صنع واختبار واستخدام البوتاسيوم أيون ميكروليكتروديس انتقائية في شرائح أنسجة الدماغ الكبار

Summary

أيونات البوتاسيوم تساهم يستريح إمكانات غشاء الخلايا والخلية ك⁺ تركيز منظم حاسمة لاستثارة الخلوية. ونحن تصف كيفية جعل ومعايرة واستخدام أحادي القطب ك⁺-ميكروليكتروديس انتقائية. استخدام هذه الأقطاب يتيح قياس ديناميات تركيز ك⁺ مقولة كهربائياً في شرائح هيبوكامبال الكبار.

Abstract

أيونات البوتاسيوم تساهم مساهمة كبيرة في إمكانات غشاء يستريح من الخلايا، وذلك، خارج الخلية ك⁺ تركيز منظم حاسمة لاستثارة الخلية. تغيير تركيزات من خارج الخلية ك⁺ يؤثر على استثارة الغشاء يستريح المحتملة والخلوية بالتحول في التوازنات بين الدول المغلقة والمفتوحة والمعطل لقنوات أيون تعتمد على الجهد التي تكمن وراء إمكانات العمل بدء والتوصيل. ومن ثم فإنها ذات قيمة لقياس ديناميات ك⁺ خارج الخلية في الصحة والدول المريضة مباشرة. هنا، نحن تصف كيفية جعل ومعايرة واستخدام أحادي القطب ك⁺-ميكروليكتروديس انتقائية. قمنا بنشر لهم في شرائح المخ هيبوكامبال الكبار لقياس ديناميات تركيز ك⁺ مقولة كهربائياً. الاستخدام الحكيم لهذه الأقطاب هو جزء مهم من مجموعة الأدوات اللازمة لتقييم الآليات الخلوية والفيزيائية التي تتحكم في تركيزات ك⁺ خارج الخلية في الجهاز العصبي.

Introduction

أحكام تنظم تركيزات أيون البوتاسيوم في الدماغ، وتقلباتها له تأثير قوي على إمكانات غشاء يستريح كافة الخلايا. وفي ضوء هذه الإسهامات الحاسمة، هو هدفا هاما لعلم الأحياء تحديد الآليات الخلوية والفيزيائية الحيوية التي يتم استخدامها لتنظيم محكم تركيز ك⁺ في الفضاء خارج الخلية في الأجهزة المختلفة ل الجسم^{1 , 2}-شرط هام في هذه الدراسات هو القدرة على قياس تركيزات ك⁺ بدقة. على الرغم من أن العديد من العناصر التي تسهم في التوازن البوتاسيوم في الدماغ في الدول السليمة والمريضة قد حددت^3،،من⁴⁵، تباطأ التقدم كذلك بسبب الطبيعة المتخصصة إعداد أيون ميكروليكتروديس الانتقائي لقياس البوتاسيوم. أجهزة الاستشعار ميكروليكترودي تمثل المعيار الذهبي لقياس ك⁺ التركيزات في المختبر، في شرائح الأنسجة و في فيفو.

أحدث النهج ك⁺ الرصد هي قيد التطوير باستخدام أجهزة الاستشعار البصرية، بيد أن هذه لا يكشف تركيزات البيولوجية ذات الصلة لمجموعة ك⁺ أو قد لا تم تماما وفحص في النظم البيولوجية، على الرغم من أن النتائج الأولية تبدو واعدة^6،،من⁷⁸. مقارنة بأجهزة الاستشعار البصرية، ميكروليكتروديس محدودة أساسا لقياس نقطة مصدر الأيونات، على الرغم من صفائف القطب يمكن تحسين القرار المكانية⁹. تركز هذه المقالة على ماسورة واحدة ميكروليكترودي أجهزة الاستشعار لرصد ديناميات ك⁺ .

في هذا العمل، نحن تقرير مفصل إجراءات التدرجي لجعل ك⁺ ميكروليكتروديس انتقائية، باستخدام ionophore بوتاسيوم المستندة إلى فالينوميسين التي تسمح بانتقائية للغاية (10⁴ إضعاف ك⁺ إلى الانتقائية نا⁺ ) ك⁺ الحركة عبر أغشية¹⁰. ببتيد طبيعيا، فالينوميسين بمثابة مسام نفاذية ك⁺ وييسر تدفق ك⁺ إلى أسفل التدرج اللوني الكهروكيميائية. ونحن أيضا وصف كيفية معايرة الأقطاب، كيفية تخزينها واستخدامها، وأخيراً كيفية نشرها لقياس ديناميات تركيز ك⁺ في شرائح المخ هيبوكامبال الحاد من الفئران الكبار. استخدام أقطاب هذه جنبا إلى جنب مع الفئران المعدلة وراثيا التي تفتقر إلى قنوات أيون المحددة المقترحة لتنظيم خارج الخلية ك⁺ حيوية ينبغي أن تكشف عن الآليات الخلوية المستخدمة من قبل الجهاز العصبي للتحكم بتركيز ك المحيطة ⁺ في الوسط خارج الخلية.

Protocol

جميع التجارب على الحيوانات وأجريت وفقا "المعهد الوطني للدليل الصحي" لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية ووافقت عليها "لجنة البحوث الحيوانية" المستشار في جامعة كاليفورنيا، لوس أنجلوس. تم إيواء جميع الفئران مع تتوفر الأغذية والمياه libitum الإعلانية في بيئة ضوء الظلام ح 12. جميع الحيوانات صحية مع لا تغييرات سلوكية واضحة، ولم يشاركوا في الدراسات السابقة، وضحى بها أثناء دورة خفيفة. تم جمع البيانات لإجراء التجارب من الفئران الكبار (6-8 أسابيع من العمر لجميع التجارب).

1-إعداد ميكروليكتروديس انتقائية ك⁺

1. سيلانيزيشن زجاج البورسليكات
   1. إزالة الشعيرات الدموية الزجاج كافية من التعبئة والتغليف، ووضع في أنبوب 50 مل مخروطية. ملء أنبوب مخروطي إلى أعلى مع أقطاب HCl. يغسل م 1 مع الانفعالات لطيف في HCl بين عشية وضحاها، أو على الأقل لمدة 6 ساعات.
   2. شطف بإيجاز الشعيرات الدموية مع الإيثانول 70% وثم جاف تماما عند 100-120 درجة مئوية لمدة 6-8 ساعات. تخزين الشعيرات الدموية غسلها في حاويات مع كبريتات الكالسيوم اللامائية ديسيككانت لمدة 4 أسابيع قبل استخدامها مرة أخرى.
   3. قبل سيلانيزيشن، سحب الشعيرات الدموية لنصيحة خير استخدام ساحبة ميكروليكترودي. ميكروليكتروديس التي نستخدمها حوالي 2-5 ميكرون في القطر. دائماً معالجة الشعيرات الدموية غسلها بقفازات والزيوت من الجلد يمكن أن تتداخل مع سيلانيزيشن.
   4. ضع ميكروليكتروديس في حاوية زجاج حيث أن أقطاب كهربائية مرتفعة من أسفل لمنع الكسر تلميح. إصلاح ميكروليكتروديس للحاوية باستخدام الشريط أوتوكلافابل أو شريط لاصق مماثلة.
   5. إزالة ما يقرب من 0.5 مل من محلول سيلانيزيشن 5% ديتشلوروديميثيلسيلاني (دس) من الحاوية الخاصة به باستخدام الأسلوب استبدال النيتروجين (انظر الشكل 2). ملء بالون بغاز النيتروجين وإرفاقه حقنه أو الأنبوب والإبرة البالون. أدخل الإبرة في الحاوية دس حين وضع دس في محقن منفصل عن طريق إبرة أطول.
   6. تطبيق الحل سيلانيزيشن دروبويسي إلى نصائح الماصات وتغطي فورا. مكان الحاوية عقد ميكروليكتروديس مع الحل سيلانيزيشن في فرن مختبر المعالجون مسبقاً (170-180 درجة مئوية) لمدة 10-12 ساعة أو 200-220 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة
   7. وبعد التفريخ، إيقاف تشغيل الفرن ثم قم بإزالة اللوحة من الفرن. كن حذراً عند إزالة اللوحة من الحاضنة، كما أنها ساخنة للغاية. وضع اللوحة على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة للسماح للأواني الزجاجية لتبريد.
   8. إزالة ميكروليكتروديس من اللوحة (باستخدام شفرة حلاقة أو شفرة المبضع بقص الشريط) ووضعها في وعاء محكم معبأ المجففة. يمكن استخدام ميكروليكتروديس سيلانيزيد التي تبقى خالية من الرطوبة لتصل إلى 1 الأسبوع التالي سيلانيزيشن.
2. فتيلة أقطاب كهربائية
   1. إعداد حل أسهم من ك⁺ ionophore كوكتيل: 5% w/v فالينوميسين، 93% v/v 1، 2-ثنائي ميثيل-3-النيترو بنزين، والبوتاسيوم 2% w/v tetrakis(4-chlorophenyl) بورات¹¹. هذا الحل لون أصفر باهت. تبقى في وعاء محكم الإغلاق، ومبهمة في درجة حرارة الغرفة. إذا المخزنة بشكل صحيح هذا الحل يمكن أن تستمر عدة أشهر.
   2. إعداد حل أسهم من 10 ملم حبيس مخزنة 300 مم كلوريد الصوديوم عند الأس الهيدروجيني 7.4. إصلاح مسرى إلى المشبك والردم مع كلوريد الصوديوم مخزنة بشكل مؤقت باستخدام تلميح ميكروفيل ز 28 متصلاً بحقنه. ويلاحظ أن المحلول الملحي قد وصلت إلى نهاية الحافة ميكروليكترودي. التأكد من أن ميكروليكترودي خالية من الفقاعات الكبيرة التي يمكن أن تتداخل مع تدفق التيار.
   3. كسر غيض مسرى إلى حوالي 10-20 ميكرومتر على نطاق واسع، استخدام الجانب حادة مشرط أو شفرة حلاقة.
   4. استخدام ميكروبيبيتي، تطبيق المعالجة تجميعية صغيرة (~0.1 ميليلتر) من إيونوفوري ك⁺ قرب غيض من ميكروليكترودي. إذا تم بشكل صحيح سيلانيزيد سيتم استيعاب الحبرية في تلميح كسر مسرى. تعبئة مسرى إلى 1-2 ملم مع إيونوفوري ك⁺ ، وإزالة الزائدة باستخدام المناديل الورقية.

2-معايرة ميكروليكتروديس انتقائية ك⁺

1. تحضير محاليل المعايرة
   1. إعداد حلول لتركيزات مختلفة من بوكل في السائل الدماغي النخاعي الاصطناعية الاسموليه متساوية (قام) بالاستعاضة عن كلوريد الصوديوم مع بوكل. كنا 0، 1، 1، 4، 5، 10 و 100 ملم ك⁺ قام، للمعايرة من أقطاب كهربائية. وترد في الجدول 1وصفات لهذه الحلول المعايرة.

المادة الكيميائية	ميغاواط	مم النهائي	مم 0.1 [K +]	1 ملم [K +]	4.5 مم [K +]	10 ملم [K +]	100 ملم [K +]
	(g/mol)
كلوريد الصوديوم	58.44	ويختلف	ز 1.51	ز 1.50	ز 1.44	ز 1.4	ز 0.345
بوكل	الأسهم م 1	ويختلف	20 ميليلتر	200 ميليلتر	ميليلتر 900	2 مل	20 مل
كاكل2	الأسهم م 1	2	400 ميليلتر
مجكل2	الأسهم م 1	1	200 ميليلتر
نة2بو4	119.98	1.2	ز 0.29
NaHCO3	84.01	26	ز 0.437
د-الجلوكوز	180.16	10	ز 0.360
المياه	q.s. 200 مل

الجدول 1. حلول معايرة البوتاسيوم

2. ميكروليكترودي المعايرة
   1. فقاعة كل الحلول مع 95% O₂5% CO₂ لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل البدء بالتجربة. تبدأ بيرفوسينج الحمام مع 4.5 ملم [ك⁺] قام بمعدل 3 مل في الدقيقة الواحدة. ضع مسرى انتقائية ك⁺ إلى حامل القطب يعلق على هيدستاجي القطب على المناور. هذا هيدستاجي متصل بمكبر للصوت مناسب. إدراج تلميح مسرى بيرفوساتي حمام.
   2. ضمان مسرى الأرض Ag/AgCl هو حمم في نفس الحل، وأن التدفق مطرد. تطبيق حلول المعايرة بطريقة تدريجية وتسجيل التغييرات المحتملة في المتوسط عبر الحافة قطب كهربائي. الانتظار لامكانيتها في تلميح قطب كهربائي للتوصل إلى قيمة ثابتة قبل التحول إلى الحل التالي
   3. قياس تغير الجهد ثابت الدولة استجابة لتطبيق حلول المعايرة على طرف القطب. التأكد من أن الميل للاستجابة القطب 52 على الأقل ولا يزيد عن 58 أم كل تغيير سجل في [ك⁺].

3-إعداد شرائح المخ هيبوكامبال الحادة

1. إعداد الحلول شريحة
   1. إعداد 500 مل السكروز قطع الحل تتألف من: السكروز 194 مم، 30 مم كلوريد الصوديوم، 4.5 مم بوكل، 10 ملم د-الجلوكوز، 1 مم مجكل₂، 1.2 مم نة₂ص₄، و ناكو 26 مم₃، موسم 290-300، مشبعة مع 95% O₂ و 5% CO₂.
   2. إعداد 1-2 لترات من تسجيل الحل (قام) تتألف من: 124 كلوريد الصوديوم، 4.5 مم بوكل، 1 مم مجكل₂، 10 ملم د-الجلوكوز، 2 مم كاكل₂، 1.2 مم نة₂بو₄، و 26 ملم ناكو₃؛ الرقم الهيدروجيني 7.3-7.4 (بعد السطح)، موسم 290-300، مشبعة مع 95% O₂ و 5% CO₂. ملء كوب يحتوي على غرفة حامل شريحة الدماغ مع تسجيل الحل وإبقائه في 32-34 درجة مئوية. ملء قاعة فيبرتوم مع طين الماء المثلج.
2. إعداد شريحة الحادة
   1. تخدير عميق ماوس بوضعه في جرة بيل بريتشارجيد مع إيسوفلوراني 2-3 مل. تحقق منعكس قرصه أخمص القدمين، وإذا كان غير المستجيبة، قطع رأس سريعاً باستخدام زوج من مقص حاد أو المقصلة كما يتطلب البروتوكول الخاص بك الحيوانات.
   2. جعل شق 2-3 سم باستخدام المقص من الجزء والذيلية من الجمجمة إلى قطع فروة الرأس على طول خط الوسط. بينما يدوياً تراجعه فروة الرأس، جعل اثنين 1 سم شقوق أفقية من ماغنوم ثقبة على طول جانبي الجمجمة. ثم، باستخدام مقص غرامة، قطع شق طول الجمجمة، على طول خط الوسط من الجزء الخلفي الجمجمة إلى الآنف.
   3. استخدام الملقط غرامة إدراجها قرب خط الوسط، تتراجع الجمجمة قطعي في جزأين. استخراج المخ الماوس من الجمجمة واستخدام شفرة لإزالة المخيخ والمصابيح شمي، التي تقع على التوالي في أجزاء الدماغ والذيلية وروسترال. يمكن تحديد هذه التشققات الكبيرة، التي فصلها عن القشرة.
   4. جبل كتلة الدماغ على الدرج فيبرتوم استخدام سوبر الغراء. ملء علبة فيبرتوم مع الحل قطع الجليد الباردة.
   5. قص مقاطع الأنسجة على متن الطائرة الاكليلية في 300 ميكرون سمك. وعادة ما يمكن جمعها 6 شرائح هيبوكامبال الاكليلية.
   6. بعد أن يتم قطع كل قسم، نقل على الفور الشرائح إلى الشريحة عقد الكأس استعد 32-34 درجة مئوية. إبقاء الأبواب في درجة الحرارة هذه لمدة 20 دقيقة قبل إزالة الكأس التي تحتوي المقاطع ومكان هذا في درجة حرارة الغرفة قبل تسجيل 20-30 دقيقة على الأقل.

4-قياس ديناميات كهربائياً مقولة ك⁺

1. إعداد إعداد شريحة
   1. بلطف ضع شريحة الدماغ في الحمام باستخدام ماصة باستور ولطف أنه عقد في مكان مع قيثارة البلاتين مع سلاسل النايلون.
   2. ضمان النصائح من ثنائي القطب الكهربائي محفزة موازية لبعضها البعض وهي المستوى مع طائرة الشريحة. ببطء، على مدى 6-7 ثوان، إدراج الأقطاب CA3 الطبقة رادياتوم حوالي 40-50 ميكرون العميق لحفز شافر ضمانات إضافية. في المقاطع الاكليلية، CA3 يمكن تقريبا التعرف كجزء جانبية الحصين السليم إلى طبقة الخلايا الحبيبية في جينو هيبوكامبال، مع رادياتوم الطبقة الوقوع الآنسي والبطني إلى طبقة الخلايا الهرمية.
   3. إدراج بعناية ك⁺-القطب الانتقائي في CA1 الطبقة رادياتوم ما يقرب من 50 ميكرومتر العميقة، عن طريق خفض الكهربائي ببطء على مدى ما يقرب من 3-4 ثوان. تتيح إمكانات لتحقيق الاستقرار عبر مسرى قبل تطبيق التحفيز على الشريحة: وهذا عادة ما يستغرق 5 إلى 10 دقائق. إذا كانت الشريحة معارض عفوية تجاهل التغييرات في الخلية ك⁺ ثم وكرر هذه العملية مع شريحة جديدة.
2. التدبير آثار إطلاق سراح ك⁺
   1. تطبقه يدوياً كئيبة على الزناد على مشجعا أثناء رقمياً تسجيل استجابات القطارات للتحفيز الكهربائي (8 البقول). تطبيق التحفيز في 10 هرتز و 1 عرض النبض مرض التصلب العصبي المتعدد، بدءاً من 10 السعة التحفيز µA.
   2. تطبيق زيادة تحفيز ستريك بعامل 2 حتى يتم اكتشاف حالة من سعة استجابة ك⁺ الحد أقصى. إذا كنت لا ترى أي استجابة، نقل موضع مسرى ك⁺ أقرب إلى موقع التحفيز في 100 ميكرومتر في زيادات
   3. تحديد السعة التحفيز التي تنتج نصف الاستجابة القصوى. في تجربتنا، هذا بين 40-160 µA، اعتماداً على نوعية إعداد وسن الحيوان، والمسافة بين أقطاب التحفيز والقطب الانتقائي ك⁺ .
   4. في نفس الشريحة، استخدام سعة حافز في خطوة واحدة أقل من السعة التي تنتج نصف الاستجابة القصوى (مثلاً إذا كان ينتج 80 µA رد النصف الأعلى، استخدم 40 µA) تطبيق القطارات حافزا لزيادة عدد النبضات. في البداية، وقد استخدمنا القطارات من البقول 1، 2، 4، 8، 16، 32، 64 و 128.
   5. للتأكد من أن يتم بإطلاق إمكانات عمل حمام الضمانات شافر حفزت كهربائياً وساطة إشارات ك⁺ ، تطبيق 0.5 ميكرومتر ت في قام لمدة 10 دقائق وكرر البروتوكول التحفيز. ينبغي أن تراعي أية استجابات مقولة.
   6. بعد الانتهاء من هذه التجربة شريحة، تأكيد مسرى حافظت على ريسبونسيفيتي بإعادة معايرة مسرى في حلول المعايرة وضمان الاستجابة قد انحرفت ليس بأكثر من 10% من المعايرة الأولية

النتائج

للقياس الانتقائي لخارج الخلية ك⁺، نحن على استعداد ميكروليكتروديس الأيوني الانتقائي مغطاة بطبقة مسعور من خلال سيلانيزيشن لتنظيف البورسليكات الزجاج الماصات (الشكل 1A). ويتيح هذا الطلاء إيونوفوري ك⁺ التي تحتوي على فالينوميسين للراحة في غيض مسرى ...

Discussion

الأسلوب الذي يصف لنا هنا قد سمح لنا تقييم ديناميات ك⁺ استجابة للتحفيز الكهربائي للضمانات شافر في شرائح هيبوكامبال الحاد من الفئران الكبار. لدينا طريقة لإعداد ك⁺ ميكروليكتروديس أيون انتقائية مماثلة للإجراءات الموصوفة في وقت سابق^12،13،،

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vibratome	DSK	Microslicer Zero 1
Mouse: C57BL/6NTac inbred mice	Taconic	Stock#B6
Microscope	Olympus	BX51
Electrode puller	Sutter	P-97
Ag/AgCl ground pellet	WPI	EP2
pCLAMP10.3	Molecular Devices	n/a
Custom microfil 28G tip	World precision instruments	CMF28G
Tungsten Rod	A-M Systems	716000
Bipolar stimulating electrodes	FHC	MX21XEW(T01)
Stimulus isolator	World precision instruments	A365
Grass S88 Stimulator	Grass Instruments Company	S88
Borosilicate glass pipettes	World precision instruments	1B150-4
A to D board	Digidata 1322A	Axon Instruments
Signal Amplifier	Multiclamp 700A or 700B	Axon Instruments
Headstage	CV-7B Cat 1	Axon Instruments
Patch computer	Dell	n/a
Sodium Chloride	Sigma	S5886
Potassium Chloride	Sigma	P3911
HEPES	Sigma	H3375
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S0751
D-glucose	Sigma	G7528
Calcium Chloride	Sigma	21108
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
valinomycin	Sigma	V0627-10mg
1,2-dimethyl-3-nitrobenzene	Sigma	40870-25ml
Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate	Sigma	60591-100mg
5% dimethyldichlorosilane in heptane	Sigma	85126-5ml
TTX	Cayman Chemical Company	14964
Hydrochloric acid	Sigma	H1758-500mL
Sucrose	Sigma	S9378-5kg
Pipette Micromanipulator	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
Objective lens	Olympus	PlanAPO 10xW