JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويصف هذه المخطوطة بروتوكولا لدراسة تأثير مضادات الميكروبات 5-aminolevulinic حمض بوساطة العلاج الضوئي (علاء التوقيت الصيفي الباسفيكي) في بيوفيلم العنقوديات الذهبية . يمكن استخدام هذا البروتوكول لتطوير نموذج في المختبر لدراسة علاج الأغشية الحيوية البكتيرية مع التوقيت الصيفي الباسفيكي في المستقبل.

Abstract

المكوّرات العنقودية الذهبية (S. aureus) من مسببات الأمراض بشرية مشتركة، الذي يسبب التهابات قيحية والجهازية. عدوى المكوّرات س يصعب القضاء عليه ليس فقط بسبب ظهور سلالات مقاومة للمضادات الحيوية ولكن أيضا قدرتها على شكل الأغشية الحيوية. وقد أشير مؤخرا، العلاج الضوئي (التوقيت الصيفي الباسفيكي) كواحد من العلاجات المحتملة للسيطرة على العدوى بيوفيلم. ومع ذلك، كذلك الدراسات مطلوبة لتحسين معرفتنا بتأثيرها على الأغشية الحيوية البكتيرية، فضلا عن الآليات الكامنة. ويصف هذه المخطوطة نموذجا في المختبر للتوقيت الصيفي الباسفيكي مع 5-aminolevulinic حمض (5-علاء)، تمهيدا محسس ضيائي الفعلية، بروتوبورفيرين التاسع (بي). بإيجاز، ناضجة في المذهبة س. الأغشية الحيوية المحتضنة مع علاء وثم عرضه للضوء. في وقت لاحق، أثر مضاد علاء التوقيت الصيفي الباسفيكي في المذهبة س. بيوفيلم كمياً عن طريق حساب مستعمرة تشكيل وحدات (كفوس) وتصور بجدوى الفلورسنت تلطيخ عبر الليزر [كنفوكل] الفحص المجهري (كلسم). وأظهرت نتائج تمثيلية تأثير مضاد قوي لعلاء التوقيت الصيفي الباسفيكي في المذهبة س. الأغشية الحيوية. هذا البروتوكول هو بسيط ويمكن استخدامها لوضع نموذج في المختبر لدراسة علاج الأغشية الحيوية في المذهبة س. مع علاء التوقيت الصيفي الباسفيكي. في المستقبل، أنها أيضا يمكن أن تكون مرجعاً في التوقيت الصيفي الباسفيكي دراسات استخدام الضيائية الأخرى للسلالات البكتيرية المختلفة مع الحد الأدنى من التعديلات.

Introduction

س المذهبة من مسببات المرض إيجابية هامة كولونيزيس الجلد والغشاء المخاطي للمضيفين البشرية. قدرته على شكل الأغشية الحيوية يعتبر جانبا هاما في نشوء المرض1. الأغشية الحيوية البكتيرية هي مجتمع بكتيريا جزءا لا يتجزأ من مصفوفة منتجة ذاتيا، وهي تتألف من المواد البوليمرية خارج الخلية، بما في ذلك السكاريد والحمض النووي والبروتين. هذه المصفوفة يلعب دوراً هاما في استمرار وجود العدوى البكتيرية، تسهم بدرجة عالية من المقاومة للجهاز المناعي البشري و العلاجات المضادة للميكروبات الحالي2. المضادات الحيوية لا تزال الرئيسية علاج التهابات بيوفيلم، على الرغم من أن تقتصر آثار المضادات الحيوية في الأغشية الحيوية. لقد ثبت سابقا أن خلايا الأغشية الحيوية 10-000 1 مرة أكثر مقاومة للمضادات الحيوية مقارنة نظرائهم العوالق3. وبالتالي، هناك حاجة إلى استراتيجيات بديلة للتغلب على هذه المشكلة.

التوقيت الصيفي الباسفيكي، علاج بديل للعدوى البكتيرية، يستخدم الضوء طول موجي مناسب لتنشيط الضيائية. وهذا يؤدي إلى إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (روس)، التي قاتلة للخلايا المستهدفة بتعطيل جدار الخلية ويخمد الإنزيمات وإتلاف الحمض النووي4. وهذه الخاصية متعدد الأهداف يجعل من الصعب على البكتيريا تطوير مقاومة للعلاج التوقيت الصيفي الباسفيكي.

ودرست تأثير مضادات الميكروبات للتوقيت الصيفي الباسفيكي في الأغشية الحيوية البكتيرية والفطرية، مع الضيائية متعددة، مثل أزرق تولويدين، الملكيت الأخضر والأزرق الميثيلين، e6 الكلور والبورفيرنيات، في التقارير السابقة5،6، 7،،من89،10،11،،من1213. 5-علاء، تتميز prodrug من محسس ضيائي الفعلية، بي، بالوزن الجزيئي صغير والتخليص السريع12،14. تعطي هذه المزايا المحتملة الرئيسية علاء التوقيت الصيفي الباسفيكي كتطبيق العلاج. على الرغم من أن قد درست أثر علاء التوقيت الصيفي الباسفيكي على البكتيريا العوالق العديد من مجموعات12، أثر الميكروبات علاء التوقيت الصيفي الباسفيكي في الأغشية الحيوية البكتيرية قد لا بعد تم توضيحها. وفي الوقت نفسه، من الصعب مقارنة النتائج بين الدراسات السابقة. أحد الأسباب هو أن البروتوكولات المختلفة المستخدمة من الجماعات المتنوعة. وهكذا يصف هذا البروتوكول نموذجي في المختبر نظام علاء التوقيت الصيفي الباسفيكي استناداً إلى أن العمل السابق15. وأكد أثر هذا النموذج حساب زيمبابوي واستمرارية تلطيخ مع كلسم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1-بيوفيلم تشكيل

  1. تشكيل بيوفيلم في 96-بئر ميكروبلاتيس
    1. استرداد سلالة المذهبة س. USA300 و 3 تشكيل بيوفيلم السريرية سلالات (C1-C3) المخزنة في-80 درجة مئوية.
      ملاحظة: قدرة سلالات السريرية للنموذج الأغشية الحيوية تحدده المقايسة لوحة microtiter الموصوفة سابقا15.
    2. تلقيح البكتيريا في 5 مل تريبتوني الصويا مرق (TSB) المتوسطة، وزراعتها في حاضنة مع تهتز عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها إلى مرحلة ثابتة.
    3. الطرد المركزي ثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها في 4,000 س ز لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية وثم تجاهل المادة طافية. ريسوسبيند الكريات في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بتركيز نهائي من 2.0 × 109 زيمبابوي/مل.
      ملاحظة: تركيز البكتيريا كان يقدر بقياس الكثافة الضوئية وقرر كذلك بلوحة عد16، تكشف عن أن التطوير التنظيمي 1600 من التعليق الوارد 1.5 × 108 زيمبابوي/مل.
    4. تمييع تعليق البكتيرية إلى 1: 200 (1.0 × 107 زيمبابوي/mL) في المتوسط TSB تحتوي على جلوكوز 0.5%. تطعيم 200 ميليلتر من تعليق البكتيرية في كل بئر الميكروسكوبية 96-جيدا البوليستيرين التعامل مع ثقافة الخلية.
    5. احتضان الميكروسكوبية بشكل ثابت في 37 درجة مئوية ح 24 تحت بيئة اﻷوكسيجين جيدا.
      ملاحظة: قد تختلف فترة الحضانة لتشكيل بيوفيلم ناضجة للسلالات البكتيرية المختلفة؛ وهذا ينبغي أن تحدد قبل التوقيت الصيفي الباسفيكي تجربة15.
    6. تجاهل وسائل الإعلام في الآبار وغسل الآبار الميكروسكوبية بلطف مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات وثم تجاهل المادة طافية.
      ملاحظة: الخطوة ينبغي أن يتم بلطف جداً لتفادي إزعاج بيوفيلم تشكيل.
  2. تشكيل بيوفيلم في الأطباق
    1. تلقيح سلالة S. aureus USA300 في 5 مل متوسطة TSB، وزراعتها في حاضنة مع تهتز عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها إلى مرحلة ثابتة.
    2. الطرد المركزي ثقافة البكتيرية بين عشية وضحاها في 4,000 س ز لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية وثم تجاهل المادة طافية. ريسوسبيند الكريات في برنامج تلفزيوني لتركيز نهائي من 2.0 × 109 زيمبابوي/مل. ثم، تمييع تعليق البكتيرية إلى 1: 200 (1.0 × 107 زيمبابوي/mL) في المتوسط TSB تحتوي على جلوكوز 0.5%. تلقيح 2 مل تعليق البكتيرية في صحن ثقافة خلية أسفل زجاج جودة بصرية 35 ملم، واحتضان بشكل ثابت في 37 درجة مئوية ح 24.
      ملاحظة: قدرت تركيز البكتيريا قياس الكثافة الضوئية.
    3. نضح وسائط الإعلام مع ماصة، وثم أشطف الأغشية الحيوية في الطبق بلطف مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات وبعد ذلك، تجاهل المادة طافية بعناية.
      ملاحظة: تجنب لمس طرف الماصة إلى الجزء السفلي من الطبق. يجب أن تقوم بالخطوة 2.2 فورا بعد هذه الخطوة منع تجفيف بيوفيلم تشكيل.

2-الضوء تشعيع

  1. تخزين 5-علاء في ثلاجة 4 درجات مئوية. قبل التجربة، يضعف 5-علاء مع برنامج تلفزيوني إلى 10 مم.
    ملاحظة: 5-علاء الحل ينبغي أن يكون طازج قبل التجربة.
  2. في المجموعة التجريبية، إضافة 200 ميليلتر من 10 مم علاء لكل بئر ميكروسكوبية أو 2 مل إلى الطبق الثقافة. تغطية صفيحة/الطبق مع رقائق الألومنيوم، واحتضان ح 1. ثم، يتهددها اللوحة/الطبق مع أدى (الصمام) بكثافة ضوء من 100 ميغاواط/سم2 لح 1 تحقيق جرعة خفيفة من 360 ي/سم2 في موجه كبيرة من شمال البحر الأبيض المتوسط ± 10 63317.
    ملاحظة: بغية السماح للطاقة الضوئية تسليمها فعلياً وعلى قدم المساواة إلى بيوفيلم في جميع الآبار/الأطباق، إصلاح المسافة من ذروة مصدر الضوء إلى البئر/الطبق في سم 6.0، وتحد من منطقة تجريبية لمنطقة وسط التشعيع (10 سم × 8 سم). للتأكد من أن النتائج استنساخه، ينبغي أن تجري هذه التجارب في نفس درجة حرارة الغرفة.
    في الخطوة تشعيع الصمام، لتجنب التعرض المباشر اللوحة لمصادر الضوء الأخرى، مثل ضوء الشمس أو إضاءة الغرفة أو lamplight، LED تم تشغيله قبل نقل اللوحة/الطبق إلى منطقة الإشعاع، وعلى ضوء مشرق بما يكفي لإنهاء العملية.
  3. قم بإعداد مجموعات المراقبة (مراقبة ثلاث مجموعات أقيمت في تجربتنا).
    1. لعنصر التحكم الأول إضافة مجموعة (علاء-LED-)، 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر الصفيحة أو 2 مل إلى الطبق الثقافة. تغطية صفيحة/الطبق مع رقائق الألومنيوم، واحتضان من أجل ح 2.
    2. للسيطرة على المجموعة الثانية (علاء + LED-)، إضافة 200 ميليلتر من 10 مم علاء لكل بئر الصفيحة أو 2 مل إلى الطبق الثقافة. تغطية صفيحة/الطبق مع رقائق الألومنيوم، واحتضان من أجل ح 2.
    3. للسيطرة على المجموعة الثالثة (علاء-أدى +)، إضافة 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني لكل بئر الصفيحة أو 2 مل إلى الطبق الثقافة. تغطية صفيحة/الطبق مع رقائق الألومنيوم، واحتضان من أجل ح 1. ثم تعرض اللوحة للصمام مع 360 ي/سم2 الخفيفة التشعيع في موجه كبيرة من 633 نانومتر ± 1017.
      ملاحظة: في الخطوة تشعيع الصمام، تجنب التعرض المباشر اللوحة لمصادر الضوء الأخرى، مثل ضوء الشمس أو إضاءة الغرفة lamplight.

3-تحديد فعالية العلاج التوقيت الصيفي الباسفيكي

ملاحظة: للتأكد من أثر علاء التوقيت الصيفي الباسفيكي في الأغشية الحيوية S. aureus ، قيمت صلاحية الخلايا مع أو بدون علاء التوقيت الصيفي الباسفيكي عد زيمبابوي فضلا عن جدوى تلطيخ.

  1. تحديد الخلايا البكتيرية قابلة للحياة الباقية
    1. بعد العلاج علاء التوقيت الصيفي الباسفيكي، وتجاهل وسائل الإعلام في الآبار وغسل الآبار مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات إزالة كافة الخلايا غير ملتصقة على حد سواء التجريبية والتحكم في مجموعات.
      ملاحظة: هذه الخطوة ينبغي أن تتم بلطف جداً.
    2. كشط الخلايا البكتريا ملتصقة تماما من الآبار بطرف الماصة وجمع الخلايا في أنابيب مخروطية الشكل.
    3. الطرد المركزي من تعليق البكتيرية في 4,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية، ثم تجاهل المادة طافية.
    4. ريسوسبيند البكتيريا في 1 مل إنزيم بنكرياتين 0.25% في برنامج تلفزيوني واحتضان في 37 درجة مئوية ح 1.5.
    5. الطرد المركزي في 4,000 س ز لمدة 10 دقائق؛ تجاهل المادة طافية، ثم ريسوسبيند بيليه في 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
    6. جعل تخفيف المسلسل الحل خلية مع برنامج تلفزيوني؛ 01:10 ثم إضافة 5 ميليلتر من كل عينة تمييع المسلسل على لوح أجار (TSA) فول الصويا تريبتوني. احتضان لوحة حساب السياحة الفرعي في 37 درجة مئوية ح 16؛ ثم، حساب (بالعين المجردة) عدد المستعمرات البكتيرية (زيمبابوي/mL).
  2. المراقبة في المذهبة س. الأغشية الحيوية التي كلسم
    1. بعد تشعيع الضوء، يغسل الأغشية الحيوية في الطبق الثقافة مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
      ملاحظة: هذه الخطوة ينبغي أن تتم بلطف جداً.
    2. أضف 1 مل من 1 ميكرومتر الأخضر-فلوري النووية ووصمة عار كروموسوم التي يسهل اختراقها لأغشية الخلية بدائية النواة (مثلاً، SYTO9) و 1 مل من يوديد propidium 1 ميكرومتر (PI) لمدة 20 دقيقة وصمة عار بيوفيلم فضلا عن الخلايا الميتة.
    3. مراقبة خلايا قابلة للحياة (الأخضر الأسفار، Ex/nm nm/530 م 485) والخلايا الميتة (ومضان أحمر، السابقين/485 م شمال البحر الأبيض المتوسط/630nm) تحت كلسم مع عدسة هدف نفط-غمر 63 × 1.4-نا.
    4. إنشاء الصور باستخدام برامج الفحص المجهري.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

بقاء البكتيريا في الأغشية الحيوية انخفض بعد العلاج علاء التوقيت الصيفي الباسفيكي بالمقارنة مع عناصر التحكم (علاء-LED-، علاء + LED-، وعلاء-أدى +) في كل من USA300 وثلاث سلالات السريرية (الشكل 1).

لتأكيد النتائج من زيمبابوي الاعتداء و...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

التوقيت الصيفي الباسفيكي تم علاج مدروسة لعلاج السرطان منذ اخترع قبل أكثر من 100 سنة18. على مدى العقد الماضي، التوقيت الصيفي الباسفيكي طبق كاستراتيجية مضادة للميكروبات وقد أظهرت فعالية ضد بعض البكتيريا المسببة للأمراض المقاومة للمضادات الحيوية12. بالمقارنة مع الدو...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل "مؤسسة الصين للعلوم الطبيعة الوطنية" للعلماء الشباب (رقم 81300810)، وبرنامج تدريب طبيب الشباب شانغهاي (رقم 20141057)، والوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (81671982 و 81271791 و 81571955). نود أن نشكر ليتبوب (www.letpub.com) لتقديم المساعدة اللغوية أثناء إعداد هذه المخطوطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Tryptone Soya Broth (TSB)OXOIDCM0129B
Tryptone Soya Agar (TSA)OXOIDCM0131
SYTO9Thermo Fisher ScientificL7012The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits 
Propidium iodide (PI)Thermo Fisher ScientificL7012The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits 
PancreatinSigma-AldrichP3292
5-aminolevulinic acid (ALA)Fudan Zhangjiang Bio-Pharm3.1
Staphylococcus aureus strain USA300//The source of USA 300 references “Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6”.
Staphylococcus aureus clinical strains (C1-C3)//All clinical strains were isolated from patients with chronic rhinosinusitis in the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye and ENT Hospital of Fudan University [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627].
96-well microplateCorning Inc3599Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile
FluorodishNEST Biotechnology801001Glass bottom, Non-pyrogenic
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mLEppendorf0030120086
Eppendorf microcentrifuge 5417EppendorfZ365998 | SIGMA
IncubatorThermo Fisher ScientificSHKE4000MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shakers
Light emitting diode (LED)Wuhan Yage Optic and Electronic Technique COLED-IB
Leica TCS SP8 confocal laser-scanning microscopeLeica Microsystems
Leica LAS AF softwareLeica Microsystems
IMARIS softwareBitplane

References

  1. Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).
  2. Rabin, N., et al. Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents. Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).
  3. Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
  4. Sharma, M., et al. Toluidine blue-mediated photodynamic effects on staphylococcal biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 52 (1), 299-305 (2008).
  5. Rosa, L. P., da Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. In vitro effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy (APDT) using a 660 nm laser and malachite green dye in Staphylococcus aureus biofilms arranged on compact and cancellous bone specimens. Lasers Med Sci. 29 (6), 1959-1965 (2014).
  6. Rosa, L. P., Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. Effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy using a 660 nm laser and methyline blue dye for inactivating Staphylococcus aureus biofilms in compact and cancellous bones: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 12 (2), 276-281 (2015).
  7. Mai, B., et al. The antibacterial effect of sinoporphyrin sodium photodynamic therapy on Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cultures. Lasers Surg Med. 48 (4), 400-408 (2016).
  8. Gandara, L., Mamone, L., Bohm, G. C., Buzzola, F., Casas, A. Enhancement of photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus biofilms by disruptive strategies. Lasers Med Sci. 32 (8), 1757-1767 (2017).
  9. Baltazar, L. M., et al. Antimicrobial photodynamic therapy: an effective alternative approach to control fungal infections. Front Microbiol. 6, 202(2015).
  10. Fernandes, T., Bhavsar, C., Sawarkar, S., D'Souza, A. Current and novel approaches for control of dental biofilm. Int J Pharm. 536 (1), 199-210 (2017).
  11. De Sordi, L., et al. Development of Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) for Clostridium difficile. PLoS One. 10 (8), e0135039(2015).
  12. Harris, F., Pierpoint, L. Photodynamic therapy based on 5-aminolevulinic acid and its use as an antimicrobial agent. Med Res Rev. 32 (6), 1292-1327 (2012).
  13. Donnelly, R. F., McCarron, P. A., Tunney, M. M. Antifungal photodynamic therapy. Microbiol Res. 163 (1), 1-12 (2008).
  14. Shi, H., Li, J., Zhang, H., Zhang, J., Sun, H. Effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Candida albicans biofilms: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 15, 40-45 (2016).
  15. Zhang, Q. Z., et al. 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy and its strain-dependent combined effect with antibiotics on Staphylococcus aureus biofilm. PLoS One. 12 (3), 0174627(2017).
  16. Chang, Y. C., et al. Rapid single cell detection of Staphylococcus aureus by aptamer-conjugated gold nanoparticles. Sci Rep. 3, 1863(2013).
  17. Barra, F., et al. Photodynamic and Antibiotic Therapy in Combination to Fight Biofilms and Resistant Surface Bacterial Infections. Int J Mol Sci. 16 (9), 20417-20430 (2015).
  18. St Denis, T. G., et al. All you need is light: antimicrobial photoinactivation as an evolving and emerging discovery strategy against infectious disease. Virulence. 2 (6), 509-520 (2011).
  19. O'Neill, J. F., Hope, C. K., Wilson, M. Oral bacteria in multi-species biofilms can be killed by red light in the presence of toluidine blue. Lasers Surg Med. 31 (2), 86-90 (2002).
  20. Li, X., et al. Effects of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy on antibiotic-resistant staphylococcal biofilm: an in vitro study. J Surg Res. 184 (2), 1013-1021 (2013).
  21. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
  22. Elias, S., Banin, E. Multi-species biofilms: living with friendly neighbors. FEMS Microbiol Rev. 36 (5), 990-1004 (2012).
  23. Wu, J., et al. Design and Proof of Programmed 5-Aminolevulinic Acid Prodrug Nanocarriers for Targeted Photodynamic Cancer Therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 9 (17), 14596-14605 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

134 5 aminolevulinic

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved