JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نحن نقدم طريقة منخفضة التكلفة وموثوق بها لتوليد اليكتروبوراتيد الدماغ أورجانوتيبيك شريحة الثقافات من أجنة الفأر مناسبة للفحص المجهري [كنفوكل] وتقنيات التصوير العيش.

Abstract

جابايرجيك إينتيرنيورونس (INs) هي عناصر حاسمة للشبكات العصبية التي تدفع الإدراك والسلوك. الوظائف الموجهة لملء القشرة ترحيل عرضية من موطنهم الأصلي في تيلينسيفالون البطني (بما في ذلك من امينينسيس ganglionic الآنسي ووالذيليه (MGE، فريق الخبراء الاستشاري)) إلى لوحة القشرية الظهرية في الاستجابة لمجموعة متنوعة من الذاتية والخارجية العظة. وقد وضعت منهجيات مختلفة على مر السنين التلاعب بمسارات محددة وراثيا والتحقيق في كيفية تنظيم ديناميكية cytoskeletal التغييرات المطلوبة للسليم في الهجرة. في الرحم انهانسر قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة تأثير الجينات القمع أو الأنواع الفرعية overexpression في محددة في حين تقييم الأثر على مورفولوجيا والموقف النهائي. ومع ذلك، رغم سهولة استخدام هذا النهج لتعديل الخلايا الهرمية ترحيل إشعاعيا، أنه أكثر من الناحية الفنية يتحدى عند استهداف انهانسر INs. في الرحم يولد عائد منخفض نظراً لمعدلات البقاء على قيد الحياة انخفضت من الجراء عندما ويجري انهانسر قبل e14.5، كما هي العادة عند دراسة الإضافية المستمدة من MGE. في نهج بديل، توفير إمكانية وصول سهلة إلى MGE MGE explants وتسهيل تصوير وظائف معدلة وراثيا. بيد في هذه اكسبلانتس، ترحيل الوظائف داخل مصفوفة مصطنعة، تخلو من إشارات التوجيه الذاتية والمدخلات ثالاميك. هذا ما حدا بنا إلى تحسين أسلوب حيث يمكن ترحيل الإضافية في بيئة أكثر طبيعي، بينما التحايل على التحديات التقنية في الرحم النهج. في هذه الورقة، ويصف لنا مزيج انهانسر الرحم السابقين من أدمغة الفأر الجنينية متبوعاً أورجانوتيبيك شريحة الثقافات سهولة تعقب والصورة وإعادة بناء الوظائف المعدلة وراثيا ترحيل على طول مساراتها الطبيعية استجابة الرموز الذاتية. ويسمح هذا النهج لكل التقدير الكمي لجوانب حيوية في الهجرة مع الوقت الفاصل بين التصوير [كنفوكل]، فضلا عن تحليل مفصل لمختلف المعايير المورفولوجية استخدام الخلايا العصبية عمليات إعادة البناء في الأنسجة إيمونولابيليد الثابتة.

Introduction

إينتيرنيورونس جابايرجيك القشرية (INs) متنوعة فيما يتعلق بخصائصها البيوكيميائية، الخصائص الفسيولوجية والربط، والتوسط في وظائف مختلفة في الشبكات ناضجة1،2،3 ،،من45. مواصفات أنواع فرعية مختلفة من وظائف القشرية محكم ينظم من خلال الشلالات الوراثية التي تم دراستها على نطاق واسع1،2. غالبية الوظائف جابايرجيك القشرية (70 في المائة) تنشأ من فروعه في نيافة ganglionic الآنسي (MGE)، بنية جنينية تقع بطنيا، ويجب ترحيل عبر مسافات طويلة نسبيا للوصول إلى لوحة القشرية1، 2 , 6-في حين تهاجر الخلايا الهرمية القشرية إشعاعيا من منطقة البطين (VZ) إلى لوحة القشرية على طول سقالة إطلاق شعاعي، هجرة عرضية من الوظائف، التي هي لم تعلق على هذه سقالة، يتطلب مجموعة متنوعة من الجوهرية و الرموز الخارجية لجذب الخلايا العصبية ترحيل نحو لوحة القشرية، بينما توجه لهم بعيداً عن هياكل غير القشرية2،،من78. بعد إنهاء دورة الخلية، وظائف هي صده من MGE الكيماوي الاشمئزاز العظة أعرب داخل VZ MGE، الذي يشغل الهجرة عرضية نحو9،القشرية اللوحة10. ترحيل الوظائف تجنب المخطط مع المعونة من منبهات مختلفة مثيرة للاشمئزاز11 ، وبعد أن وصلت إلى لوحة القشرية، أنهم التبديل من عرضية إلى وضع هجرة شعاعي وتصل إلى مركزها الصفحي النهائي، جزئيا في استجابة لمنبهات من الهرمية خلايا12 وسائر السكان الخلوية13. هجرة الوظائف، أما بالنسبة لسائر السكان الخلايا العصبية، يشمل مختلف التغييرات الشكلية الدينامية للسماح بالحركة الفعلية للخلايا العصبية. تتميز هذه الحركة العصبية ما يسمى بدورات متكررة من ثلاث خطوات متتالية: استطالة عملية رائدة، حركة نشطة أنتيروجرادي من النواة (نوكليوكينيسيس)، والتراجع عن عملية زائدة14. في الهجرة وينظم العديد من الإشارات الذاتية والخارجية التي محرك المتفرعة ويعيد البناء النشط لعملية رائدة لتوجيه الوظائف في الاتجاه السليم، تحديد اتجاه وسرعة الهجرة14،15 ،16.

وقد درست المحددات تنظم القشرية في الهجرة على نطاق واسع في السنوات الأخيرة1،2،7،17،18،،من1920، وقد تم افترض تعطل في بعض هذه الجهات الفاعلة الجزيئية يؤدي إلى الاضطرابات النمائية، مثل طب الأطفال صهر الصرع أو التوحد طيف اضطرابات1،2،21، 22 , 23 , 24-ولذلك سعى تطوير مختلف النهج في المختبر و في فيفو تقدم كبير في قدرتنا على دراسة هذه العملية الدينامية، ب استعراضها في السابق25. أساليب في المختبر ، بما في ذلك مقايسة الدائرة Boyden و "المقايسة خيار شريطية"، توفير الوسائل الأسرع والأكثر استنساخه من تقييم الشرط وخلية مستقلة من جينات معينة أو بروتينات أثناء الهجرة العصبية، دون تأثير العوامل الأخرى25. هذه الاختبارات مفيدة بشكل خاص عندما جنبا إلى جنب مع تصوير يعيش8،،من2627. مع هذه التقنيات، هي وظائف بسهولة استرجاعها من e13.5 MGE ومعزولة من جراء تفكك الانزيمية والميكانيكية، بعد الذي يمكن أن يحقق في مسارات إشارات مختلفة ورموز التوجيه، كما هو موضح سابقا8،28 . ومع ذلك، تجري هذه الاختبارات في مصفوفة خارج الخلية اصطناعية في غياب بنية الأنسجة الثلاثية الأبعاد، التي قد تغير من خصائص السلوك والخلايا العصبية، يحتمل أن تؤثر على خلية الهجرة و/أو بقاء25. وقد وضعت explants MGE السابقين فيفو للتحايل على هذه القيود، كأداة بديلة لقياس التغيرات المورفولوجية الدينامية التي تحدث أثناء الترحيل جنبا إلى جنب مع المعلمات مثل سرعة واتجاه14، 29. توليد MGE explants بسيط نسبيا، وقد تم على نطاق واسع الوارد وصفها في أماكن أخرى من30. ويترتب عليها الطلاء من خلاصة صغيرة من MGE في أحادي الطبقة الخلايا القشرية المختلطة أو في مزيج من ماتريجيل والكولاجين حضور25من منبهات جذابة أو مثيرة للاشمئزاز، على الرغم من أن هذه الأخيرة هي اختيارية31. MGE explants تسمح بدقة عالية التصوير للخلايا المسماة قليلة، وتبسيط دراسة العمليات داخل الخلايا، مثل إعادة عرض cytoskeletal أثناء العملية الرائدة التفريع، كما هو موضح سابقا33 32، ،34 وفي هذه الدراسة. MGE explants قد استخدمت بنجاح لتقييم التغيرات cytoskeletal ديناميكية خلال في الهجرة في بيئة ثنائية الأبعاد، على سبيل المثال بعد المعالجات الدوائية أو تشيموتاكتيك محددة (انظر، على سبيل المثال، تيلينس et al. عام 201633) . ومع ذلك، مع هذا النهج، ترحيل الوظائف داخل مصفوفة مصطنعة، وهذا قد تغير في السلوك، وإمكانية تكرار نتائج وأهمية النتائج التجريبية.

على النقيض من ذلك، يسمح التلاعب بالجينات للوظائف في بيئتها الأصلية في الرحم انهانسر وهو أسلوب مستخدمة على نطاق واسع لسرعة وكفاءة تقييم أثر اكتساب وفقدان وظيفة الجينات بينما التحايل على القيود المفروضة على خروج المغلوب مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً وتدق في استراتيجيات25،35. انهانسر في الرحم يمكن أن تكون منحازة في فروعه باستخدام نوع الخلية المروجين محددة ووضع أقطاب كهربائية نحو الهياكل فينتروميديال، بما في ذلك MGE36. وعلاوة على ذلك، في الرحم انهانسر يسمح للتعبير المناسب عن الثوابت التجريبية في غضون أيام 1-2، بالمقارنة مع 7-10 أيام المطلوبة لبناء التعبير استخدام الفيروسية متجهات25. ومع ذلك، في الرحم انهانسر من فروعه يميل إلى أن يكون المنخفضة الغلة. في الواقع، على الرغم من أن يمكن تكون transfected الخلايا الهرمية فروعه الموجودة في منطقة البطين الظهرية كفاءة استخدام في الرحم انهانسر، تستهدف الهياكل تقع أكثر بطنيا، مثل MGE، هو أكثر من الناحية الفنية تحديا، لا سيما في e13.5 الصغيرة يقلل الأجنة، وارتفاع معدل الفتك الجنينية زيادة الغلة التجريبية25.

للالتفاف حول بعض القيود الفنية المرتبطة في المختبر MGE explant التجارب و في فيفو في الرحم انهانسر، تم السابقين فيفو أورجانوتيبيك شريحة الثقافات المتقدمة8،37، ،من 3839. المخ أورجانوتيبيك عرض الثقافات شريحة شروط الاستفادة من محاكاة في فيفو ، رغم أنها أقل تكلفة واستهلاكا للوقت مما الحيوان توليد نماذج25. في الواقع، هذه التحضيرات تسمح سهولة وصول إلى MGE، جنبا إلى جنب مع التصور محددة من الوظائف، ويمكن دمجها مع انهانسر المحورية للتحقيق في مسارات جزيئية محددة في ترحيل في بيئة فيزيولوجية أكثر8 وظائف , 39 , 40 , 41-أننا قد الأمثل ولذلك نهج من أجل أورجانوتيبيك الثقافات38، التي نحن جنبا إلى جنب مع انهانسر الرحم السابقين والوقت الفاصل بين التصوير [كنفوكل]، لمواصلة تقييم حدوث عملية دينامية والمورفولوجية أثناء الهجرة عرضية ل MGE الإضافية. تم تكييف هذا البروتوكول والأمثل من الآخرين الذين استخدموا الرحم السابقين أو في الرحم المخ انهانسر أورجانوتيبيك شريحة الثقافات ودراسة هجرة الخلايا الهرمية42،43 و القشرية الإضافية36،،من3944. على وجه التحديد، الأجنة الماوس يتم قطع رأسه و MGE اليكتروبوراتيد السابقين فيفو بعد حقن داخل البطيني والبلازميدات التجريبية، مما يسمح أكثر كفاءة ودقة استهداف MGE موروث من ما يمكن تحقيقه مع انهانسر في الرحم . ثم يتم استخراج العقول ومقطوع إلى شرائح الاكليلية الدماغ الجامع الذي يمكن أن يكون مثقف لبضعة أيام، مما يتيح استمرار تتبع والتصوير من الوظائف ترانسفيكتيد. وهذا النهج عادة تسميات الوظائف عرضية ترحيل 5-20 كل شريحة الدماغ، تقليل عدد مرات التكرار التجريبية اللازمة للتوصل إلى دلالة إحصائية، بينما وصف سكان العصبية متفرقة بما فيه الكفاية لضمان سهولة فصل الخلايا العصبية الفردية لإعادة الإعمار وتقييم الخصائص المورفولوجية غرامة. وعلاوة على ذلك، مقارنة ب explants MGE، أورجانوتيبيك الثقافات ضمان أن ترحيل الوظائف يتعرض لبيئة أكثر طبيعية، بما في ذلك المستقطبات يفرز محلياً والمدخلات من أفيرينتس ثالاميك. وهذا النهج هكذا مناسبة تماما لتحديد اتجاه ومسار الهجرة اعتمدته transfected الإضافية، بينما تقدم التفاصيل التشريحية كافية للسماح لتوصيف أدق العمليات الحيوية مثل رائد عملية التفريع، نوكليوكينيسيس وتراجع عملية زائدة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

جميع التجارب التي تنطوي على الحيوانات قد وافقت ليه avec الممارسات المنازل des إينستيتوتيونيل لجنة البحوث الحيوانات الأليفة (سيببار) في مركز أبحاث سانت جوستين تشو وأجريت وفقا "المجلس الكندي" دليل "رعاية الحيوان" رعاية واستخدام الحيوانات التجريبية (الطبعة 2).

البروتوكول هو موضح هنا كان الأمثل انهانسر أجنة في اليوم الجنينية (ه) 13.5، في وقت فيه بنشاط إنشاء الإضافية المستمدة من MGE، قبل المستمدة من الذروة لفريق الخبراء الاستشاري وظائف الإنتاج45،46. وعلاوة على ذلك، للتحيز انهانسر نحو الوظائف جابايرجيك، فإننا نستخدم مروج أعرب بشكل انتقائي في الوظائف (على سبيل المثال المروج Dlx5/6 مع محسن الحد الأدنى)47.

1. إعداد حلول انهانسر والثقافات شريحة أورجانوتيبيك

  1. تعد 125 مل من العقيمة الثقافة المتوسطة.
    1. قياس 125 مل متوسطة الثقافة الخاصة بالخلايا العصبية العادية (انظر الجدول للمواد لصياغة) في زجاجة معقمة في السلامة الأحيائية سابقا للأشعة فوق البنفسجية-التعقيم مجلس الوزراء رش مع الإيثانول 70%. إضافة 2.25 مل 50 س الملحق خالية من المصل العصبية على حدة، 1.75 مل من الجلوتامين 200 ملم (تركيز النهائي من 0.5 مم) و 6.25 مل من مصل الحصان إبطال الحرارة الكوتيد سابقا تحت ظروف معقمة. مزيج دقيق، قاسمة في 15 مل أنابيب مخروطية العقيمة، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين إعداد الثقافة المتوسطة لمدة تصل إلى 3 أسابيع في 4 درجات مئوية.
    2. تقسم 100 × الحل الأسهم في بوتينستين N-2 صياغة48 إلى 150 ميليلتر مختبرين تحت ظروف معقمة وتجميد في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. تحضير 1 لتر النخاعي الاصطناعي المعقمة (قام).
    1. قياس 800 مل ماء المقطر في كوب 1 لتر. إضافة 25.67 ز السكروز، 5.08 غرام من كلوريد الصوديوم (NaCl)، ز 2.18 من بيكربونات الصوديوم (ناكو3)، ز 1.80 الجلوكوز، 0.19 غ كلوريد البوتاسيوم (بوكل)، 0.15 غ فوسفات الصوديوم اللامائى (نة2بو4)، 1 مل من م 1 الأسهم كاكل2 س.2H2و 2 مل 1 م الأسهم.7H مجسو42إثارة سين تذوب في درجة حرارة الغرفة. إضافة الماء المقطر للوصول إلى إجمالي حجم 1 ل.
    2. استخدام عامل تصفية 0.22 ميكرومتر، تصفية الحل في زجاجة معقمة في السلامة الأحيائية معقمة مجلس الوزراء وتخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  3. إعداد حل [اغروس] 4% في قام قبل كل تجربة جديدة.
    1. قياس 25 مل قام المجهز سابقا في أنبوب 50 مل مخروطية عقيمة وإضافة 1 غرام من [اغروس] نقطة انصهار منخفضة.
    2. الحرارة ل 45 ثانية في فرن ميكروويف. لتجنب تسرب، المقاطعة تدفئة كل 3-4 ثانية عندما يبدأ الغليان، فتح الأنبوب للسماح للضغط بها وإغلاقه مرة أخرى وتحرض يدوياً مزيج في [اغروس]. كرر حتى يتم الحل [اغروس] متجانسة. يبقى الحل [اغروس] في 42 درجة مئوية خلال ما تبقى من هذه التجربة لتجنب التجميد.
      ملاحظة: ارتفاع درجات الحرارة سوف تلف أنسجة المخ.

2-إعداد والبلازميدات لحقن

  1. سحب ماصة microinjection الزجاج
    1. تعيين ساحبة ميكروبيبيتي مع المعلمات المناسبة وتأمين الشعرية الزجاج في المساحة المتوفرة، وتأكد من أنه يتم توسيط مع الشعيرة.
    2. اضغط على زر السحب.
    3. بعناية إزالة الماصات microinjection حديثا جعلت من ساحبة الحرارة ومكانه في مربع أو طبق بيتري نظيفة حتى المزيد من استخدام لتجنب إتلاف التلميح.
  2. إنشاء مجلس الوزراء مع جميع الصكوك المتعلقة السلامة الأحيائية بحاجة لهذا التجربة (انظر الشكل 1A) وسخاء رش جميع الصكوك المتعلقة بالسلامة البيولوجية مجلس الوزراء مع الإيثانول 70% وتعقيم الأدوات والبيئة مع الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15-20 دقيقة.
  3. أثناء الخطوة التعقيم، ذوبان الجليد والبلازميدات على الجليد (4 درجات مئوية).
  4. قياس 10 ميليلتر من بلازميد من حل أسهم (4 ميكروغرام/ميليلتر) في أنبوب نظيف 1.5 مل أجهزة الطرد مركزي. إضافة 0.01 في المائة قرر الخضراء سريعة. المزيج بلطف وتدور بإيجاز والحفاظ على الجليد حتى الاستخدام.
    ملاحظة: ينبغي إعداد الإعدادية ماكسي الحمض النووي وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة باستخدام مجموعة الإعدادية ماكسي خالية من الذيفان. يمكن solubilized الحمض النووي في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات أو خالية من نوكلاس ح2س وإعداد بلازميد مع الصبغ ويمكن الحل، لكن لا تحتاج إلى أن تتم تحت ظروف معقمة. ينبغي أن تكون البلازميدات من ماكسي الإعدادية الكوتيد لتجنب دورات تجميد أذاب متعددة. ينبغي أن تكون مختلطة مع الصبغ لا أكثر أن 2 ح قبل استخدام البلازميدات الكوتيد ولا ينبغي أن يكون ريفروزين لاستخدامها مرة أخرى.
  5. بعد التعقيم، إعداد النانو-الحاقن كما يلي.
    1. اختر واحداً من ماصة microinjection الزجاج معدّة مسبقاً المخزنة في مربع نظيفة أو طبق بيتري واستخدام ملاقط صغيرة لقطع غيض من الماصة بطريقة مشطوف الحواف لتحقيق قطر خارجي لحوالي 15 ميكرون.
      ملاحظة: القطر الخارجي هنا هو تدبير تقريبي لإعطاء المستخدم فكرة لماذا نستخدم في تجاربنا وقد الأمثل بغية تيسير ثقب الجمجمة لحقن بلازميد دون الأضرار الدماغ، بينما يسمح للسائل تحميل والإفراج عن الحمض النووي. ويمكن قياس القطر الخارجي بالنظر إلى طرف قطع ماصة microinjection الزجاج apposed إلى شريط مقياس مكرمترك تحت مجهر حقل مشرق.
    2. استخدام المحاقن لملء في ميكروبيبيتي مع الزيت المعدني من نهايته أونبوليد (بطرد جميع الهواء).
    3. إدراج ميكروبيبيتي الزجاجية المشغولة في النانو-محقن باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    4. فارغة 2/3rds من ميكروبيبيتي الزجاج (الاحتفاظ بما يكفي من النفط للحيلولة دون دخول الهواء).
  6. إدراج ميكروبيبيتي المعدة في أنبوب يحتوي على الحل بلازميد/صبغ وملء ميكروبيبيتي الزجاج مع الحل بلازميد/صبغ بعناية.

3-جمع الماوس الأجنة من الإناث الحوامل

  1. مراقبة تربية الإناث يوميا لتقييم ليسد المهبل، يفضل أن تكون في نفس الوقت يوميا (بعد الظهر). E0.5 يوم يناظر اليوم الأول عندما يلاحظ سداده مهبلية.
    ملاحظة: يمكن إجراء التجارب الموضحة هنا في البرية من نوع الفئران. ومع ذلك، لتسهيل التعرف MGE وتسمية جميع الوظائف جابايرجيك (أو مجموعات فرعية محددة مثل الإضافية المستمدة من MGE)، الحيوانات المحورة وراثيا يمكن استخدامها (مثل: GAD67اجفب؛ Dlx5/6لجنة المساواة العرقية مع اليل مراسل لجنة المساواة العرقية، إلخ،من4749). في هذه الحالة، ينبغي التعبير عن بلازميد التجريبية حقن فلوروفوري آخر (على سبيل المثال مشري أو تدتوماتو) للسماح للتصور من دائرة الهجرة والتجنيس transfected (أصفر) التي يمكن مقارنتها مع وظائف غير ترانسفيكتيد (أخضر).
  2. التضحية بالأنثى في e13.5 يوم الجنينية، بخلع العنق.
    ملاحظة: وكلاء مخدر نظراً لوقت التضحية قد تؤثر في الهجرة والبقاء على قيد الحياة50،51 وينبغي تجنبها.
  3. جمع الأجنة بعملية قيصرية كما يلي.
    1. سخاء رش البطن الإناث مع الإيثانول 70%. سحب الجلد البطن مع زوج من الملقط المعقم، وناحية أخرى، استخدام مقص التعقيم الجراحي لقطع الجلد من البطن.
    2. مع زوج ثاني من الملقط المعقم ومقص، سحب لفافة البطن وقطع عليه مع تجنب بعناية في الرحم.
    3. استخدام زوج ثالثة الملقط المعقم ومقص، سحب قرون الرحم وقطع منها خارج تجويف الحوض. ضع قرون الرحم تشريح في طبق بتري 60 ملم معقمة مليئة المتوسطة الثقافة القائم على العصبية وتستكمل مع الأحماض الأمينية والفيتامينات والأملاح غير العضوية (انظر الجدول للمواد للمنتجات المتاحة تجارياً).
  4. في السلامة الأحيائية عقيمة مجلس الوزراء، استخدام اثنين من أزواج من ملاقط غرامة (واحد في كل يد) لتشريح الأجنة من المشيمة وعزل الرؤساء بقطع الرأس.
  5. مجسم مشطوف الحواف-قص طرف ماصة نقل البلاستيك المعقمة 3 مل، نضح الرؤساء ونقل لهم في طبق بتري 60 ملم معقمة جديدة والطبقات بالشمع الأسود الصلب ومليئة بنفس القائم على العصبية تكمل المتوسطة الثقافة كما ذكر أعلاه.
    ملاحظة: هذه الخطوة يقلل نقل الملوثات (الماوس الشعر والدم). الشمع الأسود يستخدم لتحقيق الاستقرار في الرأس أثناء التشريح. وسائط الثقافة لا تحتاج إلى أن يكون اﻷوكسيجين خلال هذه الإجراءات.

4-داخل البطيني بلازميد الحقن وانهانسر فيفو السابقين من MGE

ملاحظة: يجب إجراء الخطوات التالية تحت ظروف معقمة في السلامة البيولوجية المعدة سابقا مجلس الوزراء.

  1. الطبقات مكان طبق بيتري 60 ملم مع الشمع الأسود والتي تحتوي على رؤوس مقطوعة الرأس في القائم على العصبية يستكمل المتوسطة الثقافة تحت منظار في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
  2. استقرار الرأس والجزء روسترال التي تواجه الحق، مع غرامة ملاقط مع اليد اليسرى واستخدام النانو-الحاقن في اليد اليمنى لحقن 1-2 ميليلتر من الحل بلازميد/صبغ البطين الجانبي الحق.
    ملاحظة: يمكن أن يكون تعبير المشاركين تجارب أجرتها co-اليكتروبوراتينج بلازميد إنقاذ وبلازميد معربا عن شرنا بخلط كلا والبلازميدات تركيزات اكويمولار.
  3. اليكتروبوراتي حقن الدماغ.
    1. وضع رأسه بين الأقطاب مع مسرى السلبية المتمركزة في دورسالي وموازية للرأس ومسرى إيجابية نحو الجانب البطني من الرأس إلى الهدف MGE.
    2. متى جيدا يتم وضع أقطاب كهربائية، تسليم 4 نبضات مربعة من 40 الخامس ل 50 مللي ثانية في 500 مللي نبض بين الفواصل الزمنية.
    3. قم بإزالة أي الأنسجة المتبقية من أقطاب استخدام الملقط وضعت بالفعل في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
      ملاحظة: لقد تم تحسين هذه المعايير على وجه التحديد اليكتروبوراتور المستخدمة في تجاربنا. أننا نوصي المستخدمين بإجراء اختبارات الأمثل مسبقاً إذا كان استخدام نوع مختلف من اليكتروبوراتور.
    4. كرر الخطوات من 4.1 إلى 4.3 لجميع العقول الباقية.
      ملاحظة: على الرغم من أن هذا البروتوكول وصف المعالجات اللازمة للمخ واحد، من الممكن حقن العقول تصل إلى 4 التتابع قبل اليكتروبوراتينج كل الدماغ، مما يؤدي إلى زيادة المحصول. هذه الاستراتيجية مفيد خصوصا عندما والبلازميدات 2 أو أكثر مختلفة يتم حقن التتابع (مثل عنصر التحكم أو بلازميد التجريبية) خلال التجربة ذاتها (السماح للمقارنة بين ليتيرماتيس). وباﻹضافة إلى ذلك، هو ممكن لحقن واليكتروبوراتي في نفس الوقت كلا الجانبين من المخ لزيادة الغلة، عن طريق وضع أقطاب كهربائية موازيا تماما لسطح الدماغ.

5-الدماغ التشريح والثقافات شريحة أورجانوتيبيك

  1. بينما ما زال التلاعب في بيئة معقمة للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء، تشريح المخ خارج الجمجمة.
    1. استقرار الرأس على طبقة الشمع الأسود بإدخال إبرة في كل عين مع تجنب بعناية في الدماغ.
    2. استخدام زوج من ملاقط غرامة للاحتفاظ بالجانب الأيسر من الرقبة وزوج ثاني من ملاقط غرامة للدموع الجلد من الجمجمة، من الخلف إلى الأمام.
    3. حين عقد استخدام الرأس جانبياً بملاقط في يد واحدة، زوج آخر من ملاقط في اليد الأخرى لقطع الجمجمة بعناية على مستوى الدماغ وسحب بلطف في الجمجمة. مع كل الملاقط، قطع الجمجمة في الطائرة السهمي (خط الوسط) نحو الأمام، ومن ثم جداً جانبياً لتحرير جمجمة.
    4. رفع جذع الدماغ وقطع بعناية في السحايا واعصاب حتى الدماغ تماما خارج الجمجمة.
      ملاحظة: ينبغي إجراء جميع الخطوات الموضحة في 5.1 تحت ظروف معقمة الصارمة في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
  2. تضمين في الدماغ في 4% انخفاض ذوبان نقطة [اغروس] لتمزيقها.
    1. ملء طبق بتري 35 ملم مع الحل [اغروس] أعد أعلاه (الاحتفاظ السائل في 42 درجة مئوية).
    2. نقل بسرعة المخ اليكتروبوراتيد للطبق [اغروس] مملوءة باستخدام ماصة نقل قطع سابقا. نضع الطبق في درجة حرارة الغرفة.
    3. يحرك [اغروس] مع عصا معدنية للحفاظ على الدماغ في منتصف البئر (لمنع غرق) ووضع الدماغ في طائرة rostro والذيلية موازية للطبق. التوقف عن إثارة عندما يبدأ [اغروس] يصلب، لتجنب أي تلف في المخ.
    4. استخدام شفرة الحلاقة لقص [اغروس] المحيطة بالدماغ من أجل تشكيل كتلة مستطيلة الشكل، وترك هامش 1-2 ملليمتر حول الدماغ. التأكد من أن الجزء روسترال من الدماغ عمودي إلى الحد الأمامي من كتلة تيسيرا للتوجه لتقطيع الخطوات اللاحقة.
    5. كرر لكل الدماغ.
      ملاحظة: من الممكن خفض الدماغ واحد أو أكثر في وقت واحد (الحد الأقصى 3) بتشكيل كتل منفصلة [اغروس] أثناء إعداد كل الدماغ على ارتفاعات مختلفة.
  3. أقسام فيبرتوم الاكليلية وثقافة شريحة.
    1. ذوبان الجليد قاسمة واحد من 100 X N-2 الملحق (150 ميليلتر) على الجليد، وإضافة إلى 15 مل متوسط الثقافة الكوتيد تحت ظروف معقمة.
    2. نقل 750 ميليلتر من مستنبت (مع الملحق X N2 1) لكل بئر من لوحة الثقافة 6-جيدا.
    3. مع ملاقط المنحنية، مكان إدراج الثقافة خلية واحدة (30 مم، 0.4 حجم المسام ميكرومتر، PTFE) في كل شغل المتوسطة أيضا.
    4. ملء حمام فيبرتوم مع قام اﻷوكسيجين بشكل مستمر. كول إلى 4 درجات مئوية مع الجليد المحيطة بالحمام، أو استخدام فيبرتوم مبردة.
    5. تعيين سرعة فيبرتوم 0.150 مم/s والتردد إلى 80 هيرتز.
    6. الصق في الكتلة [اغروس] على منصة فيبرتوم وحافة روسترال إلى الأسفل والبطني الحافة التي يواجهها المستخدم.
    7. قص الدماغ في أقسام الاكليلية للحصول على 250 ميكرومتر سميكة المقاطع (في 4 درجات مئوية).
    8. مع ملاعق معقمة، جمع الأجزاء 2-3 التي تتضمن MGE ومكان إدراج جميع أقسام الدماغ من الحيوان واحدة على غشاء عيار 30 ملم واحد، مع تجنب التداخل بين أبواب الميزانية بعناية. وضع الإدراج في بئر واحدة للوحة الثقافة 6-جيدا (تحتوي على 750 ميليلتر لتستكمل الثقافة المتوسطة، كما هو موضح أعلاه). بدلاً من ذلك، يمكن وضع كل مقطع في غشاء منفصل 13 مم في لوحة ثقافة 12-بئر مليئة 500 ميليلتر تكمل الثقافة المتوسطة. كمية متوسطة الثقافة الموصى بها لكل بئر يسمح أقسام الدماغ أن تغذيها وسائل الإعلام دون أن تغمرها المياه.
      ملاحظة: الخطوات الموضحة في 5.3.6 و 5.3.7 لا تنفذ تحت ظروف معقمة كاملة، ما لم يمكن تعقيمها فيبرتوم والمستخدمة في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء. ولذلك، من الأهمية بمكان إجراء هذه الخطوات بعناية لتجنب أي تلوث. معدات الوقاية المناسبة (قناع النظيفة، والقفازات الجراحية ومعطف مختبر) يجب أن تلبس في جميع الأوقات وأجزاء الجسم، حتى تغطي، مثل الشعر والوجه واليدين، ينبغي أن يمر ابدأ عبر لوحات الثقافة (مع أو دون المتوسط الثقافة). من المستحسن أيضا لرش الإيثانول 70% غالباً على قفازات وملاعق المستخدمة في تجميع أجزاء الدماغ.
    9. ضع لوحة الثقافة في حاضنة عقيمة التهوية في 37 درجة مئوية مع 60% رطوبة و 5% CO2 48 أو 72 ساعة.
      ملاحظة: هذه الأوقات الحضانة كانت الأمثل لتصوير الوقت الفاصل بين الوظائف المستمدة من MGE وتصوير [كنفوكل] شرائح ثابتة، على التوالي. وينبغي اختبار مرات حضانة الأمثل مسبقاً لكل تصميم تجريبي. وبالإضافة إلى ذلك، إذا كان الحضانة المختار ح 72 وتحت، ليس هناك حاجة لتغيير الثقافة المتوسطة. لأوقات أطول في الحضانة، والمتوسطة الثقافة ينبغي تغيير كل 2-3 أيام.
    10. بعد الوقت المطلوب من الحضانة، نقل مقاطع الفائدة إلى ساترة 8 غرف وإضافة 3-5 ميليلتر من مستنبت. مكان ساترة في دائرة للبيئة (37 درجة مئوية، والرطوبة 60%، 5% CO2) متصلاً المقلوب الغزل القرص [كنفوكل] مزودة ببرنامج اقتناء الحاسوب لإعداد الدورة الوقت الفاصل بين التصوير.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، الأقسام يمكن أن تكون ثابتة مع بارافورمالدهيد 4% (بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو ح 2 في درجة حرارة الغرفة)، وبعد ذلك إيمونوستينيد مع الأجسام المضادة المختلفة لتصور السمات المورفولوجية اليكتروبوراتيد الوظائف تحت [كنفوكل] المجهر. على الرغم من أن يمكن تصور اجفب ومشري بالفحص المجهري [كنفوكل] دون أي إجراءات مضادة المصبوغة، نوصي بإجراء إيمونوهيستوتشيميستري ضد بروتينات فلورية خضراء ومشري لتعزيز الإشارات منذ عملية التثبيت يمكن أن تقلل من الأسفار، الحد الكشف عن العناصر الدقيقة للخلايا العصبية الجنينية، مثل فروع أصغر في عمليات سابقة أو لاحقة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

في هذا القسم، نحن نقدم الممثل النتائج التي تم الحصول عليها عقب انهانسر الرحم السابقين بلازميد تحكم، أو بلازميد تجريبية استهداف جين اهتمام، في MGE أجنة الفأر e13.5 تليها أورجانوتيبيك شريحة الثقافات المحتضنة في 37 درجة مئوية ح 48 (للتصوير بمرور الزمن) أو ح 72 (للتثبيت والوسم ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذه المقالة، نحن نقدم وسيلة موثوق بها لأداء السابقين الرحم انهانسر الماوس MGE في e13.5 وتوليد أورجانوتيبيك ثقافات شرائح الدماغ الجنينية. على الرغم من أن في المختبر أساليب، مثل المقايسة الدائرة Boyden, هي سهلة نسبيا لتنفيذ، ويمكن استخدامها لتقييم الأدوار المحددة لمختلف الجينات والب...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن. الآراء التي أعرب عنها هنا لا تمثل بالضرورة آراء وزير الصحة أو حكومة كندا.

Acknowledgements

هذا العمل وأيده العاملة المنح المقدمة من مؤسسة سافوي ومؤسسة الصرع علاج بمعدات المنح المقدمة من "المؤسسة الكندية" للابتكار إلى أ (مجهر [كنفوكل]) و G.H (الغزل القرص مجهر [كنفوكل]). الطوارىء يستلم جائزة مهنة من Fonds de بحوث دو كيبيك والصحة (فرق-S; جائزة كلينيسيانسسينتيست) كذلك من "المعاهد الكندية" "البحوث الصحية" (استوفوا؛ جائزة الشباب الباحث). الزمان أحد علماء كبار فرق-س. جنيه مصري من جائزة التدريب ما بعد الدكتوراه ستيريادي-سافوي من "مؤسسة سافوي"، مؤسسة سانت جوستين تشو التدريب ما بعد الدكتوراه والجائزة دا فرق التدريب ما بعد الدكتوراه، في شراكة مع "مؤسسة النجوم". هذا المشروع قد أصبح ممكناً الدماغ في كندا من خلال "الصندوق الكندي لأبحاث الدماغ"، بدعم مالي من وزارة الصحة الكندية، منحت إلى جنيه.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Neurobasal MediumThermoFisher Scientific21103049Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html
B-27 serum-free supplementThermoFisher Scientific1750404450X Serum-free neuron specific supplement
15 mL sterile centrifuge tubesSarstedt62.554.002
Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine)ThermoFisher Scientific11415064Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor's website 
L-GlutamineInvitrogen25030-081
Horse serum, heat inactivatedMillipore-SigmaH1138-500ML
Neurocell supplement N-2 100XWisent305-016Botteinstein's N-2 Formulation
VWR Square PETG Media Bottles 125 mLVWR89132-062
Class II Type A Biosafety CabinetNuaireNU-540
SucroseBioShopSUC700.1
Sodium ChlorideBioShopSOD001.1
Sodium bicarbonateThermoFisher ScientificS233-500
D+ glucoseMillipore-SigmaG7528-250G
Potassium ChlorideThermoFisher ScientificP217-500
Sodium phosphate monobasic anhydrousBioShopSPM400.500
Calcium chloride dihydrate ThermoFisher ScientificC79-500
Magnesium sulfate heptahydrateBiosShopMAG522
AgaroseBioShopAGA002.500
50 mL sterile centrifuge tubesSarstedt62.547.004
1.5 mL centrifuge tubesSarstedt72.690.001
P-97 Flaming/Brown Micropipette pullerSutter Instruments Co.Model P-97
0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary TubeDrummond scientific1-000-800/12
EthanolVWRE193
5 mL syringeBecton Dickinson & Co309646
Mineral Oil (heavy)Rougier Pharma
WPI Swiss Tweezers #5World Precision Instruments50451111 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these.
WPI Swiss Tweezers #7World Precision Instruments50450411.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips
HTC TweezersWorld Precision Instruments50461711 cm, Straight, flat
Operating scissorsWorld Precision Instruments50122516 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these.
Dressing ForcepsWorld Precision Instruments50121712.5 cm, straight, serrated
Iris ForcepsWorld Precision Instruments50447810.2 cm, full curve, serrated
DeBakey Tissue ForcepsWorld Precision Instruments50199615 cm, 45° angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide
Fisherbran Microspatula with rounded endsFisherScientific21-401-5You will need 2 of these.
Nanoject II Auto-Nanoliter InjectorDrummond scientific3-000-204
TC Dish 60, StandardSarstedt83.390160-mm dish
Tissue culture dishSarstedt83.180035-mm dish
Black WaxFisherScientificS17432
Transfer pipettes Ultident170-CTB700-2123 mL, small bulb
Stereo MicroscopeLeica BiosystemsLeica M80In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific)
Electro Square PoratorBTX Harvard ApparatusECM 830
Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mmBTX Harvard Apparatus45-0487
25G 1 1/2Becton Dickinson & Co305127
Leica VT1000S Vibrating blade microtomeLeica BiosystemsVT1000S
GEM, Single edge razor bladeElectron Microscopy Sciences71952-10Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome
µ-Slide 8 wellIbidi80827Pack of 15
Millicell cell culture insertMillipore-SigmaPICM0RG5030 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore, pack of 50. 
Leica DMi6000 microscopeLeica MicrosystemsN/A
Spinning disk confocal head Ultraview VoxPerkin ElmerN/A
Volocity 6.0 acquisition softwareImprovision/Perkin ElmerN/A
LiveCell Stage top incubation systemPathology devicesLC30030Provides Temperature, CO2 and humidity control. 
SP8 confocal microscopeLeica
mCherry-Lifeact-7Addgene54491Gift from Michael Davidson
Fast Green FCFMillipore-SigmaF7258-25G25G bottle, certified by the Biological Stain Commission

References

  1. Rossignol, E. Genetics and function of neocortical GABAergic interneurons in neurodevelopmental disorders. Neural Plast. , 649325(2011).
  2. Jiang, X., Lachance, M., Rossignol, E. Involvement of cortical fast-spiking parvalbumin-positive basket cells in epilepsy. Prog Brain Res. 226, 81-126 (2016).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
  5. Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J Physiol. 562 (Pt 1), 9-26 (2005).
  6. Rudy, B., Fishell, G., Lee, S., Hjerling-Leffler, J. Three groups of interneurons account for nearly 100% of neocortical GABAergic neurons. Dev Neurobiol. 71 (1), 45-61 (2011).
  7. Marin, O. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of neocortical interneurons. Eur J Neurosci. 38 (1), 2019-2029 (2013).
  8. Flames, N., et al. Short- and long-range attraction of cortical GABAergic interneurons by neuregulin-1. Neuron. 44 (2), 251-261 (2004).
  9. Zhu, Y., Li, H. -S., Zhou, L., Wu, J. Y., Rao, Y. Cellular and molecular guidance of GABAergic neuronal migration from an extracortical origin to the neocortex. Neuron. 23, 473-485 (1999).
  10. Zimmer, G., et al. Ephrin-A5 acts as a repulsive cue for migrating cortical interneurons. Eur J Neurosci. 28 (1), 62-73 (2008).
  11. Nobrega-Pereira, S., et al. Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors. Neuron. 59 (5), 733-745 (2008).
  12. Lodato, S., et al. Excitatory projection neuron subtypes control the distribution of local inhibitory interneurons in the cerebral cortex. Neuron. 69 (4), 763-779 (2011).
  13. Elias, L. A., Turmaine, M., Parnavelas, J. G., Kriegstein, A. R. Connexin 43 mediates the tangential to radial migratory switch in ventrally derived cortical interneurons. J Neurosci. 30 (20), 7072-7077 (2010).
  14. Bellion, A., Baudoin, J. P., Alvarez, C., Bornens, M., Metin, C. Nucleokinesis in tangentially migrating neurons comprises two alternating phases: Forward migration of the Golgi/centrosome associated with centrosome splitting and myosin contraction at the rear. J Neurosci. 25 (24), 5691-5699 (2005).
  15. Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (2), a001834(2010).
  16. Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J Neurosci. 30 (25), 8660-8670 (2010).
  17. Wamsley, B., Fishell, G. Genetic and activity-dependent mechanisms underlying interneuron diversity. Nat Rev Neurosci. , (2017).
  18. Chu, J., Anderson, S. A. Development of cortical interneurons. Neuropsychopharmacology. 40 (1), 16-23 (2015).
  19. Metin, C., Baudoin, J. P., Rakic, S., Parnavelas, J. G. Cell and molecular mechanisms involved in the migration of cortical interneurons. Eur J Neurosci. 23 (4), 894-900 (2006).
  20. Hernandez-Miranda, L. R., Parnavelas, J. G., Chiara, F. Molecules and mechanisms involved in the generation and migration of cortical interneurons. ASN Neuro. 2 (2), e00031(2010).
  21. Batista-Brito, R., et al. The cell-intrinsic requirement of Sox6 for cortical interneuron development. Neuron. 63 (4), 466-481 (2009).
  22. Marcorelles, P., et al. Evidence for tangential migration disturbances in human lissencephaly resulting from a defect in LIS1, DCX and ARX genes. Acta Neuropathol. 120 (4), 503-535 (2010).
  23. McManus, M. F., Nasrallah, I. M., Pancoast, M. M., Wynshaw-Boris, A., Golden, J. A. Lis1 is necessary for normal non-radial migration of inhibitory interneurons. Am J Pathol. 165 (3), 775-784 (2004).
  24. Pancoast, M., Dobyns, W., Golden, J. A. Interneuron deficits in patients with the Miller-Dieker syndrome. Acta Neuropathol. 109 (4), 400-404 (2005).
  25. Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. In Vitro, Ex Vivo and In Vivo Techniques to Study Neuronal Migration in the Developing Cerebral Cortex. Brain Sci. 7 (5), (2017).
  26. Wang, Z. Z., et al. Chemokine-like factor 1 promotes the migration of rat primary cortical neurons by the induction of actin polymerization. Neuroreport. 25 (15), 1221-1226 (2014).
  27. Zito, A., et al. Neuritin 1 promotes neuronal migration. Brain Structure and Function. 219 (1), 105-118 (2014).
  28. Rakic, S., et al. Cdk5 phosphorylation of ErbB4 is required for tangential migration of cortical interneurons. Cereb Cortex. 25 (4), 991-1003 (2015).
  29. van den Berghe, V., et al. Directed migration of cortical interneurons depends on the cell-autonomous action of Sip1. Neuron. 77 (1), 70-82 (2013).
  30. Nery, F. C., et al. New methods for investigation of neuronal migration in embryonic brain explants. J Neurosci Methods. 239, 80-84 (2015).
  31. Vidaki, M., et al. Rac1-dependent cell cycle exit of MGE precursors and GABAergic interneuron migration to the cortex. Cereb Cortex. 22 (3), 680-692 (2012).
  32. Lysko, D. E., Putt, M., Golden, J. A. SDF1 reduces interneuron leading process branching through dual regulation of actin and microtubules. J Neurosci. 34 (14), 4941-4962 (2014).
  33. Tielens, S., et al. Elongator controls cortical interneuron migration by regulating actomyosin dynamics. Cell Res. 26 (10), 1131-1148 (2016).
  34. Shinohara, R., et al. A role for mDia, a Rho-regulated actin nucleator, in tangential migration of interneuron precursors. Nat Neurosci. 15 (3), S371-372 373-380 (2012).
  35. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
  36. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518(2014).
  37. Tobet, S. A., Hanna, I. K., Schwarting, G. A. Migration of neurons containing gonadotropin releasing hormone (GnRH) in slices from embryonic nasal compartment and forebrain. Dev Brain Res. 97 (2), 287-292 (1997).
  38. Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
  39. Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons. J Neurosci. 32 (2), 738-745 (2012).
  40. Friocourt, G., et al. Both doublecortin and doublecortin-like kinase play a role in cortical interneuron migration. J Neurosci. 27 (14), 3875-3883 (2007).
  41. Murthy, S., et al. Serotonin receptor 3A controls interneuron migration into the neocortex. Nat Commun. 5, 5524(2014).
  42. Nichols, A. J., O'Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).
  43. Pacary, E., Guillemot, F. Cerebral cortex electroporation to study projection neuron migration. Curr Protoc Neurosci. 77, 2.26.21-22.26.18 (2016).
  44. Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. The caudal migratory stream: A novel migratory stream of interneurons derived from the caudal ganglionic eminence in the developing mouse forebrain. J Neurosci. 25 (31), 7268-7277 (2005).
  45. Butt, S. J., et al. The requirement of Nkx2-1 in the temporal specification of cortical interneuron subtypes. Neuron. 59 (5), 722-732 (2008).
  46. Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).
  47. Zerucha, T., et al. A highly conserved enhancer in the Dlx5/Dlx6 intergenic region is the site of cross-regulatory interactions between Dlx genes in the embryonic forebrain. J Neurosci. 20 (2), (2000).
  48. Bottenstein, J. E. Cell culture in the neurosciences. , Plenum Press. (1985).
  49. Wang, Y., et al. Dlx5 and Dlx6 regulate the development of parvalbumin-expressing cortical interneurons. J Neurosci. 30 (15), 5334-5345 (2010).
  50. Zheng, H., et al. Sevoflurane anesthesia in pregnant mice induces neurotoxicity in fetal and offspring mice. Anesthesiology. 118 (3), 516-526 (2013).
  51. Zhao, T., et al. Prenatal ketamine exposure causes abnormal development of prefrontal cortex in rat. Sci Rep. 6, 26865(2016).
  52. Timpe, J. M., Wang, C. Z., Kim, J., Johnson, K. M. Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazoleproprionic acid receptor activation protects against phencyclidine-induced caspase-3 activity by activating voltage-gated calcium channels. J Neurosci Res. 92 (12), 1785-1791 (2014).
  53. Myers, A. K., Meechan, D. W., Adney, D. R., Tucker, E. S. Cortical interneurons require Jnk1 to enter and navigate the developing cerebral cortex. J Neurosci. 34 (23), 7787-7801 (2014).
  54. Lopez-Bendito, G., et al. Chemokine signaling controls intracortical migration and final distribution of GABAergic interneurons. J Neurosci. 28 (7), 1613-1624 (2008).
  55. Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32 (49), 17690-17705 (2012).
  56. Anderson, S. A., et al. Mutations of the homeobox genes Dlx-1 and Dlx-2 disrupt the striatal subventricular zone and differentiation of late born striatal neurons. Neuron. 19 (1), 27-37 (1997).
  57. Stuhmer, T., Anderson, S. A., Ekker, M., Rubenstein, J. L. Ectopic expression of the Dlx genes induces glutamic acid decarboxylase and Dlx expression. Development. 129 (1), 245-252 (2002).
  58. Godin, J. D., et al. p27(Kip1) is a microtubule-associated protein that promotes microtubule polymerization during neuron migration. Dev Cell. 23 (4), 729-744 (2012).
  59. Rossokhin, A. V., Sharonova, I. N., Bukanova, J. V., Kolbaev, S. N., Skrebitsky, V. G. Block of GABA(A) receptor ion channel by penicillin: Electrophysiological and modeling insights toward the mechanism. Mol Cell Neurosci. 63, 72-82 (2014).
  60. Lindquist, C. E., Dalziel, J. E., Cromer, B. A., Birnir, B. Penicillin blocks human alpha 1 beta 1 and alpha 1 beta 1 gamma 2S GABAA channels that open spontaneously. Eur J Pharmacol. 496 (1-3), 23-32 (2004).
  61. Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62 (1), 53-71 (2009).
  62. Lin-Hendel, E. G., McManus, M. J., Wallace, D. C., Anderson, S. A., Golden, J. A. Differential mitochondrial requirements for radially and non-radially migrating cortical neurons: Implications for mitochondrial disorders. Cell Rep. 15 (2), 229-237 (2016).
  63. Lourenco, M. R., Garcez, P. P., Lent, R., Uziel, D. Temporal and spatial regulation of interneuron distribution in the developing cerebral cortex--an in vitro study. Neuroscience. 201, 357-365 (2012).
  64. Mahajani, S., et al. Lamin B1 levels modulate differentiation into neurons during embryonic corticogenesis. Sci Rep. 7 (1), 4897(2017).
  65. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. J Neurosci. 27 (12), 3078-3089 (2007).
  66. Close, J. L., et al. Single-cell profiling of an in vitro model of human interneuron development reveals temporal dynamics of cell type production and maturation. Neuron. 93 (5), e1035 1035-1048 (2017).
  67. Chen, Y. J., et al. Single-cell RNA sequencing identifies distinct mouse medial ganglionic eminence cell types. Sci Rep. 7, 45656(2017).
  68. Michaud, J. L., et al. The genetic landscape of infantile spasms. Hum Mol Genet. 23 (18), 4846-4858 (2014).
  69. Allen, A. S., et al. De novo mutations in epileptic encephalopathies. Nature. 501 (7466), 217-221 (2013).
  70. Bery, A., Merot, Y., Retaux, S. Genes expressed in mouse cortical progenitors are enriched in Pax, Lhx, and Sox transcription factor putative binding sites. Brain Res. 1633, 37-51 (2016).
  71. Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic interactions between intermediate neurogenic progenitors and radial glia in embryonic mouse neocortex: potential role in Dll1-Notch signaling. J Neurosci. 33 (21), 9122-9139 (2013).
  72. Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).
  73. Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
  74. Machacek, M., et al. Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion. Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

134 e13 5

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved