JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هذا البروتوكول يتيح للقارئ لتحليل تكوين بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراوية في مسببات الأمراض المعوية باستخدام نهج متعدد الأوجه لالتقاط الطابع الدينامي للأغشية الحيوية البكتيرية بتقييم التقيد بتشكيل المصفوفة خارج الخلية مادة البوليمر، والتشتت.

Abstract

تشكيل بيوفيلم هو عملية دينامية ومتعددة المراحل التي تحدث في البكتيريا تحت ظروف بيئية قاسية أو أوقات الشدة. لمسببات الأمراض المعوية، هو فعل استجابة كبيرة من إجهاد أثناء العبور الجهاز الهضمي وعند التعرض الصفراء، عنصرا عادياً من الهضم البشرية. للتغلب على آثار جراثيم الصفراء، تشكل العديد من مسببات الأمراض المعوية بيوفيلم العينة للسماح بالبقاء على قيد الحياة عندما تمر عبر الأمعاء. وهنا يقدم منهجيات تحديد تشكيل بيوفيلم عن طريق فحوصات الالتزام المرحلة الصلبة، فضلا عن كشف المصفوفة خارج الخلية مادة البوليمر (EPS) والتصور. وعلاوة على ذلك، يرد بيوفيلم تشتت التقييم لتقليد تحليل الأحداث التي تسبب إطلاق سراح بكتيريا أثناء عملية العدوى. صبغة الكريستال البنفسجي يستخدم للكشف عن البكتيريا ملتصقة في مقايسة التزام الفائق 96-جيدا لوحة. تقييم إنتاج EPS يتحدد بفحوصات اثنين، هما مجهرية تلطيخ مصفوفة EPS وتحليل شبه كمي مع يكتين ملزمة السكاريد مترافق فلوريسسينتلي. وأخيراً، وتشتت بيوفيلم يقاس من خلال التهم مستعمرة والطلاء. بيانات إيجابية من فحوصات متعددة دعم توصيف الأغشية الحيوية، ويمكن أن تستخدم لتحديد تكوين بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراوية في السلالات البكتيرية الأخرى.

Introduction

تشكيل بيوفيلم استراتيجية بقاء بكتيرية هامة التي يسببها خلال الظروف البيئية القاسية. التعرض لمركبات جراثيم مثل المضادات الحيوية أو التغييرات في المغذيات أو توافر الأوكسجين يدفع دولة أكد في البكتيريا التي يمكن تخفيفها من خلال تشكيل بيوفيلم. بيوفيلم يتسم بمرفق البكتيرية إلى سطح أو غيرها البكتيريا ومصحوبا بإفراز مصفوفة EPS تتألف أساسا من السكريات1،،من23. تشكيل بيوفيلم هو عملية دينامية الذي يتوج سلسلة أحداث في تشكيل مجتمع ناضج بكتيرية ملتصقة1،2،3. البكتيريا تنتج أدهيسينس لتيسير مرفق المبكر بينما تتحول ملامح التعبير الجينات أدهيسين لتعزيز مرفق أثناء النضج بيوفيلم. في الوقت نفسه، يحدث إنتاج EPS إلى معطف المجتمع البكتيري في مصفوفة لحماية الخلايا من الضغوطات الأولية. البكتيريا الواردة داخل بيوفيلم هي بطيئة النمو؛ وعلى هذا النحو، يجعل معظم المضادات الحيوية غير فعالة. وعلاوة على ذلك، يحفظ بطء نمو الطاقة حتى تتغير الظروف لصالح النمو البكتيري1،،من23. بعد أن مرت ظروف قاسية، تفريق بيوفيلم البكتيريا واستئناف حياة العوالق1،2،3. تقليديا، الأغشية الحيوية لوحظت على السطوح وتمثل تحديا سريرية مستمرة سبب الإصابة الخزانات الحالية في القسطرة وفي مسكن الأجهزة1،،من23.

ووصفت تشكيل بيوفيلم مؤخرا لعدة مسببات الأمراض المعوية؛ البكتيريا التي تصيب الأمعاء الدقيقة أو القولون4. للأنواع دوسنتاريا ، العدوى يحدث في القولون البشرية بعد عبور من خلال معظم الجهاز الهضمي. أثناء المرور عبر الأمعاء الدقيقة، يتعرض دوسنتاريا الصفراء؛ منظفات اللاإنسانية الدهن ويفرز في الأمعاء لتسهيل الهضم الدهون بينما قتل معظم البكتيريا5في وقت واحد. مسببات الأمراض المعوية بقدرة فريدة على مقاومة آثار جراثيم الصفراء6. استخدام لدينا التحليل مؤخرا في فيفو--مثل تركيبات من الجلوكوز وأملاح الصفراوية لإثبات تكوين بيوفيلم قوية في فليكسنيري س. وكذلك الأنواع الأخرى المسببة للأمراض دوسنتاريا، الإشريكيّة القولونية، و السالمونيلا4. سابقا، سرفار انتيريكا السالمونيلا التيفية أبدى لتشكيل بيوفيلم المستحثة الصفراوية بسبب استعمار فريدة من المرارة أثناء العدوى المزمنة7،،من89، 10. بالإضافة إلى ذلك، أثبتت البحوث السابقة مع الضمة11والعطيفه12 بيوفيلم تشكيل استجابة الصفراء. ولذلك، التحليلات الموسعة الملاحظات تشكيل بيوفيلم المستحثة الصفراء لمسببات الأمراض الأخرى وتساعد في إقامة مظاهرة رد الممرض المعوي يحافظ على الصفراء. خلافا للأغشية الحيوية المزمنة التي الجينات البكتيرية النسخ محدودة ويمكن أن تحدث الشيخوخة الخلية1،2،3، نقترح أن بيوفيلم التي يسببها الصفراوية المعوي أكثر عابرة في الطبيعة. هذه العابرة، بيوفيلم ضراوة هو المدموغة بتفكيك سرعة (كما رأينا في تحليل التشتت) وتعزيز التعبير الجيني الفوعة لوحظت في4،السكان بيوفيلم6. 

كما تشكيل بيوفيلم هو عملية متعددة الأوجه، ودينامية، واستخدام أملاح الصفراوية كعامل التفجير تم وصف مؤخرا لمسببات الأمراض المعوية الأكثر فقط، الأدوات والتقنيات المستخدمة تطبيقات فريدة من نوعها ومبتكرة من الأساليب التقليدية. وهكذا، المعروضة هنا ثلاث استراتيجيات مجانية لقياس العديد من الخصائص الهامة لتشكيل بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراوية، بما في ذلك التقيد البكتيرية، إنتاج مصفوفة EPS، وتشتت من البكتيريا قادرة على البقاء من بيوفيلم. وقد استخدمت هذه التقنيات أساسا للبحث مع دوسنتاريا؛ وبالتالي، تقييم مسببات الأمراض المعوية الأخرى قد تتطلب التحسين. ومع ذلك، بيانات إيجابية من جميع الاختبارات الثلاثة دعم تحديد الأغشية الحيوية ووضع بروتوكولات استنساخه لتشكيل بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراوية.

Protocol

1-إعداد الكواشف

  1. الأملاح الصفراء المتوسطة: إعداد مرق الصويا تريبتيك (TSB) التي تحتوي على أملاح الصفراوية 0.4% (الوزن/الحجم)، ريسوسبيند 200 ملغ أملاح الصفراوية في 50 مل TSB يعقم. تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر. جعل متوسطة جديدة أسبوعيا.
    الملاحظات: أملاح الصفراء التي تستخدم بشكل روتيني خليط 1:1 كوليت الصوديوم والصوديوم ديوكسيتشولاتي معزولة عن جالبلاديرس الأغنام والأبقار. كما هو موضح سابقا4، كان وجود الجلوكوز المطلوب لتشكيل بيوفيلم التي يسببها الملح الصفراوية. وقد أضيف TSB الجلوكوز بالنسبة مرق لوريا بيرتاني (رطل)؛ ولذلك ليس كافياً للحث على تشكيل بيوفيلم دوسنتاريا ومسببات الأمراض المعوية الأخرى تحليلها. قد يلزم تبعاً للبكتيريا تحليلها، تركيزات الجلوكوز مختلفة أو متطلبات مختلفة من السكر.
  2. 0.5% w/v الكريستال البنفسجي في المياه: حل 2.5 g من الكريستال البنفسجي في 500 مل مقطر من الماء. تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر.
  3. كونكانافالين A (كونا) يضاف إلى fluorescein isothiocyanate (فيتك): إعادة تشكيل المخزون في برنامج تلفزيوني 1 x. تمييع الأسهم 10 ملغ مركزة مع 400 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني 1 x إلى تركيز نهائي من 25 ميكروغرام/مل، وحماية من الضوء.
  4. برنامج تلفزيوني + الجلوكوز: يحل الجلوكوز ز 0.2 في برنامج تلفزيوني 1 x 10 مل (2% w/v الجلوكوز النهائي). تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر. جعل الطازجة في يوم الاستخدام.
  5. برنامج تلفزيوني + أملاح الصفراء: حل 40 مغ في برنامج تلفزيوني 1 x 10 مل (0.4% w/v الصفراوية أملاح النهائي). تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر. جعل الطازجة في يوم الاستخدام.
  6. برنامج تلفزيوني + الجلوكوز والأملاح الصفراوية: تذوب الأملاح الصفراوية 40 مغ والسكر ز 0.2 في برنامج تلفزيوني 1 x 10 مل (0.4% w/v الأملاح الصفراوية و 2% w/v الجلوكوز النهائي). تصفية تعقيمها باستخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر. جعل الطازجة في يوم الاستخدام.
  7. إعداد لوحات أجار رطل.
  8. إصلاح فورمالدهايد/جلوتارالديهيدي: 810 إضافة ميليلتر فورمالدهايد (حل الأسهم 37%، 3% تركيز النهائي) و 125 glutaraldehyde ميليلتر (حل الأسهم 25%، وتركيز 0.25% النهائي) إلى برنامج تلفزيوني 1 x مل 14. مزيج دقيق وتخزينها في 4 درجات مئوية. يجب أن يكون الإصلاح الباردة للاستخدام الصحيح.
    تنبيه: الإصلاح هو السامة ويتطلب التخلص من النفايات الخطرة.
  9. الحل مونتانت أنتيفادي: استخدام محلول مونتانت أنتيفادي يحتوي على 4,6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) وصمة عار لتمنع فوتوبليتشينج عينات مجهرية إيمونوفلوريسسينت أثناء فلوريسسينتلي تلطيخ الحمض النووي للبكتيريا.

2-إعداد البكتيريا

  1. تنمو الثقافات بين عشية وضحاها من السلالات البكتيرية لفحصها بتطعيم 3 مل TSB مع مستعمرة وحيدة ومعزولة جيدا في أنبوب ثقافة عقيمة. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز 225 لفة في الدقيقة للحضانة بين عشية وضحاها (ح 16-24).
    ملاحظة: سلالات ينبغي أن يكون ريستريكيد من الأرصدة المجمد كل 2 إلى 4 أسابيع، وحافظت على لوحات لا أكثر من 2 أسابيع من العمر.

3-المرحلة الصلبة التقيد بالانزيم

ملاحظة: هذا التحليل الكمي البكتيريا ملتصقة باستخدام أسلوب لوحة 96-جيدا. وتزرع البكتيريا بشكل ثابت في لوحات مسطحة القاع. يتم تنفيذ عملية الغسيل لإزالة البكتيريا غير ملتصقة والبكتيريا ملتصقة ملطخة بالكريستال البنفسجي. وصمة الكريستال البنفسجي يربط بيبتيدوجليكان في جدار الخلية البكتيرية، ويمكن أن يكون سولوبيليزيد باستخدام الإيثانول. يتم تحديد العدد البكتيريا ملتصقة استناداً إلى الاحتفاظ بالكريستال البنفسجي.

  1. إعداد أنبوبين 1.5 مل. قم بتسمية مع لجان أو لجان + الأملاح الصفراوية (درجة البكالوريوس).
  2. أضف 1 مل من لجان أو لجان + بكالوريوس للأنابيب الخاصة بكل منها.
  3. تلقيح الأنابيب مع 20 ميليلتر للثقافة بين عشية وضحاها (في 01:50 إضعاف).
  4. في صفيحة 96-جيدا العقيمة، واضحة، مغلوطاً، المعالجة بزراعة الأنسجة، إضافة 130 ميليلتر/جيدا لمراقبة أونينوكولاتيد وسائل الإعلام إلى ثلاثة آبار ليكون بمثابة عنصر التحكم فارغاً. قم بإعداد ثلاثة آبار مراقبة لكل نوع من أنواع الوسائط (TSB و TSB + بكالوريوس) لفحصها.
  5. إضافة 130 ميليلتر/جيدا من الثقافة الملقحين في ثلاثة آبار، وكرر حتى يتم مطلي بكافة الشروط التجريبية في ثلاث نسخ.
  6. احتضانها ح 4-24 في 37 درجة مئوية بشكل ثابت.
  7. استخدام قارئ لوحة، سجل OD600. آبار مراقبة ك 'فارغة'. تأكيد المتوسطة التحكم الواضح مع أي دليل على التعكر. إذا تم الكشف عن أي التعكر، تجاهل هذه التجربة. يمكن استخدام قيم600 OD تطبيع البيانات إذا كانت هناك اختلافات كبيرة في معدل النمو بين السلالات البكتيرية.
  8. إزالة المتوسطة الثقافة باستخدام خط فراغ بإمالة اللوحة بلطف وبطء يسفط المتوسط عند الحافة السفلي من البئر. تأكد من جمع جميع المتوسط الثقافة دون تعطيل السكان بكتيرية ملتصقة الموجود على سطح البلاستيك. إذا كان إنتاج مصفوفة EPS خلال فترة حضانة المرض، سوف يمكن تصور المصفوفة ترسبات بيضاء. عدم الإزعاج المصفوفة EPS.
  9. تغسل برفق الآبار مرة واحدة مع 200 ميليلتر PBS العقيمة. قم بإزالة برنامج تلفزيوني الغسيل باستخدام خط فراغ.
  10. عكس اللوحة لتجف. يسمح كحد أدنى من 20 دقيقة الجاف.
    ملاحظة: حيث يجب أن تجفف بيوفيلم دقة قبل التلوين، البروتوكول يمكن أن تكون متوقفة مؤقتاً في هذه الخطوة لبضع ساعات أو حتى ليلة وضحاها. وقت التجفيف وأضاف لن يغير هذا الإجراء المصبوغة بينما التجفيف غير مكتملة سوف تؤثر على القياس الكمي للنتائج وإمكانية تكرار نتائج.
  11. إضافة 150 ميليلتر بنفسجي كريستال 0.5% لكل التجارب والتحكم جيدا.
  12. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
  13. غسل الآبار مرة واحدة مع 400 ميليلتر من الماء المقطر. وحدة التخزين المضافة يساعد على إزالة البقع المتبقية الكريستال البنفسجي من الجانبين من الآبار. إزالة الغسيل مع خط فراغ.
  14. غسل الآبار خمس مرات مع 200 ميليلتر من الماء المقطر. إزالة الغسيل مع خط فراغ.
    ملاحظة: المهم غسيل شامل للقياس الكمي. عندما تكون واضحة من الماء المقطر الآبار فارغة ولا تحتوي على أي وصمة عار المتبقية الكريستال البنفسجي، تابع إلى الخطوة التالية.
  15. عكس اللوحة لتجف، محمية من الضوء. ضمان التجفيف الكامل لصفيحة كما ذكر أعلاه.
  16. ديستاين الآبار مع 200 ميليلتر من الإيثانول 95%. احتضان لوحة على شاكر لمدة 30 دقيقة. لتجنب التبخر، وبخاصة عند درجات حرارة أعلى، بإجراء هذه الخطوة في 4 درجات مئوية.
  17. استخدام قارئ لوحة، سجل OD540.
    ملاحظة: الطول الموجي لامتصاص الحد الأقصى من البنفسجي كريستال بالقرب من 590 نانومتر. تقارير الأدب مجموعة من التفجير المكشوف540 -OD5954،13،14،،من1516 لامتصاص الأشعة فوق البنفسجية كريستال؛ ومن ثم اختر طول موجي متوفرة استناداً إلى قارئ لوحة.

4-EPS مصفوفة الكشف

ملاحظة: هذه فحوصات مجانية كمياً وتصور EPS. EPS في كليهما، يتم الكشف عن استخدام يكتين لربط السكريات. يسمح البروتين مترافق فلوريسسينتلي القياس الكمي (الخطوة 4.1) أو التصور (الخطوة 4، 2).

  1. كشف شبه كمي EPS
    1. إعداد أنبوبين 1.5 مل. التسمية مع لجان أو لجان + BS.
    2. أضف 1 مل من لجان أو لجان + بكالوريوس للأنابيب الخاصة بكل منها.
    3. تلقيح الأنابيب مع 20 ميليلتر للثقافة بين عشية وضحاها (01:50 إضعاف).
    4. في صفيحة 96-جيدا العقيمة، أسود، مغلوطاً، المعالجة بزراعة الأنسجة، إضافة 130 ميليلتر/جيدا لمراقبة أونينوكولاتيد وسائل الإعلام إلى ثلاثة آبار ليكون بمثابة عنصر التحكم فارغاً. قم بإعداد ثلاثة آبار مراقبة لكل نوع الوسيطة لفحصها. إضافة 130 ميليلتر/جيدا من الثقافة الملقحين للآبار، وكرر حتى يتم مطلي بكافة الشروط التجريبية في ثلاث نسخ.
    5. احتضانها ح 4-24 في 37 درجة مئوية بشكل ثابت.
    6. نقل متوسطة الثقافة إلى لوحة واضحة 96-جيدا مع ماصة، مثالي الأقنية ماصة. كن حذراً لجمع جميع المتوسط الثقافة دون تعطيل السكان ملتصقة و/أو العائد على السهم الموجود على سطح البلاستيك. توضع جانبا.
    7. إصلاح اللوحة السوداء لمدة 15 دقيقة في استخدام من الفورمالدهايد/glutaraldehyde 200 ميليلتر/جيدا في برنامج تلفزيوني x 1 RT.
    8. بينما يتم تحديد السكان ملتصقة، تقييم الكسر طافية من الخطوة 4.1.6. استخدام قارئ لوحة، سجل OD600. آبار مراقبة ك 'فارغة'. تأكيد المتوسطة التحكم الواضح مع أي دليل على التعكر. إذا تم الكشف عن أي التعكر، تجاهل هذه التجربة.
      1. وبدلاً من ذلك، يمكن إجراء فحص كامل في لوحة سوداء أسفل واضحة. في ظل هذه الظروف، يمكن تسجيل قيم600 OD ويمكن التخلص المتوسطة الثقافة في وقت لاحق قبل المتابعة إلى الخطوة 4.1.7. يمكن استخدام قيم600 OD تطبيع البيانات في الحالة، هناك اختلافات كبيرة في معدل النمو بين السلالات البكتيرية.
    9. إزالة الإصلاح والتصرف في النفايات الخطرة.
    10. تغسل برفق الآبار مرتين مع 200 ميليلتر/بئر PBS العقيمة. قم بإزالة برنامج تلفزيوني الغسيل باستخدام خط فراغ بإمالة اللوحة بلطف وبطء يسفط الغسيل عند الحافة السفلي من البئر.
    11. إضافة من 25 ميكروغرام/مل كونا فيتك 150 ميليلتر/جيدا، واحتضان لمدة 15 دقيقة في الرايت
    12. تغسل بلطف مرتين مع 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
    13. إضافة 150 ميليلتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر. تسجيل الأسفار في 488 نانومتر.
  2. التصور مجهرية [كنفوكل] إنتاج EPS وحساب سمك بيوفيلم
    1. إعداد أنبوبين 1.5 مل. التسمية مع لجان أو لجان + BS.
    2. أضف 1 مل من لجان أو لجان + بكالوريوس للأنابيب الخاصة بكل منها.
    3. تلقيح الأنابيب مع 20 ميليلتر للثقافة بين عشية وضحاها (في 01:50 إضعاف).
    4. إعداد لوحة 24-جيدا عقيمة مع 12 مم العقيمة جولة كوفيرسليبس الزجاج. إضافة 400 ميليلتر/جيدا لمراقبة أونينوكولاتيد وسائل الإعلام إلى ثلاثة آبار ليكون بمثابة عنصر التحكم فارغاً. قم بإعداد ثلاثة آبار مراقبة لكل نوع الوسيطة لفحصها.
    5. إضافة 400 ميليلتر للثقافة الملقحين للآبار في التكرارات، وكرر حتى يتم مطلي بجميع الظروف التجريبية.
    6. احتضانها ح 4-24 في 37 درجة مئوية بشكل ثابت.
    7. وتؤكد بصريا النمو في حالة TSB، النمو ومتسرعا EPS (أبيض) في TSB + شرط درجة البكالوريوس، ولا النمو و/أو ترسبات بيضاء في آبار مراقبة عقيمة. قم بإزالة في سوبيرناتانتس.
    8. إصلاح لمدة 15 دقيقة في استخدام من حل فورمالدهايد/glutaraldehyde 200 ميليلتر/جيدا في برنامج تلفزيوني x 1 RT.
    9. إزالة الإصلاح والتصرف في النفايات الخطرة.
    10. تغسل برفق الآبار مرتين مع 200 ميليلتر/بئر PBS العقيمة. قم بإزالة برنامج تلفزيوني الغسيل باستخدام خط فراغ.
    11. إضافة من 25 ميكروغرام/مل كونا فيتك 150 ميليلتر/جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في الرايت
    12. تغسل بلطف مرتين مع 200 ميليلتر/جيدا لبرنامج تلفزيوني.
    13. جبل مع الحل مونتانت أنتيفادي مع DAPI.
      ملاحظة: الحل حل جبل الجاهزة، على أساس والغليسيرول تتضمن DAPI للحفاظ على التسمية الفلورسنت مع تلطيخ الحمض النووي في الخلايا البكتيرية للتصور كونتيرستين في وقت واحد. اتبع كيت التوجيهات والتوصيات لأوقات الاحتضان قبل التصوير عينات. يمكن أن يؤديها DAPI تلطيخ الإجراء قبل تطبيق الحل مونتانت أنتيفادي التي لا تحتوي على DAPI.
    14. تقييم عن طريق الفحص المجهري [كنفوكل]. مجهر [كنفوكل]، تعيين الليزر لشمال البحر الأبيض المتوسط/519 495 نانومتر الإثارة/الانبعاثات للتصور فيتك. تعيين ليزر ثانية إلى 360 نيوتن متر/460 نانومتر الإثارة الانبعاثات/تصور DAPI. حدد موقع في بيوفيلم بالتركيز على قناة DAPI. استخدام القنوات DAPI وفيتك معا لتحديد سمك كامل وتعيين العلوي والسفلي التصوير الحدود. تسجيل صور سمك كامل زي مكدس بالتقاط الصور كل 0.25 ميكرون بعد وضع حدود لأعلى وأسفل z-المكدس. لمزيد من المعلومات حول الفحص المجهري [كنفوكل]، يرجى الرجوع إلى المنشورات بترويض et al. 17 , 18 , 19 , 20
    15. إعادة بناء الصور الثلاثية الأبعاد في إيماجيج (https://imagej.nih.gov/ij/) لتصور تشكيل بيوفيلم الكامل وحساب سمك بيوفيلم. وكان متوسط سمك الحصول على فليكسنيري س. الملح الصفراوية المستحث الأغشية الحيوية 14 ميكرومتر4.

5-التشتت بالانزيم

ملاحظة: في هذا التحليل، هو اكتشاف تفكيك بيوفيلم من خلال تشتت البكتيرية. هنا، يتم إنشاء الأغشية الحيوية الناضجة ولاحقا (عادة في اليوم التالي)، وسائط الإعلام يتم استبدالها ببرنامج تلفزيوني أو استكمال برنامج تلفزيوني. ثم يتم تقييم المكون طافية كوانتيتاتي العدد من البكتيريا التي قد ينفصل عن بيوفيلم.

  1. إعداد أنبوبين 1.5 مل. التسمية مع لجان أو لجان + BS.
  2. أضف 1 مل من لجان أو لجان + بكالوريوس للأنابيب الخاصة بكل منها.
  3. تلقيح الأنابيب مع 20 ميليلتر للثقافة بين عشية وضحاها (في 01:50 إضعاف).
  4. في صفيحة 96-جيدا العقيمة، واضحة، مغلوطاً، المعالجة بزراعة الأنسجة، إضافة 130 ميليلتر/جيدا لمراقبة أونينوكولاتيد وسائل الإعلام إلى ثلاثة آبار ليكون بمثابة عنصر التحكم فارغاً. قم بإعداد ثلاثة آبار مراقبة لكل نوع من الوسائط التي يتم اختبارها.
  5. إضافة 130 ميليلتر/جيدا من الثقافة الملقحين لثلاثة آبار، وكرر حتى يتم مطلي بكافة الشروط التجريبية في ثلاث نسخ.
  6. احتضان لوحة ح 4-24 في 37 درجة مئوية بشكل ثابت.
  7. قبل المتابعة، الحارة برنامج تلفزيوني، وبرنامج تلفزيوني الجلوكوز، برنامج تلفزيوني أملاح الصفراء، وبرنامج تلفزيوني + الأملاح الصفراوية + الجلوكوز إلى 37 درجة مئوية. تعد هذه الكواشف اليومية الطازجة.
  8. استخدام قارئ لوحة، سجل OD600. آبار مراقبة ك 'فارغة'. تأكيد المتوسطة الواضح مع أي دليل على التعكر. إذا تم الكشف عن أي التعكر، تجاهل هذه التجربة. يمكن استخدام قيم600 OD تطبيع البيانات إذا كانت هناك اختلافات كبيرة في معدل النمو بين السلالات البكتيرية.
  9. إزالة المتوسطة ثقافة استخدام سطر فراغ. تأكد من جمع جميع المتوسط الثقافة دون تعطيل السكان ملتصقة الموجود على سطح البلاستيك.
  10. تغسل برفق الآبار مرتين مع 200 ميليلتر/بئر PBS العقيمة. قم بإزالة برنامج تلفزيوني الغسيل باستخدام خط فراغ.
  11. يستعاض عن الغسيل ميليلتر 130/بئر في ثلاثة آبار في كل ما يلي: برنامج تلفزيوني، برنامج تلفزيوني + الجلوكوز، برنامج تلفزيوني + أملاح الصفراء، وبرنامج تلفزيوني + أملاح الصفراوية + الجلوكوز. يجب أن تكون هذه الكواشف المعالجون مسبقاً إلى 37 درجة مئوية.
  12. احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  13. بعناية إزالة اللوحة من حاضنة 37 درجة مئوية. نقل سوبيرناتانتس إلى لوحة 96-بئر جديدة, عقيمة.
  14. استخدام كتلة لوحة أو تمييع 96، حسنا، إعداد 10 إضعاف (01:10) تخفيف المسلسل من المادة طافية في برنامج تلفزيوني العقيمة.
    ملاحظة: يجب أن تتراوح سلسلة تمييع من غير مخفف إلى 10-6 اعتماداً على سلالة البكتيريا لفحصها. يمكن إجراء تجارب رائدة لتحديد نطاق تمييع الأمثل.
  15. لوحة سبوت 5 ميليلتر لتمييع كل على أجار رطل استخدام ماصة متعددة القنوات. احتضان عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. عد المستعمرات في اليوم التالي ومراعاة لعامل إضعاف عند تحديد استرداد المستعمرة تشكيل وحدات (زيمبابوي). لحساب التشتت في المائة بالنسبة إلى 1 x التحكم برنامج تلفزيوني (تعيين نسبة 100%)، تقسيم الانتعاش زيمبابوي من كل شرط المعاملة باسترداد زيمبابوي من نموذج عنصر تحكم برنامج تلفزيوني 1 x.
    ملاحظة: روتين الإعلام لوحات للسلالة البكتيرية من الفائدة يمكن أيضا استخدامها. على سبيل المثال، يمكن مطلي دوسنتاريا على ألواح أحمر الكونغو. ضمان اللوحات جافة للتقنيات المناسبة لبقعة الطلاء.

النتائج

في الشكل 1، هو فعل تشكيل بيوفيلم في معظم نمو مسببات الأمراض المعوية ستة التالية تم اختبارها في الوسائط التي تحتوي على أملاح الصفراء. زيادة كبيرة في البكتيريا ملتصقة بعد أن لوحظ أن التعرض لأملاح الصفراء في ما يقرب من جميع سلالات اختبارها. والاستثناء انتيرو...

Discussion

تحليل تكوين بيوفيلم يشكل تحديا نظراً للطابع الدينامي للأغشية الحيوية والتباين بين السلالات، والمواد والمختبرات وفحوصات. هنا، يتم عرض عدة استراتيجيات لتحديد تكوين بيوفيلم في مسببات الأمراض المعوية عقب التعرض لأملاح الصفراوية مع البصيرة التجريبية المقدمة لتعزيز إمكانية تكرار نتائج. هنا...

Disclosures

الكتاب قد لا الكشف.

Acknowledgements

ونحن نشكر راشيل باء كنين واليخاندرو يانوس-شيا للمساعدة التقنية. ونحن نشكر أنطوني ت. مورلي، هيرلي ص بريان، اليسيو Fasano، سويركزيوسكي هاء بريت وشيريل بوبي للسلالات المستخدمة في هذه الدراسة. كان يدعمها هذا العمل "المعهد الوطني للحساسية" والأمراض المعدية منحة K22AI104755 (C.S.F.). المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية "المعاهد الوطنية للصحة".

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Tryptic Soy BrothSigma-Aldrich22092-500G
Crystal VioletSigmaC6158-50
Concanavalin-A FITCSigmaC7642-10mg
GlucoseSigmaG7021-1KG
Bile SaltsSigmaB8756-100G
LB AgarSigmaL7533-1KG
14 mL culture tubes, 17 x 100 mm, plastic, sterileFisher14-959-11B
Vectashield hard-set antifade with DAPIVector LaboratoriesH-1500
FormaldehydeSigma-AldrichF1635-500
GluteraldehydeSigma-AldrichG6257
Flat-bottomed 96-well plates (clear)TPP92696
Flat-bottomed 96-well plates (black)Greiner Bio-One655076
Flat-bottomed 24-well plates (clear)TPP92424
Glass coverslips 12mm, roundFisher08-774-383
96-well plate readerSpectramax
Flourescent plate readerBiotek Synergy 2
Confocal or Fluorescent MicroscopeNikon A1 confocal microscope
37°C Shaking IncubatorNew Brunswick Scientific Excella E25
37°C Plate IncubatorThermolyne Series 5000

References

  1. Joo, H. -. S. S., Otto, M. Molecular basis of in vivo biofilm formation by bacterial pathogens. Chem Biol. 19 (12), 1503-1513 (2012).
  2. O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm Formation as Microbial Development. Annu Rev Microbiol. 54 (1), 49-79 (2000).
  3. Donlan, R. M. Biofilm Formation: A Clinically Relevant Microbiological Process. Clin Infect Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
  4. Nickerson, K. P., et al. Analysis of Shigella flexneri resistance, biofilm formation, and transcriptional profile in response to bile salts. Infect Immun. 85 (6), (2017).
  5. Ridlon, J. M., Kang, D. -. J., Hylemon, P. B. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. J Lipid Res. 47 (2), 241-259 (2006).
  6. Sistrunk, J. R., Nickerson, K. P., Chanin, R. B., Rasko, D. A., Faherty, C. S. Survival of the fittest: How bacterial pathogens utilize bile to enhance infection. Clin Microbiol Rev. 29 (4), (2016).
  7. Prouty, A. M., Schwesinger, W. H., Gunn, J. S. Biofilm formation and interaction with the surfaces of gallstones by Salmonella spp. Infect Immun. 70 (5), 2640-2649 (2002).
  8. Crawford, R. W., Gibson, D. L., Kay, W. W., Gunn, J. S. Identification of a bile-induced exopolysaccharide required for Salmonella biofilm formation on gallstone surfaces. Infect Immun. 76 (11), 5341-5349 (2008).
  9. Crawford, R. W., Reeve, K. E., Gunn, J. S. Flagellated but not hyperfimbriated Salmonella enterica serovar Typhimurium attaches to and forms biofilms on cholesterol-coated surfaces. J Bacteriol. 192 (12), 2981-2990 (2010).
  10. Crawford, R. W., Rosales-Reyes, R., Ramírez-Aguilar, M. d. e. l. a. L., Chapa-Azuela, O., Alpuche-Aranda, C., Gunn, J. S. Gallstones play a significant role in Salmonella spp. gallbladder colonization and carriage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4353-4358 (2010).
  11. Koestler, B. J., Waters, C. M. Bile acids and bicarbonate inversely regulate intracellular cyclic di-GMP in Vibrio cholerae. Infect Immun. 82 (7), 3002-3014 (2014).
  12. Svensson, S. L., Pryjma, M., Gaynor, E. C. Flagella-mediated adhesion and extracellular DNA release contribute to biofilm formation and stress tolerance of Campylobacter jejuni. PLoS One. 9 (8), e106063 (2014).
  13. Martinez-Medina, M., et al. Biofilm formation as a novel phenotypic feature of adherent-invasive Escherichia coli (AIEC). BMC Microbiol. 9 (1), 202 (2009).
  14. Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. J Appl Microbiol. 105 (2), 585-590 (2008).
  15. Danese, P. N., Pratt, L. A., Dove, S. L., Kolter, R. The outer membrane protein, Antigen 43, mediates cell-to-cell interactions within Escherichia coli biofilms. Mol Microbiol. 37 (2), 424-432 (2000).
  16. Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn's disease-associated adherent-invasive Escherichia coli adhesion is enhanced by exposure to the ubiquitous dietary polysaccharide maltodextrin. PLoS One. 7 (12), e52132 (2012).
  17. Paddock, S. W. Confocal laser scanning microscopy. Biotechniques. 27 (5), (1999).
  18. Paddock, S. W. Principles and practices of laser scanning confocal microscopy. Mol Biotechnol. 16 (2), 127-149 (2000).
  19. Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging. Biotechniques. 44 (5), (2008).
  20. Paddock, S. W., Eliceiri, K. W. Laser scanning confocal microscopy: history, applications, and related optical sectioning techniques. Methods Mol Biol. 1075, 9-47 (2014).
  21. Nataro, J. P., Steiner, T., Guerrant, R. L. Enteroaggregative Escherichia coli. Emerg Infect Dis. 4 (2), 251-261 (1998).
  22. Nesper, J., Lauriano, C. M., Klose, K. E., Kapfhammer, D., Kraiss, A., Reidl, J. Characterization of Vibrio cholerae O1 El tor galU and galE mutants: influence on lipopolysaccharide structure, colonization, and biofilm formation. Infect Immun. 69 (1), 435-445 (2001).
  23. Hadjifrangiskou, M., et al. Transposon mutagenesis identifies uropathogenic Escherichia coli biofilm factors. J Bacteriol. 194 (22), 6195-6205 (2012).
  24. Rahimpour, M., et al. GlgS, described previously as a glycogen synthesis control protein, negatively regulates motility and biofilm formation in Escherichia coli. Biochem J. 452 (3), 559-573 (2013).
  25. Sharma, V. K., Kudva, I. T., Bearson, B. L., Stasko, J. A. Contributions of EspA Filaments and Curli Fimbriae in Cellular Adherence and Biofilm Formation of Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7. PLoS One. 11 (2), e0149745 (2016).
  26. Keto-Timonen, R., Hietala, N., Palonen, E., Hakakorpi, A., Lindström, M., Korkeala, H. Cold Shock Proteins: A Minireview with Special Emphasis on Csp-family of Enteropathogenic Yersinia. Front Microbiol. 7, 1151 (2016).
  27. Pöntinen, A., Markkula, A., Lindström, M., Korkeala, H. Two-Component-System Histidine Kinases Involved in Growth of Listeria monocytogenes EGD-e at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 81 (12), 3994-4004 (2015).
  28. Regeard, C., Mérieau, A., Guespin-Michel, J. F. A bioluminescence assay for screening thermoregulated genes in a psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens. J Appl Microbiol. 88 (1), 183-189 (2000).
  29. Markkula, A., Mattila, M., Lindström, M., Korkeala, H. Genes encoding putative DEAD-box RNA helicases in Listeria monocytogenes EGD-e are needed for growth and motility at 3°C. Environ Microbiol. 14 (8), 2223-2232 (2012).
  30. Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror "real-world" pathogenesis?. Trends Microbiol. 13 (2), 58-63 (2005).
  31. Takai, S., Sekizaki, T., Ozawa, T., Sugawara, T., Watanabe, Y., Tsubaki, S. Association between a large plasmid and 15- to 17-kilodalton antigens in virulent Rhodococcus equi. Infect Immun. 59 (11), 4056-4060 (1991).
  32. Maurelli, A. T., Blackmon, B., Curtiss, R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid. Infect Immun. 43 (1), 397-401 (1984).
  33. Kopecko, D. J., Washington, O., Formal, S. B. Genetic and physical evidence for plasmid control of Shigella sonnei form I cell surface antigen. Infect Immun. 29 (1), 207-214 (1980).
  34. Faherty, C. S., Redman, J. C., Rasko, D. A., Barry, E. M., Nataro, J. P. Shigella flexneri effectors OspE1 and OspE2 mediate induced adherence to the colonic epithelium following bile salts exposure. Mol Microbiol. 85 (1), 107-121 (2012).
  35. Kobayashi, H., Oethinger, M., Tuohy, M. J., Procop, G. W., Bauer, T. W. Improved detection of biofilm-formative bacteria by vortexing and sonication: a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 467 (5), 1360-1364 (2009).
  36. de Oliveira Ferreira, T., et al. Microbial investigation of biofilms recovered from endotracheal tubes using sonication in intensive care unit pediatric patients. Braz J Infect Dis. 20 (5), 468-475 (2016).
  37. Petruzzi, B., Briggs, R. E., Swords, W. E., De Castro, C., Molinaro, A., Inzana, T. J. Capsular Polysaccharide Interferes with Biofilm Formation by Pasteurella multocida Serogroup A. MBio. 8 (6), e01843-e01817 (2017).
  38. Payne, D. E., Boles, B. R. Emerging interactions between matrix components during biofilm development. Curr Genet. 62 (1), 137-141 (2016).
  39. Huang, R., Li, M., Gregory, R. L. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2 (5), 435-444 (2011).
  40. Buswell, C. M., Nicholl, H. S., Walker, J. T. Use of continuous culture bioreactors for the study of pathogens such as Campylobacter jejuni and Escherichia coli O157 in biofilms. Methods Enzymol. 337, 70-78 (2001).
  41. McBain, A. J. Chapter 4 In Vitro Biofilm Models. Adv Appl Microbiol. 69, 99-132 (2009).
  42. Schiefer, H. G., Krauss, H., Brunner, H., Gerhardt, U. Ultrastructural visualization of surface carbohydrate structures on mycoplasma membranes by concanavalin A. J Bacteriol. 124 (3), 1598-1600 (1975).
  43. Liener, I. . The Lectins: Properties, Functions and Applications in Biology and Medicine. , (1986).
  44. Wittmann, V., Pieters, R. J. Bridging lectin binding sites by multivalent carbohydrates. Chem Soc Rev. 42 (10), 4492-4503 (2013).
  45. Wang, S., et al. The exopolysaccharide Psl-eDNA interaction enables the formation of a biofilm skeleton in Pseudomonas aeruginosa. Environ Microbiol Rep. 7 (2), 330-340 (2015).
  46. Okshevsky, M., Meyer, R. L. The role of extracellular DNA in the establishment, maintenance and perpetuation of bacterial biofilms. Crit Rev Microbiol. 41 (3), 341-352 (2015).
  47. Xu, D., Zhang, W., Zhang, B., Liao, C., Shao, Y. Characterization of a biofilm-forming Shigella flexneri phenotype due to deficiency in Hep biosynthesis. PeerJ. 4, e2178 (2016).
  48. O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J Vis Exp. (47), (2011).
  49. Nickerson, K. P., McDonald, C. Crohn's Disease-Associated Adherent-Invasive Escherichia coli Adhesion Is Enhanced by Exposure to the Ubiquitous Dietary Polysaccharide Maltodextrin. PLoS One. 7 (12), (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

135 EPS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved