JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، بروتوكول مكانياً وزمنياً تقييم وجود الحجمية قابلة للتطبيق في الشجاعة التجزئة باستخدام نهج تعديل الجامعة-جبل تهجين في الموقع.

Abstract

تواصل الأمراض المعدية المنقولة بواسطة ناقلات المفصلية تشكل خطرا كبيرا على صحة الإنسان في جميع أنحاء العالم. مسببات الأمراض تسبب هذه الأمراض، ولا توجد في عزلة عندما أنهم استعمار ناقلات الأمراض؛ بدلاً من ذلك، يرجح أن يخوضوا في التفاعل مع الكائنات الدقيقة المقيمة في تجويف القناة الهضمية. قد تجلى الحجمية متجه تلعب دوراً هاما في انتقال مسببات المرض للعديد من الأمراض التي تحملها ناقلات المرض. لم يتم تحديد ما إذا كانت البكتيريا المقيمة في الأمعاء الغليظة للقراد سكابولاريس إيكسوديس ، ناقل للعديد من مسببات الأمراض البشرية بما في ذلك البورليه burgdorferi، التأثير القراد انتقال مسببات الأمراض. نحن تتطلب أساليب لوصف تكوين البكتيريا المرتبطة بالقناة الهضمية التجزئة لتيسير فهم أفضل للتفاعلات فيما يحتمل في القناة الهضمية القراد. استخدام كل جبل في الموقع التهجين لتصور الجيش الملكي النيبالي النصوص المرتبطة بالأنواع البكتيرية خاصة تسمح لجمع البيانات النوعية فيما يتعلق بوفرة وتوزيع الحجمية في أنسجة سليمة. هذا الأسلوب يمكن استخدامه لدراسة التغيرات في الوسط الحجمية القناة الهضمية على مدى القراد التغذية ويمكن تطبيقها أيضا على تحليل الجينات القراد. تلوين كامل التجزئة الشجاعة العائد من المعلومات حول التوزيع المكاني الإجمالي لهدف الجيش الملكي النيبالي في الأنسجة دون الحاجة لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد وهو أقل تأثرا بالتلوث البيئي، الذي كثيرا ما يفند القائم على التسلسل الطرق استخداماً في دراسة المجتمعات الميكروبية المعقدة. وعموما، هذا الأسلوب هو أداة قيمة يمكن استخدامها لتحسين فهم التفاعلات المتجهات-الممرض-الحجمية ودورها في نقل الأمراض.

Introduction

مسببات الأمراض البشرية والحيوانية المرسلة بواسطة ناقلات المفصلية يتم العثور عليها في جميع أنحاء العالم، وتستأثر بحوالي 20 في المائة أمراض المعدية على الصعيد العالمي1، ولكنها فعالة، ولا تتوفر لقاحات آمنة ضد معظم هذه العوامل المسببة للمرض. هو توسيع فهمنا للدور الهام للكائنات المجهرية commensal والتكافلية والمسببة للأمراض، المعروفة بميكروبيومي2، في تحوير وتشكيل صحة تقريبا جميع ميتازوانس3 . من الواضح الآن أن المفصليات الناقلة لمسببات الأمراض أيضا ميناء الحجمية القناة الهضمية وأظهرت هذه الحجمية المرتبطة بمكافحة ناقلات للتأثير على مختلف مسببات الأمراض المحمولة بالنواقل4،5. وتتألف من eubacteria والعتيقات، والفيروسات والميكروبات حقيقية النواة مثل البروتوزوا والديدان الخيطية والفطريات6ميكروبيومي المفصلية. بيد الأبحاث الغالبة انصب التركيز على eubacteria يرجع، جزئيا، إلى توافر علامة الجينات وقواعد بيانات مرجعية لتحديد أعضاء بكتيرية معينة.

مع تركيز على سكابولاريس إيكسوديس، ناقلات التجزئة من مسببات الأمراض البشرية متعددة بما في ذلك، البورليه burgdorferi7المسبّب لمرض لايم، الاستفادة المثلى من تقنية التصور الميكروبية تهدف إلى تحسين فهمنا للتجزئة الحجمية القناة الهضمية في سياق التفاعلات الممرض متجه. تظل عدة أسئلة يتعين الإجابة عليها في ميدان ميكروبيومي التجزئة. القناة الهضمية هو موقع أول لقاء موسع بين القراد والممرض واردة في سياق الكائنات الممرضة المنقولة أفقياً؛ ولذلك، فهم دور ناقل القناة الهضمية الحجمية في تحوير التفاعلات الممرض ناقلات سوف تكشف عن رؤى مفيدة. القراد بطريقة فريدة من نوعها لهضم وجبة الدم، حيث تجهيز وجبة الدم مكونات يأخذ مكان إينتراسيلولارلي8. تجويف القناة الهضمية على ما يبدو بمثابة وعاء لاحتواء وجبة الدم كما يغذي القراد، والهضم المغذيات والاستيعاب تترتب على ذلك طوال عدة أيام من التغذية ومواصلة الإحلال بعد. أدخل مسببات الأمراض المكتسبة بالقراد أثناء تغذية التجويف القناة الهضمية جنبا إلى جنب مع بلودميل وبالتالي يصبح التجويف موقع أساسي للتفاعلات بين القراد، والممرضات، والحجمية المقيم. كما عائدات الهضم عن طريق الإحلال والتجزئة إيكسوديد الصوف، يخضع القناة الهضمية9من التغييرات الهيكلية والوظيفية. التكوين وتنظيم المكانية بكتيريا القناة الهضمية من المرجح أن تختلف في الحفل مع الوسط القناة الهضمية المتغيرة أيضا. ولذلك، من المهم فهم بنية البكتيريا المقيمة في الأمعاء القراد تماما فهم التفاعل بين التجزئة والممرض والحجمية القناة الهضمية.

التقنيات الجزيئية لوصف الحجمية المرتبطة بالمضيف بشكل روتيني استخدام تسلسل المتوازي الفائق استراتيجيات10 إلى تضخيم وتسلسل الحمض النووي ريبوسومال 16S البكتيرية (المتاشب). هذه الاستراتيجيات تسلسل التحايل على الحاجة إلى الحصول على الثقافات أكسينيك من بكتيريا محددة، وتوفير وصف متعمق لجميع أعضاء البكتيرية الممثلة في العينة. ومع ذلك فهي خلطت بين هذه الاستراتيجيات بعدم القدرة على التمييز بين التلوث البيئي من المقيمين في حسن النية . علاوة على ذلك، عند تقييم العينات، مثل القراد، أن صغيرة في حجمها ومن ثم تحتوي على الحمض النووي الخاصة الحجمية منخفضة الغلة، احتمالات تضخيم ملوثات البيئية هو زيادة11 والنتائج في تفسير غامض تكوين ميكروبيومي. ولذلك توصيف وظيفي بالاقتران مع تصور البكتيريا قادرة على البقاء محددة سيكون حاسما لتحديد وتمييز ميكروبيومي القراد زمنياً ومكانيا. نحو تحقيق هذا الهدف، ونحن استغل من الحمض النووي الريبي التهجين الجامع-جبل في الموقع . هذه التقنية تستخدم بشكل روتيني لتقييم أنماط التعبير الجيني في الأجهزة والأجنة12،،من1314 ويسمح تحليل مسوحات للتعبير على نموذج كامل للفائدة. وهذا يختلف عن التقليدي في الموقع تقنيات التهجين التي تستخدم أقسام الأنسجة وغالباً ما تتطلب تحليل مستفيض للمواد مقطعة مع الجمعية حسابية للتنبؤ بالتعبير في كامل أجهزة15. بينما يشن كل يشير عموما إلى كل الكائنات الحية12، هنا كل-جبل يشير إلى الشجاعة كله أو الأجهزة. مزايا استخدام الحمض النووي الريبي الجامع-جبل في الموقع التهجين نهج لتقييم هيكل التجزئة الحجمية القناة الهضمية المتعددة الوجوه. تتألف القناة الهضمية التجزئة 7 أزواج من رتوج، كل زوج متفاوتة في حجم16. الاختلافات الوظيفية، إذا وجدت، بين هذه رتوج، غير مفهومة في سياق التجزئة البيولوجيا، ضع علامة أمام تفاعلات الحجمية أو الممرض القراد. سوف يزيح التلاعب من القناة الهضمية التي تمزق رتوج الأمعاء الحجمية موجودة في تجويف القناة الهضمية أو تلك المرتبطة فضفاضة بالقناة الهضمية والنتيجة في التفسير الخاطئ لتوطين الحجمية المكانية. وقد استخدمت الأسفار المسماة الجيش الملكي النيبالي في الموقع التهجين في وقت سابق لدراسة القراد القناة الهضمية المستنسخات17 من خلال تحديد وفتح رتوج الأمعاء الفردية لضمان التحقيق التهجين وتعريب burgdorferi (ب) النصوص بتقطيع القراد كلها جزءا لا يتجزأ من البارافين18. تتطلب كلا من هذين النهجين التلاعب في الأنسجة التجزئة قبل التهجين التي تؤثر على بنية الحجمية القناة الهضمية.

في هذا التقرير، يصف لنا بالتفصيل على دراسة الحجمية القناة الهضمية القراد قابلة للتطبيق الجامع-جبل في الموقع التهجين (وميش) باستخدام البروتوكول. استخدام الحمض النووي الريبي الجامع-جبل في الموقع التهجين يمكن فهم عالمي لوجود ووفرة من بكتيريا القناة الهضمية محددة في مناطق مختلفة من القناة الهضمية وقد حفز رؤى جديدة في الأحياء القناة الهضمية القراد في سياق الاستعمار الممرض وانتقال العدوى. علاوة على ذلك، يتيح استخدام الحمض النووي الريبي المجسات الموجهة ضد الجيش الملكي النيبالي بكتيرية معينة الكشف عن البكتيريا قادرة على البقاء في القناة الهضمية القراد.

Protocol

1-إعداد قوالب الحمض النووي

  1. تحميل تسلسل الرنا الريباسي 16S محددة لكل أجناس البكتيرية من نكبي قاعدة البيانات وتصميم البلمرة المتسلسل (PCR) متوافقة إلى الأمام وعكس الإشعال التي سيتم تضخيم المناطق جنسا على حدة (~ 200-250 زوج قاعدي طويل) كما هو موضح سابقا 19-تشير أيضا إلى المصدر المفتوح قواعد البيانات سيلفا20،21 بروبيباسي22 على الإنترنت الموارد والمسابير استهدفت الرنا الريباسي اليغنوكليوتيد والإشعال، كما قد تكون تحقيقات الجيش الملكي النيبالي لبعض أجناس بكتيرية تجارياً المتاحة.
    ملاحظة: من المهم تحديد مناطق الجينات التي أجناس محددة إلى محددة وضمان أن كبسولة تفجير تصميم عدم تضخيم أجناس البكتيريا ذات الصلة. وهذا أمر حاسم للحصول على التحقيقات الخاصة بالجينات/جنسا التهجين.
  2. تغذية القراد لتشريح الشجاعة القراد ح 24 أو 48 أو 72 في الفئران، وإعداد الجيش الملكي النيبالي وكدنا من الشجاعة التجزئة ك سابقة وصف23. تضخيم كدنا استخدام كقالب لبكر أمبليكونس جنسا على حدة باستخدام ثيرموسيكلير. تشغيل قاسمة PCR-المنتج/أمبليكون على 1.5% [اغروس] هلام وتأكيد أن amplicon يتوافق مع الحجم المتوقع حسب التصور تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) باستخدام هلام نظام التصوير.
  3. استنساخ amplicon الرنا الريباسي الجرثومي 16S الاهتمام إلى ناقل تا متاحة تجارياً (جدول المواد) التي تحتوي على الحمض النووي الريبي بوليميراز المروجين مناسبة بولمرس عاثية (SP6 أو T7 T3). التسلسل المستنسخين للتأكد من هوية أمبليكون واتجاهية لاستنساخ فيما يتعلق بكل من المروجين. وبناء على ذلك، تحديد يسبر المروج لاختيار لتوليد معنى أو العقاقير الحمض النووي الريبي (الشكل 1).
  4. لينيريزي 1 ملغ بلازميد مع إنزيم التقييد ملائمة في حجم رد فعل µLfor يصل إلى 30 ح 2 في درجات الحرارة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة. اختر إنزيمات التقييد استناداً إلى المروج التي سوف تستخدم لتوليد معنى أو العقاقير التحقيق (الشكل 1). تحقق من استخطاط بالتصور 2 ميليلتر من خلاصة الرد على 1% [اغروس] هلام.
  5. تنقية ميليلتر 28 المتبقية من هضم الحمض النووي استخدام مجموعة تنقية عمود منتجات PCR متاحة تجارياً وقياس تركيز الحمض النووي بجهاز المطياف الضوئي.
    ملاحظة: قد يسبب بعض المسابير الإحساس بتلوين الخلفية أعلى بكثير من المسبار العقاقير المقابلة وخيارات أخرى قد تحتاج إلى استكشاف. وتشمل الضوابط السلبية البديلة والبلازميدات ترميز تسلسلات غير الممثلة في العينة أو مسبار آخر أن ينتج نمط مميز من التهجين.

2-تشييد لتحقيقات الجيش الملكي النيبالي ديجوكسيجينين-UTP

  1. إعداد مزيج النوكليوتيدات عن طريق الجمع بين 7.5 ميليلتر من 100 ملم UTP، 25 ميليلتر من 10 مم ديجوكسيجينين-UTP، وميليلتر 10 من كل 100 ملم ATP، وأنشئ والأداء النظري المركب في أنبوب الطرد مركزي 1.5 مل.
  2. إجراء النسخ في المختبر باستخدام مجموعات بوليميريز T7 أو الحمض النووي الريبي Sp6 المتاحة تجارياً، باستخدام 1 ميليلتر من مزيج النوكليوتيدات (2.1 خطوة) و 0.25-1 ميكروغرام من قالب الحمض النووي. إحضار حجم ما يصل إلى 20 ميليلتر بالماء. نفض الغبار على أنبوب للجمع ونبض تدور. احتضان في 37 درجة مئوية ح 2.5-3.
    ملاحظة: البناء المسبار قد نجحت مع بلازميد هضمها تركيزات منخفضة تصل إلى 7 نانوغرام/ميليلتر، لكن تركيزات نموذجية في هذا النطاق خطوة من 15-25 نانوغرام/ميليلتر. أيضا قد يكون المحتضنة رد فعل النسخ بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، ولكن هذا لا يزيد إلى حد كبير العائد الجيش الملكي النيبالي.
  3. أضف 1 ميليلتر من الدناز (وحدات 2,000/ميليلتر) واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. لا تتجاوز 10 دقائق، أو قد تبدأ الإنزيم اللاإنسانية الحمض النووي الريبي.
  4. إضافة 30 ميليلتر من المثلج كلوريد الليثيوم 7.5-8 متر و 30 ميليلتر لتبريد المياه خالية من نوكلاس يعجل بالجيش الملكي النيبالي. نفض الغبار على أنبوب للمزيج. السماح لهطول الأمطار من الحمض النووي الريبي المضي قدما، بين عشية وضحاها في-20 درجة مئوية.
  5. تجميع الجيش الملكي النيبالي بالطرد المركزي في 17,000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. أغسل بيليه مرة واحدة مع 1 مل إيثانول 75% الطازجة في الماء بيروكاربوناتي (ديبك) إثيل، ثم كرر الطرد المركزي.
  6. إزالة وتجاهل المادة طافية وعكس الأنبوب على منشفة ورقية نظيفة، والسماح لتجف للحد الأدنى 10 ريسوسبيند بيليه في المياه خالية من نوكلاس. إذا كان بيليه مرئياً بسهولة، ريسوسبيند في 25 ميليلتر. إذا كان بيليه ريسوسبيند صغيرة جداً أو غير مرئية، في 15-20 ميليلتر. الحصول على تقدير لتركيز الحمض النووي الريبي بجهاز المطياف الضوئي.
    ملاحظة: رنا نموذجي تركيزات تتراوح بين 200-500 نانوغرام/ميليلتر.

3-التصور من الحمض النووي الريبي يسبر بالتفريد جل فورمالدهايد الحمض النووي الريبي لتقييم نقاء الحمض النووي الريبي

تنبيه: فورمالدهايد يشكل مخاطر استنشاق؛ ولذلك، تولد الحلول المطلوبة لتحليل الحمض النووي الريبي جل في غطاء دخان. اثيديوم بروميد مادة مسرطنة المشتبه فيها؛ التعامل مع الرعاية.

  1. إعداد فورمالدهايد 1% [اغروس] هلام كما تم وصفه سابقا24 ويلقي الهلام في مربع هلام خالية من رناسيس. مجرد بارد، ملء مربع هلام مع 1 × تشغيل المخزن المؤقت (1 x الممسحات، على درجة الحموضة 7.0، فورمالدهايد 5%).
  2. إعداد "المخزن المؤقت" الذي عينة (5 ميليلتر 400 مغ/مل اثيديوم بروميد، 20 ميليلتر 10 × 35 ميليلتر فورمالدهايد، والمماسح و 100 ميليلتر ميثلامين). الجمع بين 2 ميليلتر من مسبار الحمض النووي الريبي (الخطوة 2.6) مع 8 ميكروليتر من "عينة المخزن المؤقت". تبني على 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  3. إعداد "الجيش الملكي النيبالي تحميل المخزن المؤقت" عن طريق الجمع بين والغليسيرول 50% 5 مل، 1 مل 10% فورمالدهايد، 40 مغ بروموفينول الأزرق، 40 مغ زيلين نفط زايلين و 20 ميليلتر يدتا 0.5 M (درجة الحموضة 7.5). بعد استخدام وتخزين هذا المخزن المؤقت في-20 درجة مئوية.
  4. إضافة 3 ميليلتر من "تحميل المخزن المؤقت" إلى عينة الحمض النووي الريبي من 3.2 خطوة ومزيج. تبقى أنابيب العينة على الجليد.
  5. تحميل حجم عينة كاملة من 3.4 خطوة إلى الهلام. تحميل قاسمة سلم الحمض النووي الريبي المفرد-الذين تقطعت بهم السبل إلى جانب للتحقق من حجم الجيش الملكي النيبالي. تشغيل الهلام في 100 V أو أقل حتى الصبغة الزرقاء وترحيل حوالي 75 ٪ الطريق إلى أسفل الجل. تصور الجيش الملكي النيبالي تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية باستخدام نظام تصوير هلام.
    ملاحظة: يجب أن يظهر تحقيق رنا ذات نوعية جيدة كعصابة منفصلة مع تنقل المقابل للحجم المتوقع للتحقيق (الشكل 2، لين 1). إذا كان التحقيق يظهر أنه منتشر وملطخ عصابة (الشكل 2، لين 2) وهذا لا ينبغي أن تستخدم.

4-وضع علامة جمع القناة الهضمية والتثبيت

  1. جمع الحوريات سكابولاريس إيكسوديس التي قد تتغذى على الفئران للوقت نقاط الاهتمام.
    ملاحظة: لأغراض هذا الأسلوب، القراد تغذية لعمل ح 48 أو 72 أفضل.
  2. تشريح القناة الهضمية من القراد في ميمفا (الجدول 1) على شريحة زجاجية تحت مجهر تشريح، تجنب الضرر للجهاز إلى أقصى حد ممكن. ضع علامة على شريحة مجهر نظيفة في 20-30 ميليلتر من ميمفا. استخدام زوج من شريحة عقيمة عالية من الكربون الصلب موس #11 منطقة الرأس في الترس القراد ترك الجسم القراد. اضغط برفق الجسم لدفع رتوج القناة الهضمية والغدد اللعابية ببشرة الجسم. فصل الغدد اللعابية والقناة الهضمية وحلج القطن الشجاعة على شفرة حلاقة.
  3. جمع الشجاعة في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 500 ميليلتر ميمفا. احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف ح 1 أو بين ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: الغدد اللعابية التجزئة قد أيضا يكون تشريح والمثل الثابتة والملون.
  4. يذوي الأنسجة بالغسيل 3 مرات بلطف مع 1 مل المثلج الإيثانول 100%. واسمحوا الشجاعة بالوعة بطبيعة الحال إلى الجزء السفلي من الأنبوب بين كل غسل، الطرد المركزي قد تلحق الضرر الأنسجة. للتخزين على المدى الطويل، تبقى العينات في الإيثانول 100% عند-20 درجة مئوية.

5. بناء شبكة عينة سلال وحامل سلة 24-جيدا

  1. قطع أنابيب الطرد المركزي الإضافية-أعلى باستخدام شفرة حلاقة واحد ذو حدين ساخنة على مشرط قيعان الخروج من 2 مل أو 5 مل.
    تنبيه: قد تحتاج الشفرة تكون تسخين عدة مرات قبل اكتمال القص.
  2. قطع المربعات من النايلون 110 ميكرون أكبر قليلاً من افتتاح أنبوب جديد. السندات في mesh إلى الجزء السفلي من الأنبوب بالضغط عليهما معا طفيفة على لوحة الساخن على حرارة منخفضة ومتوسطة حتى يتم اعتماد ختم جيدة. السماح لتبرد وضمان وجود أي ثغرات بين الشبكة والانبوب وتقليم مش الزائدة حول الحواف.
  3. قطع ثقوب في غطاء لوحة 24-جيدا أن هذه الشفة سلة عينة في "الخطوة 5، 2" سوف تجلس في الحفرة ولا تقع من خلال، مما أسفر عن مجموعة حيث سيجلس القيعان من سلال عينة كل وسيلة في الآبار عندما يوضعون في ثقوب في الغطاء.
  4. استخدام هذا حامل سلة المجهزة لنقل سلال من لوح واحد إلى آخر بسهولة نسبية للبروتوكول التهجين في الموقع بأكملها. استخدام اثنين 24-جيدا لوحات بحيث أثناء حدوث حضانة واحدة، لوحة أخرى مستعدة ليغسل المقبلة.

6-التهجين في الموقع : يوم 1 (توقيت: ح 4-5)

  1. نقل الشجاعة للمسمى سلال عينة، مفصولة بشرط التجريبية ويقصد بها مسبار الحمض النووي الريبي.
    ملاحظة: وصمة عار الشجاعة على الأقل 5 كل شرط لحساب التباين الطبيعي بين replicates.
  2. ترطيب العينات برفق لتجنب إدخال فقاعات الهواء في الأنسجة تدريجيا زيادة نسبة الفوسفات مخزنة المالحة مع الفاعل غير الأيونية 0.1% (محطة؛ الجدول 1) إلى الإيثانول في يغسل.
    ملاحظة: إكمال يغسل جميع في حامل سلة 24-جيدا في درجة الحرارة المحيطة بالانفعالات لطيف إلا إذا ذكر خلاف ذلك. الكوة 500-600 ميليلتر لحلول المياه والصرف الصحي في كل بئر من صاحب هذه الشجاعة في كل سلة مغمورة تماما. إعداد جميع الحلول مع المياه المعالجة ديبك لمنع تدهور الجيش الملكي النيبالي.
    1. تغسل العينات لمدة 5 دقائق في 500 ميليلتر 100 ٪ الإيثانول.
    2. إعداد على الأقل 500 ميليلتر كل سلة عينة من 75%، 50%، و 25 ٪ إيثانول في محطة. ترطيب العينات قبل الغسيل لمدة 5 دقائق في كل حل الإيثانول، تتحرك من أعلى تركيز الإيثانول إلى أدنى مستوى.
    3. تغسل العينات 4 مرات لمدة 5 دقائق في محطة.
  3. بيرميبيليزي العينات مع "ك البروتيناز" (10 ميكروغرام/مل) في محطة لمدة 5 دقائق.
  4. إعداد الأنسجة التهجين مع تحقيقات الجيش الملكي النيبالي.
    1. تغسل العينات مرتين كما هو موضح في 6.2 في حامل سلة 24-جيدا في درجة الحرارة المحيطة بالانفعالات لطيف لمدة كل 5 دقائق في 500 ميليلتر ثلاثي إيثانول أمين المخزن المؤقت (0.1 M، درجة الحموضة 7.0-8.0) (الجدول 1) المحافظة على العينات في بيئة خالية من أمين.
    2. معالجة العينات مرتين مع 500 ميليلتر 0.25% أنهيدريد الخل في ثلاثي إيثانول أمين المخزن المؤقت (0.1 م، درجة الحموضة 7.0-8.0) لمدة 5 دقائق، ثم تغسل العينات مرتين في محطة لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: أنهيدريد الخل أسيتيلاتيس الأمينات مجاناً لتحييد تهمة إيجابية، هو أمر حيوي لمنع التفاعلات الالكتروستاتيكي غير محددة وضمان ملزمة محددة للتحقيق معه مرناً.
    3. إصلاح الشجاعة لمدة 20 دقيقة مع 500 ميليلتر 4% بارافورمالدهيد في محطة، ثم يغسل 5 مرات في محطة لمدة 5 دقائق.
    4. بريهيبريديزي بحضانة العينات في 500 ميليلتر التهجين/in المخزن المؤقت مع الانفعالات لطيف في حمام مائي تهز حامل سلة 24-جيدا في 24 لوحة جيدا (الجدول 1) ح 1.5-2.5 عند 60 درجة مئوية. حفظ التهجين المخزن المؤقت المستخدم للخطوة بريهيبريديزيشن لإعادة استخدامها في البروتوكول 2 يوم (الخطوة 7، 1).
    5. إعداد الحلول التهجين مسبار بإضعاف تحقيقات الجيش الملكي النيبالي في المخزن المؤقت التهجين إلى تركيز نهائي 1 ميكروغرام/مل.  احتضان عينات مع حلول التهجين المسبار في حامل سلة 24-جيدا عند 60 درجة مئوية مع الانفعالات لطيف بين عشية وضحاها في حمام مائي تهز (الجدول 2). تغطية لوحة تحمل شكل مريح مع رقائق الألومنيوم حامل سلة لمنع تبخر المحلول التهجين.

7-التهجين في الموقع : يوم 2 (توقيت: ح 4.5 5.5)

  1. إزالة العينات من الحلول التهجين المسبار ووضعها في المخزن المؤقت محجوز التهجين عن اليوم السابق. احتضان عند 60 درجة مئوية مع الانفعالات لطيف لمدة 3 دقائق.
    ملاحظة: التحقيق التهجين الحلول قد تكون مخزنة في-20 درجة مئوية لإعادة الاستخدام تصل إلى 3 مرات.
  2. إعداد 2 × سترات الصوديوم المالحة المخزن المؤقت (SSC) بتمييع 20 x SSC في المياه المعالجة ديبك (الجدول 1). تغسل العينات مرتين لمدة 3 دقيقة مع 2 × التعاون بين بلدان الجنوب، ثم 3 مرات لمدة 20 دقيقة مع 2 x SSC عند 60 درجة مئوية لإزالة جميع آثار المخزن المسبار والتهجين.
  3. تعامل مع رناسي (20 ميكروغرام/مل) و T رناسي1 (10 ميكروغرام/مل) في 2 x SSC لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية لإزالة واحد الذين تقطعت بهم السبل مسبار الحمض النووي الريبي تمثل مجاناً غير-تهجين الحمض النووي الريبي.
  4. أغسل مرة واحدة مع 2 x SSC لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تعد 0.2 x SSC بتمييع 2 x SSC في المياه المعالجة ديبك، ثم يغسل مرتين مع 0.2 x SSC لمدة 30 دقيقة عند 60 درجة مئوية لإزالة رنسيس الزائدة.
  5. تغسل مرتين مع 500 ميليلتر من حمض الماليك المخزن المؤقت (ماب؛ الجدول 1) لكل 10 دقائق.
  6. احتضان العينات بعرقلة الحل (كاشف حظر 2% في ماب) 1.5-2 ح.
    ملاحظة: الكاشف حظر يمكن أن يكون من الصعب على حل؛ تدفئة لطيف متلازمة انحلال.
  7. يستعاض عن عرقلة الحل بمكافحة ديجوكسيجينين القلوية الفوسفاتيز مترافق 500 ميليلتر من جسم في إضعاف 1:3,000 في عرقلة الحل واحتضان في درجة حرارة الغرفة لحوالي 4 ح أو عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

8-التهجين في الموقع : 3 يوم (التوقيت: 6 (ح) بين عشية وضحاها)

  1. تغسل العينات 5 مرات على الأقل عن 30 دقيقة مع 500 ميليلتر ماب لإزالة الأجسام المضادة الزائدة.
    ملاحظة: يغسل هذه تتسم بالمرونة ويمكن أن تمتد إلى ح 1-2، أو يمكن الاستعاضة عن واحد يغسل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع أقل تأثير على فعالية يغسل 3-4.
  2. تغسل مرتين لمدة 5 دقائق مع المخزن المؤقت الفوسفاتيز القلوية، pH 9.5 (AP المخزن المؤقت؛ الجدول 1).
  3. يبدأ رد الفعل اللون بالاستعاضة عن الغسيل الأخير مع 500 ميليلتر من الركازة اللونية الفوسفاتيز القلوية (جدول المواد). تغطية لوحة عينة مع رقائق الألومنيوم وترك تلطيخ المضي قدما في درجة حرارة الغرفة ل 3-5 ح أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. مراقبة رد فعل المصبوغة دورياً عن طريق عرض الأنسجة تحت مجهر تشريح لتجنب أوفيرستينينج.
    ملاحظة: عند اكتمال تلطيخ اللون أرجواني خفيف يمكن كشفها بالعين المجردة في عينات سبر antisense تحت المجهر، ولكن الأنسجة لا ينبغي أن تصبح داكنة جداً. تلوين تمضي ببطء شديد عند 4 درجة مئوية، وقد يستغرق ما يصل إلى 20-24 س.
  4. وقف رد الفعل اللون قبل الغسيل لمدة 5 دقائق في 500 ميليلتر ماب، ثم إصلاح الأنسجة بين عشية وضحاها في الحل بوين.
    تنبيه: تعامل مع الحل بوين في غطاء دخان؛ أنها مادة مسرطنة أكالة.

9-التهجين في الموقع : يوم 4 (توقيت: ح 3-3.5)

  1. إعداد على الأقل 7 مل كل سلة عينة من 1 x SSC 20 تمييع x SSC في المياه المعالجة ديبك. إزالة الحل بوين غسل العينات 4 إلى 6 مرات مع الإيثانول 70% في 1 x SSC حتى لم يعد النسيج الأصفر.
  2. إعداد 500 ميليلتر كل عينة سلة حلول الإيثانول 75%، 50%، و 25% في 1 x SSC. تغسل العينات لمدة 5 دقائق في كل حل، ينتقلون من تركيز الإيثانول أعلى إلى أدنى ترطيب الأنسجة. تغسل مرتين لمدة 5 دقائق كل 1 في x SSC.
  3. احتضان هذه العينات في محلول التبييض (الجدول 1) لمدة 90 دقيقة في الضوء في غطاء دخان.
    ملاحظة: هذه الخطوة يسمح أي تصبغ في عينات أو التلون من حل بوينس المراد إزالتها ويعزز إشارة مسبار لرؤية واضحة.
  4. تغسل العينات مرتين مع 500 ميليلتر من 1 x SSC لمدة 5 دقائق.
  5. نقل الشجاعة مع الحد الأدنى من الضرر بعكس سلة عينة في بئر صفيحة 24-بئر جديدة وتغسل مع الإيثانول 70% من خلال شبكة أسفل استخدام ماصة نقل. تخزين في-20 درجة مئوية إذا لزم الأمر.
  6. للحصول على لمحة عامة عن أنماط المصبوغة من عينات متعددة، كما هو موضح في الشكل 3، الحفاظ على الشجاعة في الإيثانول 70% في 24 لوحة جيدا وعرض مع أي مجهر الحقل مشرق. دراسة الشجاعة الفردية تحت مجهر مشرق الحقل كما هو موضح في الشكل 4، 5 الشكل، و الشكل 6، جبل الشجاعة في والغليسيرول 100 ٪ تحت كوفيرسليبس. استخدام ملعقة بلاستيكية للتلاعب بلطف بالانسجة مع الحد الأدنى من الضرر.
    ملاحظة: لزوجة عالية الجلسرين يساعد على حماية الأنسجة من التلف بالضغط ويسمح الموضع الدقيق من رتوج مثل الأنسجة يمكن أن ينظر على النحو الأمثل في تكبير أعلى.
  7. التقاط الصور في المجهر استخدام مجهر برنامج التقاط الصور محددة (جدول المواد) والتصدير كصور Tiff إلى صورة عامة برامج تحرير. لقياس الاختلافات المصبوغة النسبي بين علاجات تجريبية، تنزيل برامج تحليل صورة عامة (الجدول للمواد). فتح الصورة داخل برنامج تحليل واستخدام التعليمات داخل البرنامج لقياس كثافة بكسل لتلطيخ وحساب الرسم البياني مؤامرات لتلطيخ.

النتائج

قياس وتقدير نوعية المسابير الحمض النووي الريبي الحاسمة قبل بداية تلطيخ. في المختبر كفاءة النسخ عالية يعتمد على كمية ونوعية من قالب الحمض النووي. ونحن بشكل روتيني تصور تحقيقات الجيش الملكي النيبالي على جل فورمالدهايد التحقق من النقاء وكمية من مسبار المتولدة عن ردود ...

Discussion

وهذا هو أول استخدام لتقنية التهجين (وميش) كل جبل في الموقع لدراسة الحجمية لمتجه المفصلية من مسببات الأمراض. وكان لدينا بروتوكول مقتبس من واحد يستخدم لدراسة التنمية في المورفولوجية والضفدع الأجنة25،26. كل يشن الجيش الملكي النيبالي في الموقع الت...

Disclosures

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

Acknowledgements

ونشكر الدكتور مصطفى الخوخة مع، جامعة ييل، مخلصا لتوفير استخدام الموارد المختبر له. ونحن ممتنون للسيد وو جي مينغ للمساعدة التقنية الممتازة. EF محقق HHMI. وأيد هذا العمل هدية من جون مونسكي وجينيفر ويس مونسكي صندوق أبحاث مرض لايم.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micronAmazon03-110/47
pGEM-T Easy Vector SystemPromegaA1360
Digoxygenin-11-UTPRoche1209256910
dNTPNew England Biolabs N0447S
DNAse I(RNAse-free)New England BiolabsM0303S
HiScribe SP6 RNA synthesis kitNew England BiolabsE2070S
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNew England BiolabsE2040S
Water, RNase-free, DEPC-treatedAmerican BioanalyticalAB02128-00500
EDTA, 0.5M, pH 8.0American BioanalyticalAB00502-01000
Formaldehyde, 37%JT Baker2106-01
FormamideAmerican BioanalyticalAB00600-00500
EGTASigma AldrichE-4378
DPBS, 10XGibco14300-075
Tween-20Sigma AldrichP1379-25ML
Proteinase KSigma Aldrich3115879001
Triethanolamine HClSigma AldrichT1502-100G
Acetic anhydrideSigma Aldrich320102-100ML
ParaformaldehydeThermoScientific/Pierce28906
SSC, 20XAmerican BioanalyticalAB13156-01000
RNA from torula yeastSigma AldrichR3629-5G
Heparin, sodium saltSigma AldrichH3393-10KU
Denhardt's Solution, 50XSigma AldrichD2532-5ML
CHAPS hydrateSigma AldrichC3023-1G
RNase ASigma Aldrich10109142001
RNase T1ThermoScientific EN0541
Maleic acidSigma AldrichM0375-100G
Blocking reagentSigma Aldrich11096176001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragmentsSigma Aldrich11093274910
Levamisol hydrochlorideSigma Aldrich31742-250MG
Chromogenic substrate for alkaline phosphataseSigma Aldrich11442074001
Bouin's solutionSigma AldrichHT10132-1L
Hydrogen peroxideMallinkrodt Baker, Inc2186-01
Single stranded RNA ladderAmbion -MilleniumAM7151
 #11 High-Carbon steel blades C and A Scientific Premiere#11-9411
ThermocyclerBioRad, CA1851148
SpectrophotometerThermoScientific NanoDrop 2000C
Orbital shakerVWRDS-500E Digital Orbital shaker
Shaking water bathBELLCO Glass, IncHot Shaker-7746-12110
Gel  documentation systemBioRadGel Doc XR+ Gel documentation system
Bright-field Microscope NikonNikonSM2745T
Bright-field Microscope ZeissAXIO Scope.A1
Dissection microscope ZeissSTEMI 2000-C
 Light boxVWR102097-658
PCR purification kit Qiagen28104
Image capture softwareZeissZen lite
Image editing software Adobe Adobe Photoshop CS4 version 11.0
Image analysis softwareNational Institutes of HealthImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/
Automation compatible instrumentationIntavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). Intavis, Biolane HT1.16v

References

  1. Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107 (2015).
  2. Hooper, L. V., Gordon, J. I. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).
  3. Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).
  4. Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: the force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
  5. Weiss, B., Aksoy, S. Microbiome influences on insect host vector competence. Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).
  6. Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. The functional microbiome of arthropods. PLoS One. 12 (5), e0176573 (2017).
  7. Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
  8. Sojka, D., et al. New insights into the machinery of blood digestion by ticks. Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).
  9. Grigor'eva, L. A. Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle. Entomological Review. 90, 405-409 (2010).
  10. Goodrich, J. K., et al. Conducting a microbiome study. Cell. 158 (2), 250-262 (2014).
  11. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
  12. Hemmati-Brivanlou, A., et al. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110 (2), 325-330 (1990).
  13. Frank, D., Harland, R. M. Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae. Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).
  14. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).
  15. Kernohan, K. D., Berube, N. G. Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections. MethodsX. 1, 30-35 (2014).
  16. Sonenshine, D. E. . Biology of ticks. , (1991).
  17. Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete. Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
  18. Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies. Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).
  19. Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).
  20. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  21. Yilmaz, P., et al. The SILVA and "All-species Living Tree Project (LTP)" taxonomic frameworks. Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).
  22. Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).
  23. Narasimhan, S., et al. Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization. Nature Communication. 8 (1), 184 (2017).
  24. Bryant, S., Manning, D. L. Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA. Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).
  25. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
  26. Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis. BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).
  27. Khokha, M. K., et al. Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development. Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).
  28. Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).
  29. Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations. Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).
  30. Pai, V. P., et al. HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner. Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).
  31. Legendre, F., et al. Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos. JoVE. (71), e50057 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved