات تكوين محواري فاريكوسيتي، وبخاصة السريعة الحدوث، وعكس بطيئة، وقطبية إكسون-تغصن.

النظام أن نناقش في هذه الورقة متوافق مع العديد من تقنيات جزيئية وخلية علم الأحياء. على سبيل المثال، لدراسة آثار الإجهاد الميكانيكي على مورفولوجيا الخلايا العصبية ودالة، يمكن استخدامه جنبا إلى جنب مع كوكولتوري المايلين، الوقت الفاصل بين التصوير الرنين الفلورسنت نقل الطاقة (الحنق) وانعكاس الداخلية مجموع الأسفار (TIRF)، تصوير الكالسيوم، وتسجيل المشبك التصحيح. في هذه الورقة، ونحن نركز على العناصر الأساسية للنظام. ثقافة العصبية هيبوكامبال والإعداد النفخ السائل، وتصوير مرور الزمن ذات الدقة العالية للنقل محواري وتصوير الكالسيوم موضحة خطوة بخطوة أدناه.

Protocol

جميع الأساليب المذكورة أدناه عليها "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة ولاية أوهايو.

1-إعداد ساترة

1. ضع مربعات واحد أو أكثر من كوفيرسليبس 12 مم أو 25 مم داخل كوب زجاج الذي يحتوي على 70% وحمض النيتريك، واحتضان كوفيرسليبس في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: لا تغسل كوفيرسليبس 25 مم في الكأس نفسه كوفيرسليبس 12 مم. فمن الأفضل غسلها بشكل منفصل.
2. نقل جميع كوفيرسليبس في كوب 4 لتر مليئة 2.5 لتر من ddH₂س ويهز الكأس الذي يحتوي على كوفيرسليبس ح 1 100 لفة في الدقيقة. استخدام الأربطة المطاطية للاحتفاظ الكأس أثناء الهز. تكرار الشطف مع الطازجة 2.5 لتر ddH₂س أربع مرات.
3. نقل كوفيرسليبس تنظيفها قارورة جافة مع غطاء معدني. خبز كوفيرسليبس في فرن على 225 درجة مئوية ح 6 والسماح لها لتبرد بدرجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: ساترة 25 مم عرضه للكسر. فصل كوفيرسليبس واحداً تلو الآخر والهواء الجاف، ثم خبز لهم في فرن.
4. تخزين كوفيرسليبس المجففة وتنظيفها في درجة حرارة الغرفة في حاوية بلاستيكية معقمة حتى الاستخدام.
5. معطف كوفيرسليبس النحو التالي:
   1. إعداد حل طلاء جديد في أنبوب الطرد مركزي.
   2. ضع كل ساترة في بئر واحدة من صفيحة 24-جيدا (أو 6-جيدا). ضع 30 (أو 100) ميليلتر من محلول طلاء ساترة (الجدول 1) على ساترة 12 ملم (أو 25 مم) ودوامه. أضف 1 مل من المحلول الملحي العقيمة مخزنة الفوسفات (PBS، الصف زراعة الأنسجة) إلى البئر. هذه اللوحات يمكن أما استخدامها فورا أو تخزينها في 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني العقيمة لتصل إلى أسبوع.
   3. في اليوم للتشريح، قم بإزالة برنامج تلفزيوني. أيردري ووضع لوحات تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (30 وات) ح 2-4.
      ملاحظة: يجب إكمال الخطوة الأخيرة مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية على غطاء الاندفاق الصفحي ثقافة خلية. ينبغي أن ترفع باب هود قليلاً للسماح بتدفق الهواء لتجفيف في كوفيرسليبس.

2-التشريح والانفصال والثقافة هيبوكامبال الخلايا العصبية من الماوس/الفئران الحوامل

1. تشريح وتفكك الخلايا العصبية هيبوكامبال للثقافة
   1. ذوبان الجليد مبطلات الإنزيم الحل (3 ملغ/مل حوزتي 23 في SLDS، الجدول 1) والحارة قبل طلاء الوسائط (الجدول 2) عند 37 درجة مئوية.
   2. تشريح الحصين وشطف مع SLDS، وفقا للأساليب الموصوفة في المنشور السابق¹⁴.
      ملاحظة: توفر هيبوكامبي أربع خلايا كافية ل 24-بئر واحدة أو لوح 6-بئر واحد.
   3. إزالة SLDS، إضافة 2 مل من محلول إنزيم البروتياز، واحتضان العينة في 37 درجة مئوية، 5% CO₂ لمدة 15 دقيقة.
   4. أغسل explants الحصين مع 5-10 مل من الطلاء المتوسطة مرتين. إضافة 5 مل من تصفيح المتوسطة. ننأى explants هيبوكامبال إلى الخلايا المفردة التي تولد دوامة صغيرة باستخدام ماصة مع تلميح بلاستيك 1 مل. "الماصة؛" صعودا وهبوطاً نحو 40 مرة، وتجنب تكوين فقاعات الأكسجين، حتى يصبح الحل غائم ولا قطعة كبيرة من اكسبلانت لا تزال.
      ملاحظة: تذكر أن تترك بعض وسائل الإعلام خلال يغسل، ينبغي أن يظل explants هيبوكامبال المغمورة في المتوسط خلال العملية برمتها.
   5. الطرد المركزي الخلايا في 1,125 س ز للحد الأدنى 3 إزالة المادة طافية مع الخلايا مغمورة في وسائل الإعلام. ريسوسبيند الخلايا في 145 مل من تصفيح وسائل الإعلام. أضف 1 مل/جيدا من تعليق خلية لوح 24-جيدا (3 مل/بئر إلى لوحة 6-جيدا).
      ملاحظة: يستخدم مل 145 من تصفيح وسائل الإعلام لإنتاج تعليق خلية يحتوي على خلية منخفض كثافة. وسيسمح هذا الحجم طلاء الخلايا إلى ست لوحات 24-جيدا، وثمانية آبار 6 لوحات، أو تركيبات مختلفة من لوحات 24-6 جيدا أو اعتماداً على التجارب التي تجري. وسيكون كل من لوحة 24-جيدا جيدا حوالي 3 × 10⁴ خلايا⁹.
   6. احتضان الخلايا الموجودة في وسائل الإعلام والطلاء على 37 درجة مئوية، 5% CO₂ لح 2-4، ثم قم بإزالة جميع طلاء الوسائط واستبدالها بصيانة جديدة وسائل الإعلام.
   7. بعد 2 يوما (أيام 2 في المختبر، 2DIV)، يستعاض عن نصف وسائل الإعلام مع 2 ميكرومتر ارا-ج (أرابينوسيلسيتوسيني) حله في صيانة وسائل الإعلام الذي يمنع نمو الخلايا الليفية، الخلايا البطانية، والدبقيه. بعد تعريض الخلايا إلى ج ارا لمدة يومين، تحل محل وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام صيانة جديدة.
2. تعداء لتصور مورفولوجيا الخلايا
   ملاحظة: ترانسفيكت الخلايا مع ثوابت الفلورسنت البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل)، الأصفر فلوري البروتين (يفب)، مشري، إلخ لإلقاء الضوء مورفولوجيا الخلايا العصبية الفردية.
   1. يضعف بنيات من المخزون (1 ميكروغرام/ميليلتر) إلى وسائط MEM غروب (0.8 ميكروغرام بناء في 50 ميليلتر من وسائل الإعلام الفنزويلية غروب) ودوامه. إعداد إضعاف بنية 1 لكل بئر.
      ملاحظة: يتطلب صفيحة 24-جيدا 0.8 ميكروغرام لبناء في 50 ميليلتر من وسائل الإعلام الفنزويلية غروب. لوحة 6-جيدا يتطلب 2.4 ميكروغرام لبناء 150 ميليلتر غروب-الفنزويلية الإعلام.
   2. تمييع تعداء الحويصلية بوساطة كاشف غروب-الفنزويلية وسائط الإعلام (1.5 ميليلتر من تعداء الكاشف في 50 ميليلتر من وسائل الإعلام الفنزويلية غروب) ودوامه. إعداد تمييع تعداء 1 لكل بئر.
      ملاحظة: صفيحة 24-جيدا يتطلب 1.5 ميليلتر من تعداء الكاشف في 50 ميليلتر من وسائل الإعلام الفنزويلية غروب. لوحة 6-جيدا يتطلب 4.5 ميليلتر من تعداء الكاشف في 150 ميليلتر من وسائل الإعلام الفنزويلية غروب.
   3. إعداد خليط 1:1 (100 ميليلتر) بناء في كاشف الإعلام وتعداء غروب-الفنزويلية في وسائل الإعلام الفنزويلية غروب ودوامه. احتضان هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: الواحد جيدا، ينبغي أن يكون هناك حوالي 100 ميليلتر من محلول يحتوي على بنية وكاشف تعداء ميديا غروب-الفنزويلية في حالة استخدام لوحة 24-جيدا (300 ميليلتر للوحة 6-جيدا).
   4. إزالة نصف من وسائط الإعلام (500 ميليلتر للوحة 24-حسنا، 1.5 مل للوحة 6-جيدا) من كل بئر ونقل هذه الوسائط في أنبوب مخروطي نظيفة. يبقى هذا الأنبوب في الحاضنة. ثم أضف خليط 100 ميليلتر (الخطوة 2.2.3) إلى وسائط الإعلام المتبقية في البئر. السماح للخلايا لاحتضانها في 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة.
   5. أثناء الاحتضان (الخطوة 2.2.4)، إضافة إلى حجم واحد وسائط صيانة جديدة لوسائط الإعلام في الأنبوبة المخروطية (الخطوة 2.2.4). ضع الخليط في نفس الحاضنة (37 درجة مئوية و 5 في المائة من أول أكسيد الكربون₂).
   6. الحضانة، وبعد إزالة جميع الوسائط التي تحتوي على الحل تعداء من الآبار واستبداله بخليط 1:1 القديمة وصيانة جديدة وسائل الإعلام في الأنبوبة المخروطية (الخطوة 2.2.5).
      ملاحظة: تبعاً للحجم من بنيات، الخلايا قد يبدأ التعبير عن ضمن ح 12؛ لثوابت أكبر، قد تكون هناك حاجة 3-4 أيام قبل التوصل إلى ذروة التعبير عن بنيات.

3-إعداد الجهاز ماصة النفخ

ملاحظة: هناك خمسة مكونات أساسية لهذا التشكيل: ماصة زجاجية والأنابيب والمحاقن، وميكرومانيبولاتور والمخزن المؤقت (هانك). ويمكن استخدام أي مخزن مؤقت يحتوي على تركيزات الملح فسيولوجيا ذات الصلة في هذا التشكيل.

1. سحب ماصة البورسليكات أن يكون حولها نصيحة افتتاح 45-ميكرومتر-قطر استخدام ساحبة ميكروبيبيتي والمواصفات الواردة في الجدول 3.
   ملاحظة: وقد وجد أن 45 ميكرومتر حجم مناسب لقطر ماصة فتح تحت ظروف تجريبية. اختلافات طفيفة في حجم افتتاح يجب أن لا تؤثر تأثيراً كبيرا على النتائج. من المهم ملاحظة أن أكبر حالات الخروج على هذا العدد ينبغي أن لا تزال تعمل لتحريض فاريكوسيتي بضبط ارتفاع المحاقن مرتبط الماصة عبر الأنابيب، لكن هذا يتطلب تقويم قيمة الضغط.
2. إدراج نهاية الأمم المتحدة سحبت ماصة أنابيب مطاطية رقيقة.
   ملاحظة: يجب أن يكون الجدار أنابيب رقيقة وصلبة لتقليل المقاومة السوائل، والتأكد من أن ارتفاع المحاقن طرديا مع ضغط السوائل التي تتدفق من خلال ماصة مع مقاومة ضئيلة. ينبغي أن يكون الأنبوب لم يعد من تقليل حوالي 0.6 متر في الطول إلى مواصلة المقاومة.
3. الاتصال الطرف الآخر من الأنبوب حقنه بلاستيكية 10 مل عبر موصل بصمام قادر على تشغيل.
   ملاحظة: يحتاج المحاقن البلاستيكية التي ستعقد في ارتفاع مستمر، وقابلة للقياس لضمان مقياس دقيق للضغوط المفترضة النابعة من ماصة. وقد استخدم ارتفاع 190 مم، منذ هذا يوفر الحد الأدنى من الضغط ولكن موثوق بها يدفع varicosities في محاور عصبية. كما يمكن استخدام قيم الارتفاع أخرى إذا كان الضغط الذي يسبب الخلايا لفصل من السطح ساترة. من المستحسن استخدام نفس الإعداد في جميع أنحاء هذه التجربة.
4. إدراج الماصة في أعلى المسمار ميكرومانيبولاتور عقد الماصة في مكانها. المسمار المسمار وتصدرت المعادن، شقة مرفق الذراع ميكرومانيبولاتور وبذلك فإنه يحمل الأمم المتحدة سحبت نهاية ماصة فقط أعلاه حيث تم إرفاق أنابيب المطاط. زاوية الماصة بزاوية 45 درجة مع سطح كوفيرسليبس التي تحتوي على الخلايا العصبية.
   ملاحظة: ينبغي بناء ميكرومانيبولاتور حيث أن تعقد الماصة دون تقيد أنابيب مطاطية. يجب أن تسمح ميكرومانيبولاتور حركة الماصة في x و y، و z الاتجاهات بدقة موقف أنها داخل نطاق من الخلايا. فيما يلي رسم فضلا عن صورة فوتوغرافية للجهاز (الشكل 1).
5. قم بتشغيل عامل تصفية الأسفار، وافتح الفتحة وضمان يمكن رؤية بقعة فلورسنت القادمة من خلال الهدف. تستخدم في ميكرومانيبولاتور، نقل الماصة في وضع خطوط التلميح مع بقعة الفلورسنت والسفلي الماصة في موضع أعلى الارتفاع الطبق ثقافة الخلية (35 مم × 10 مم). مرة واحدة وهو تشغيل الضوء المنقولة في الموقف، وإيقاف الأسفار.
6. استخدام الملقط، إضافة واحدة ساترة (مع الخلايا مواجهة اتجاه الماصة) من لوحة الثقافة الخلية إلى الطبق ثقافة الخلية التي تحتوي على حوالي 2 مل من المخزن المؤقت هانك في درجة حرارة الغرفة.
7. ضع الطبق الثقافة التي تحتوي على ساترة على النطاق.
8. استخدام مقبض التركيز الجميلة و 20 X الهدف، تركز على متن طائرة يتحول كامل حوالي أربعة أعلاه الخلايا (حوالي 0.4 مم). استخدم في ميكرومانيبولاتور لوضع طرف ماصة حيث أنها تركز وفي الوسط، الجانب الأيسر من الطائرة كما يتضح من خلال العين-القطع.
   ملاحظة: يتم Dendrites الإسقاطات التي ينبغي أن تكون في نفس الإطار كنص الخلية تنشأ من. للحث على محواري varicosities، ينبغي أن أحد اتبع إسقاطات أطول من جسم الخلية إلى محاور عصبية الآنسي والبعيدة.

4-معايرة ضغط ماصة استخدام نظام المط الغشاء

1. إعداد أجهزة ماصة النفخ بالضبط نفس المعلمات كما هو موضح أعلاه على نظام يحتوي على غشاء سيليكون ميكروفابريكاتيد (500 ميكرومتر في القطر) و 50 ميكرومتر سميكة وتركيز المجهر على سطح الغشاء.
   ملاحظة: تم تصميم هذا النظام لقياس قيم الضغط الصغيرة وتفسيراً لهذا النظام وقد صدرت قبل¹⁰. هذا القياس يحتاج فقط إلى أن يتم مرة واحدة للنفخ التجارب إذا تم استخدام نفس الإعداد الدقيق للنفخ.
2. التركيز المجهر على صفائف ميكرودوتس (4 ميكرومتر في القطر) و 10 ميكرون وبصرف النظر، كما يقاس بين المراكز. تشغيل صمام إيقاف وتسمح للسائل بالتدفق خارج الماصة. دراسة انحراف الغشاء استجابة لضغط السائل مع مجهر [كنفوكل].
3. استخدام نموذج خطي لتحديد الضغط المقابلة المرتبطة بانحراف الغشاء.
   ملاحظة: في حين مؤخرا دراسة وجدت أن انحراف ث =-3.143 مكم ± 0.69 تم الحصول عليها للارتفاع حقنه 190 مم، أدى ضغط من 0.25 ± 0.06 nN/ميكرون² من إعداد ماصة الحالي، الذي يقع ضمن نطاق الفسيولوجية والمرضية، على الرغم من ارتفاع حقنه ليست الجهة الوحيدة التي تحدد. عوامل أخرى تؤثر على قيمة الضغط المحدد في الخلايا العصبية، وكذلك، بما في ذلك ماصة فتح، وتحديد المواقع (نصف القطر والزاوية) من طرف الماصة بالنسبة للخلايا، وحتى مرونة الأنابيب^4،10.

5-النفخ للحث على فاريكوسيتيس

1. مرة واحدة الماصة في الموقف، تركز المجهر على متن طائرة يحتوي على منطقة الفائدة. موقف الخلايا والعمليات في النصف الأيسر من مجال التصوير (ينظر بالتقاط مباشرة من الكاميرا) داخل منطقة النفخ، في حين أن النصف الأيمن خارج مجال النفخ.
   ملاحظة: بسبب ثمرة واسعة من محاور عصبية و dendrites من الخلايا العصبية، أنها من المحتمل أن جميع عمليات خلية داخل نفس المنطقة الوعيد. وهذا هو في الواقع ميزة واحدة لهذا النظام، الذي يسمح لدراسة الأثر المحلي للنفخ. هناك نوعين من النفخ التي يمكن أن تستخدم للحث على فاريكوسيتيس: طول مدة النفخ والنفخ النبض.
2. النفخ
   1. طول مدة النفخ
      1. ضع المحاقن في الارتفاع، ومثقف ملم 190 أعلاه ساترة التي تحتوي على الخلايا العصبية⁴. يبدأ الوقت الفاصل بين التصوير في مجال الاهتمام بوقت تعرض أمثل الكشف عن مورفولوجيا الخلايا العصبية واضحة. التقاط إطارات 15 على الأقل في فاصل s 2 (مجموع ق 30) كخط الأساس. يمكن ضبط الفاصل الزمني استناداً إلى التجربة. في الإطار 16، فتح صمام إيقاف دورة تمكن من المحاقن وتسمح للسائل بالتدفق لإطارات 75 (150 ق). في الإطار 75، الصمام إيقاف تشغيل حيث أن تدفق السائل توقف. إيقاف التقاط الفيديو.
         ملاحظة: هذا ينبغي الحث على varicosities محواري في الخلايا العصبية في 7-9 DIV داخل s 5-10، بينما الخلايا العصبية القديمة يستغرق وقتاً أطول بشكل فاريكوسيتيس.
   2. النفخ النبض (2 s المدة)
      1. ضع المحاقن في الارتفاع المناسب (190 مم). يبدأ الوقت الفاصل بين التصوير والتقاط إطارات على الأقل 15 (30 ق) في فاصل s 2. في الإطار 16، فتح الصمام المحاقن وتسمح للسائل بالتدفق، ثم إغلاق الصمام بعد 2 s الانتظار 5-20 س. (اعتماداً على تكرار اختبار) قبل فتح الصمام مرة أخرى. تكرار فتح وإغلاق الصمام لإنشاء نبضات السوائل، وتستمر لفترة مجموعها 150-300 س. متابعة الوقت الفاصل بين التصوير لمدة 20 دقيقة لالتقاط مرحلة الانتعاش.
         ملاحظة: عندما يكون الفاصل الزمني أطول من 10 ق، البقول حمل كبير أقل فاريكوسيتيس. في فاصل s 20، يمكن فعل لا varicosities البقول⁴. للحصول على تكوين فاريكوسيتي موثوقة ومتسقة، ينصح بارتفاع حقنه ينبغي أن يكون حوالي 190 مم. ارتفاع المحاقن وينبغي عدم زيادة ضغط السائل نقطة حيث تبدأ الخلايا فصلها من السطح ساترة.
   3. قبل يوم استخدام، تنظيف الهيكل (ماصة، والأنابيب، والمحاقن) بتدفق حوالي 10 مل 70 ٪ الإيثانول من خلال إقامة. بعد الإيثانول يغسل، تدفق 10 مل من المخزن المؤقت في هانك (أو المخزن المؤقت المطلوب) من خلال الإعداد رئيس النظام للاستخدام في ذلك اليوم. بعد التجارب النهائية لهذا اليوم، بتنظيف الهيكل كالموصوفة سابقا مع الإيثانول لمنع نمو الملوثات بين عشية وضحاها.

6-المدح والأساليب

ملاحظة: يمكن الجمع بين التحليل النفخ مع مجموعة متنوعة من التقنيات المختلفة التي تمت مناقشتها في المقطع مقدمة. وهنا، ينصب التركيز على التقنيات الأساسية التي تستخدم في معظم الأحيان جنبا إلى جنب مع تحليل النفخ، بما في ذلك التصوير timelapse الفلورية ذات الدقة العالية، وتصوير الكالسيوم، وفحوصات الانتعاش. وتناقش هذه أدناه.

1. إجراء تصوير مرور الزمن الفلورسنت ذات الدقة العالية باتباع البروتوكول أدناه
   1. تتبع حركة معلم فلوريسسينتلي البروتينات داخل الخلايا العصبية مع 100 × عدسة النفط. هي transfected الخلايا العصبية مع بناء كدنا السليم. التقاط إطارات 150 (إجمالي 300 s) مع فاصل s 2.
      ملاحظة: في بعض الأحيان، يتم تنفيذ متعددة الألوان الوقت الفاصل بين التصوير لصورة حركة البروتين فلوريسسينتلي معلم واحد أو أكثر في وقت واحد.
   2. توليد كيموجراف أما عن طريق الفيديو التقاط البرمجيات أو عن طريق إيماجيج (المعاهد الوطنية للصحة).
      ملاحظة: سرعة واتجاه السفر يمكن تحديد استخدام في كيموجراف. * تأكد من ملاحظة الاتجاه يكمن سوما من المنطقة التقاط. السفر نحو سوما إلى الوراء، بينما هو السفر بعيداً عن سوما إلى نصيحة محواري anterograde.
   3. كرر هذه العملية عقب النفخ، أو كيموجراف يمكن إنشاؤها باستخدام التقاط الصور أثناء فحص النفخ.
      ملاحظة: عرضت آثار النفخ في النقل محواري الميتوكوندريا والبروتينات متشابك في ورقة الأخيرة⁴.
2. تصوير الكالسيوم
   1. أضف 1 ميليلتر (للوحة 24-جيدا) أو 3 ميليلتر (للوحة 6-جيدا) 5 مم فلوو-4 صباحا إلى ثقافة الإعلام في أحد جيدا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   2. تغسل الخلايا مرتين مع المخزن المؤقت 1 مل هانك.
      ملاحظة: الخلايا العصبية تحميل تنبعث منها الفلورية الخضراء من خلال مجموعة تصفية فيتك. الدلالة المكاني مناطق ملموس الكالسيوم داخل الخلية. عندما جنبا إلى جنب مع النفخ، يمكن ملاحظة حدوث زيادة في كثافة (زيادة في مستوى الكالسيوم الداخلية).
3. استرداد فاريكوسيتي
   ملاحظة: فورا بعد تجربة النفخ، تجربة انتعاش 20 دقيقة يمكن أن تنفذ.
   1. التقاط صور لإطارات 300 (1,200 s) مع فاصل s 4.
      ملاحظة: خلية transfected مع القابلة للذوبان يفب/مشري/التجارة والنقل ينبغي إظهار مستوى معتدل (أقل من 50%) من الانتعاش قبل نهاية الدورة التصوير. محواري الانتعاش يعتمد على عدد من العوامل، مثل مرحلة النمو للخلايا العصبية مثقف⁴. هذا يمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع التصوير الفلورسنت ذات الدقة العالية وتصوير الكالسيوم الموصوفة أعلاه.

النتائج

قبل النفخ، تظهر محاور عصبية عادة تشكيل فاريكوسيتي قليلاً. النفخ التالية مع ضغط لدينا القياسية (190 mmH₂س الارتفاع)، بدء محاور عصبية لتطوير العديد من مثل حبة فاريكوسيتيس. تشكيل فاريكوسيتيس عكسها جزئيا، كما هو موضح بمناطق إكسون تعود إلى حالتها قبل ينفخ بعد فترة استرداد 1...

Discussion

يتم إجراء هذا الفحص ميكروبيوميتشانيكال على التوالي إلى الأمام. سوف ينتج نتائج يمكن الاعتماد عليها، إذا كانت جميع خطواتها تنفذ بعناية. وهناك العديد من الخطوات الرئيسية التي، إذا كان أداؤها غير سليمة، وسوف تعوق جمع البيانات الناجحة. تبدأ الخطوات الحاسمة المنبع للتطبيق الفعلي للتحفيز الوع?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 mm coverslips	Warner Instruments	64-0702	for 24-well plate
25 mm coverslips	Fisher Scientific	12-545-102	for 6-well plate
Acetic acid	Fisher Scientific	A38-212
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
Rat tail collagen	Roche	11 179 179 001
10X PBS	National Diagnostics	CL-253
Na2SO4	Fisher Scientific	S373-500
K2SO4	Fisher Scientific	P304-500
HEPES	Fisher Scientific	BP410-500
D-glucose	Fisher Scientific	D16-500
MgCl2	Fisher Scientific	BP214-500
NaOH	Fisher Scientific	SS255-1
Protease enzyme	Sigma	P4032
FBS	Gibco	26140
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070
L-glutamine	Gibco	25030081
Penicillin/Streptomycin 100x (P/S)	Gibco	15140122
MEM Earle's Salts	Gibco	11090
B27 supplement	Gibco	17504-044
Neurobasal	Gibco	21103-049
Arabinosylcytosine (Ara-C)	Sigma	147-94-4
Opti-MEM media	Gibco	31985-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	1854313	transfection reagent
Borosilicate rods	World Precision Instruments Inc.	PG52151-4	for puffing pipette
rubber tubing	Fisher Scientific	14-169-1A
10cc plastic syringe and plunger	Becton Dickinson
micromanipulator	Sutter Instruments
NaCl	Fisher Scientific	S640-3
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
CaCl2	Fisher Scientific	C70-500
Cell culture dish (35 mm x 10 mm)	Corning	3294
Fluo-4 AM	Molecular Probes	F14201	for calcium imaging
Mito-YFP construct	Takara Bio Inc.		for cell transfection
YFP-N1 construct	Takara Bio Inc.		for cell transfection
Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette puller	Sutter Instruments
Eclipse TE2000-U Mcroscope	Nikon
Plan Fluor ELWD 20x lens	Nikon	062933	objective
Apo TIRF 100x/1.49 oil lens	Nikon	MRD01991	objective