JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لدراسة التفاعلات الحمض النووي-البروتين بالتأمل الداخلي الإجمالي fluorescence مجهرية (تيرفم) استخدام ركيزة λ سيتيسبيسيفيكالي تعديل الحمض النووي وكم-نقطة المسمى البروتين.

Abstract

مجهرية fluorescence إسهامات عظيمة في تشريح آليات معقدة من العمليات البيولوجية على مستوى جزيء واحد. في فحوصات جزيء واحد لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي من البروتين، وهناك اثنين من العوامل الهامة للنظر فيها: الركيزة الحمض النووي بما يكفي لطول السهل والمراقبة ووضع العلامات بروتين مع تحقيق فلورسنت مناسب. 48.5 kb λ الحمض النووي مرشح جيد للركيزة الحمض النووي. نقاط الكم (قدوتس)، كفئة من المسابر الفلورسنت، السماح للمراقبة منذ فترة طويلة (دقائق إلى ساعات)، والحصول على صورة عالية الجودة. في هذه الورقة، نقدم بروتوكولا لدراسة تفاعلات البروتين الحمض النووي على مستوى جزيء واحد، الذي يشمل إعداد λ سيتيسبيسيفيكالي تعديل الحمض النووي ووصفها بروتين المستهدف مع المغلفة ستريبتافيدين قدوتس. لدليل على المفهوم، نختار شركة مصفاة نفط عمان (التعرف على منشأ المعقدة) في مهدها الخميرة وتين فائدة وتصور تفاعله مع أرس (تسلسل تكرار صورة مستقلة) باستخدام تيرفم. مقارنة مع أخرى تحقيقات الفلورسنت، قدوتس بمزايا واضحة في دراسات جزيء واحد نظراً لاستقرارها عالية ضد فوتوبليتشينج، ولكن تجدر الإشارة إلى أن هذه الخاصية تحد من تطبيقها في الاختبارات الكمية.

Introduction

التفاعلات بين البروتينات والحمض النووي تعتبر أساسية للعديد من العمليات البيولوجية المعقدة، مثل تكرار الحمض النووي، وإصلاح الحمض النووي، والنسخ. على الرغم من أن النهج التقليدية قد يلقي الضوء على خصائص هذه العمليات، العديد من الآليات الرئيسية لا تزال غير واضحة. ، مع تقنيات جزيء واحد سريع النمو، بعض الآليات في الآونة الأخيرة تناول1،،من23.

تطبيق الفحص المجهري fluorescence جزيء واحد على تصور تفاعلات البروتين-الحمض النووي في الوقت الحقيقي أساسا يعتمد على وضع الكشف عن الأسفار والمسابير الفلورسنت. لدراسة جزيء واحد، من المهم أن تسمية بروتين الاهتمام مع تحقيق فلورسنت مناسب نظراً لأنظمة الكشف عن الأسفار في معظمها متاح تجارياً.

ويشيع استخدام البروتينات الفلورية في البيولوجيا الجزيئية. ومع ذلك، منخفضة الإضاءة الفلورية والاستقرار ضد فوتوبليتشينج تقييد تطبيقها في العديد من فحوصات جزيء واحد. النقاط الكم (قدوتس) إشارات صغيرة جسيمات نانوية4. نظراً لخصائصها الضوئية الفريدة، قدوتس 10-20 مرات أكثر إشراقا والأصباغ عدة آلاف المرات أكثر استقرارا من المستخدمة على نطاق واسع العضوية5. وعلاوة على ذلك، قد قدوتس كبير ستوكس تحول (الفرق بين موقف قمم الإثارة والانبعاثات)5. وهكذا، يمكن استخدام قدوتس للمراقبة منذ فترة طويلة (دقائق إلى ساعات)، والحصول على صور ذات المعدلات العالية من الإشارات إلى الضجيج، في حين أنهم لا يمكن أن تستخدم في الاختبارات الكمية.

وحتى الآن، هناك طريقتان لتسمية بروتين المستهدف مع قدوتس سيتيسبيسيفيكالي: وسم مع المعونة من قدوت مترافق الابتدائي أو الثانوي الأجسام المضادة6،،من78؛ أو وضع العلامات المستهدفة البروتين مع قدوتس مباشرة، التي ترتكز على تفاعل قوي بين البيوتين وستريبتافيدين9،،من1011،،من1213. قدوتس Streptavidin المغلفة متوفرة تجارياً. في دراستنا الأخيرة، سيتيسبيسيفيكالي كانت تنقية البروتينات بيوتينيلاتيد في مهدها الخميرة بكفاءة عالية من co-overexpression من البيرا ومعلم أفي البروتينات في فيفو10. بالتالي والاستفادة المثلى من فحوصات جزيء واحد14،15،،من1617، لاحظنا التفاعلات بين البروتينات المسماة قدوت والحمض النووي في استخدام جزيء واحد مستوى تيرفم10.

هنا، علينا أن نختار في مهدها الخميرة أصل الاعتراف المعقدة (شركة مصفاة نفط عمان)، التي يمكن التعرف على وجه التحديد والربط بتسلسل صورة مستقلة النسخ المتماثل (جمعية الإغاثة اﻷرمنية)، كما لدينا بروتين الفائدة. ويقدم البروتوكول التالي إجراء خطوة بخطوة لتصور التفاعل بين شركة مصفاة نفط عمان المسمى قدوت مع جمعية الإغاثة اﻷرمنية باستخدام تيرفم. ويرد وصف إعداد الركيزة الحمض النووي تم التعديل سيتيسبيسيفيكالي، بيوتينيليشن الحمض النووي، وتنظيف ساترة والروغان، الجمعية تدفق الخلية، وتصوير جزيء واحد.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1-إعداد الركازة الحمض النووي λ-ARS317

  1. بناء الركيزة الحمض النووي والتعبئة والتغليف
    1. هضم الحمض النووي λ الأصلية باستخدام زهوأنا الإنزيم؛ تضخيم الحمض النووي bp 543 تأثير جزء ARS317 من الحمض النووي الجينومي للناشئين الخميرة التي تحتوي على 20 كبسولة تفجير باستخدام bp مثلى تسلسل من المنبع والمصب من زهوأنا الموقع الإنزيم على الحمض النووي لامدا. إضافة 100 نانوغرام من زهوأنا هضم الحمض النووي λ و 10 نانوغرام من الحمض النووي تجزئتها إلى 10 ميليلتر نظام رد فعل جزئ مثلى، واحتضان رد فعل في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. لحزم λ جزئ الحمض النووي، إضافة 25 ميليلتر من مقتطفات التغليف لامدا في المنتج جزئ، واحتضان رد فعل عند 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. ثم، إضافة ميليلتر 25 إضافية من مقتطفات التغليف لامدا في أنبوب رد فعل. الاستمرار في احتضان رد فعل عند 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
    3. إضافة 500 ميليلتر لتمييع العقيمة المخزن المؤقت (10 ملم تريس-HCl (pH 8.3)، 100 ملم كلوريد الصوديوم، مجكل 10 مم2) في نظام رد الفعل، وتخلط بلطف بتشغيل الأنبوب رأسا على عقب عدة مرات. إضافة 25 ميليلتر من كلوروفورم وتخلط بلطف وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    4. إضافة 100 ميليلتر من بالعاثية تم حزمها و 100 ميليلتر من بكتيريا LE392MP (مثقف في 0.8-1.0 باستخدام متوسط رطل إضافة مع 10 مم MgSO4) في أنبوب جديد. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    5. إضافة 200 ميليلتر من خليط بالعاثية-بكتيريا إلى 4 مل أوفتوب أجار (المتوسطة رطل + أجار 0.7% + 10 مم MgSO4، تبريد إلى 48 درجة مئوية). مزيج فورا بتشغيل الأنبوب رأسا على عقب عدة مرات، ومن أجل ذلك على لوحة المعالجون مسبقاً (37 درجة مئوية) رطل.
    6. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها وشاشة اللوحة λ-ARS317 باستخدام PCR وتسلسلها.
  2. تنقية الركازة الحمض النووي من السائل ليساتيس11،18
    1. اختيار اللوحة واحد في 200 ميليلتر ddH العقيمة2س مع 10 مم مجكل2 و 10 نانومتر كاكل2. مزيج مع 200 ميليلتر من بكتيريا LE392MP (مثقف بين عشية وضحاها في المتوسط رطل)، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    2. إضافة خليط بالعاثية-بكتيريا إلى 100 مل نزسيم (10 غرام/لتر نيوزيلندي--أمين، 5 غ/لتر الخميرة استخراج 5 جرام/لتر كلوريد الصوديوم، 1 غرام/لتر هيدروليساتي كاسامينو ومجسو4·7H2س ز 2/لتر) المتوسطة والثقافة من أجل ح 7 عند 37 درجة مئوية. إضافة 250 ميليلتر من كلوروفورم في الثقافة ويهز لآخر 10 دقيقة.
    3. تحويل الثقافة إلى قارورة 200 مل. إضافة 5.8 جم من كلوريد الصوديوم (تركيز نهائي 1 م) ويحرك إلى أن يحل باليد، واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    4. الطرد المركزي في 12,000 س ز لمدة 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية لإزالة الأنقاض الخلية. جمع المادة طافية في قارورة 200 مل وإضافة 10% ربط8000 (m/V). يحرك بحل جهاز إثارة المغناطيسية واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة أو أطول.
    5. الطرد المركزي في 12,000 س ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية التعجيل في عاثية. إزالة المادة طافية.
    6. ريسوسبيند متسرعا في 2 مل بالعاثية تمييع المخزن المؤقت. تحويلها إلى أنبوب 15 مل وإضافة 10 ميليلتر من رناسي (التركيز النهائي و 20 ميكروغرام/مل) و 40 ميليلتر من الدناز (التركيز النهائي 5 ميكروغرام/مل). احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    7. إضافة 2 مل 0.3 M تريس-HCl (pH 9.0)، يدتا 100 ملم + 1.25% الحزب الديمقراطي الصربي، 15 ميليلتر بروتيناز ك (التركيز النهائي 10 ميكروغرام/مل). احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    8. إضافة 2 مل خلات البوتاسيوم قبل تبريد (3m, pH 4.8)، واحتضان الأنبوب على الجليد لمدة 10 دقائق.
    9. الطرد المركزي في 8,000 س ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية لإزالة المواد غير قابلة للذوبان.
    10. إضافة إلى حجم x 0.7 من الايزوبروبانول إلى المادة طافية. مزيج بتشغيل الأنبوب رأسا على عقب عدة مرات، واحتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    11. الطرد المركزي في 8,000 س ز لمدة 10 دقيقة على RT يعجل بالحمض النووي. إزالة المادة طافية.
    12. يغسل الحمض النووي مرة واحدة مع 70% إيثانول بالطرد المركزي في س 8,000 ز للحد الأدنى 10 إزالة المادة طافية.
    13. الوت الحمض النووي برفق باستخدام 500 ميليلتر المخزن المؤقت (10 ملم تريس-HCl، يدتا 1 مم، الرقم الهيدروجيني 8.0) الشركة المصرية للاتصالات، ونقل الحمض النووي في أنبوب 1.5 مل.
    14. استخراج الحمض النووي مرتين باستخدام الفينول: كلوروفورم بالطرد المركزي في ز 8,000 لمدة 10 دقائق.
    15. يعجل بالكحول وحدة التخزين x 0.7. مزيج من تحول إلى أسفل بلطف الأنبوب رأسا على عقب، والطرد المركزي في س 8,000 ز لمدة 10 دقائق.
    16. أغسل مرة واحدة مع الإيثانول 70 ٪، ريسوسبيند في 200 ميليلتر من الشركة المصرية للاتصالات. قياس تركيز الحمض النووي، وتخزينها في-20 درجة مئوية في 12.5 ميكروغرام مختبرين.

2-λ-ARS317 الحمض النووي بيوتينيليشن

  1. إلى فوسفوريلاتي بيوتينيلاتيد النوكليوتيد (5 '--أجتكجككجكك--الأرقام-البيوتين-3') مكملة للنهاية اليسرى لأصلي λ الحمض النووي، وإضافة 1 ميليلتر (100 ميكرومتر) النوكليوتيد وميليلتر 7.5 ddH2س، 1 ميليلتر من 10 × ليجاسى المخزن المؤقت 0.5 ميليلتر من بنك T4. تبني رد فعل في 37 درجة مئوية ح 3.
  2. فوسفوريلاتي λ-ARS317، وإضافة 12.5 ميكروغرام من λ-ARS317، ميليلتر 3 من 10 × ليجاسى المخزن المؤقت، احتضان 1 ميليلتر من بنك T4، و ddH2س إلى الحجم الإجمالي من 30 ميليلتر. رد فعل في 37 درجة مئوية ح 3.
  3. أن يصلب النوكليوتيد مع λ-ARS317، إضافة 0.5 ميليلتر من النوكليوتيد فوسفوريلاتيد، ميليلتر 195 ddH2س، ميليلتر 25 × 10 ليجاسى العازلة في أنبوب λ فوسفوريلاتيد-ARS317. المزيج بلطف بتشغيل الأنبوب رأسا على عقب، واحتضان عند 65 درجة مئوية للحد الأدنى 5 تشغيل إيقاف تشغيل سخان كتلة، واسمحوا بارد عينة إلى أقل من 33 درجة مئوية في الكتلة.
  4. لسد النوكليوتيد مع λ-ARS317، إضافة 1 ميليلتر من ليجاسى T4 الحمض النووي و 0.63 ميليلتر من ATP (200 ملم). المزيج بلطف بتشغيل الأنبوب رأسا على عقب، واحتضان في درجة حرارة الغرفة ح 2 أو 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. تخزين في 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد.
    ملاحظة: لتجنب تفتيت الحمض النووي، ينبغي أن يتم جميع الخطوات الاختلاط بلطف تشغيل الأنبوب رأسا على عقب، بدلاً من الاختلاط باستخدام الماصات.

3-ساترة التنظيف والروغان

  1. تنظيف ساترة
    1. كوفيرسليبس 20 مكان في الجرار المصبوغة 4 (5 كوفيرسليبس/جرة)، sonicate لمدة 30 دقيقة في الإيثانول، وشطف كوفيرسليبس مع عالي النقاوة ح2س 3 مرات.
    2. Sonicate لمدة 30 دقيقة مع م 1 هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH)، وشطف كوفيرسليبس مع عالي النقاوة ح2س 3 مرات. كرر الإيثانول، وكوه سونيكيشن مرة واحدة.
    3. Sonicate مع الأسيتون لمدة 30 دقيقة ومن ثم أشطف بعالي النقاوة ح2س بعناية (3 مرات على الأقل).
      ملاحظة: الأسيتون يجب إزالة تماما قبل الشطف بعالي النقاوة ح2س، لأنه قد يسبب انفجار عند اختلاط المذيبات العضوية (مثل الأسيتون) مع الحل البيرانا عن طريق الخطأ14.
    4. وضع في كوفيرسليبس في حل البيرانا (خليط 3:1 ح2هكذا4 و 30 ٪ ح2س2) واحتضان عند 95 درجة مئوية ح 1.
      ملاحظة: الحل البيرانا نشيطة للغاية والتآكل، لذا استخدم بحذر. عند إعداد حل البيرانا، إضافة 50 مل ح2س2 أولاً في كوب زجاج 500 مل، ثم قم بإضافة 150 مل ح2حتى4 ببطء إلى الكأس.
    5. أشطف كوفيرسليبس مع عالي النقاوة ح2س 5 مرات. ثم غسل كل ساترة مع عالي النقاوة ح2س دقة استخدام 3 قنينة مملوءة بعالي النقاوة ح2س، وتجفيف ساترة استخدام ورقة من حافة ساترة. ساترة في جرة المصبوغة والجاف ساترة جيدا في فرن 110 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      1. شطف ساترة مع الميثانول وَجْرَةَ المصبوغة في الفرن 110 ° C مرة أخرى لتجف ساترة تماما.
        ملاحظة: تجفيف ساترة دقة مهم جداً، لأن أبتيس سوف يكون الكثير من الهياكل السطحية ممكن حالما يتم حضور المياه19.
  2. الروغان ساترة
    1. أضف 70 مل من محلول silane (الميثانول 93% و 5% الخليك و 2% أبتيس) في كل جرة، برغي الغطاء وترك الجرة في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
    2. غسل وتجفيف كوفيرسليبس كما هو موضح في الخطوة 3.1.5، فيما عدا الجاف كوفيرسليبس دقة باستخدام غاز النيتروجين بدلاً من وضعها في الفرن.
    3. يذوب 150 ملغ من تلفزيون (ميثوكس-البولي إيثيلين جليكول) و 6 ملغ من البيوتين-شماعة (البيوتين-البولي إيثيلين جليكول) في 1 مل من 0.1 متر جديدة الصنع ناكو3 (pH 8.2) تماما. ثم الطرد المركزي في 17، 000 x ز لمدة 1 دقيقة لإزالة أوتاد غير قابلة للذوبان.
      ملاحظة: تقدم طازجة ناكو3 استعداد؛ ليس هناك حاجة لضبط الأس الهيدروجيني لها.
    4. ضع كوفيرسليبس سيلانيزيد في مربعات، وهما كوفيرسليبس الصغيرة على العلوي من طرفي كوفيرسليبس سيلانيزيد. "الماصة؛" 100 ميليلتر من حل الوتد في وسط ساترة سيلانيزيد، ومكان آخر سيلانيزيد ساترة في الجزء العلوي.
    5. إضافة بعض عالي النقاوة ح2س في المربع لإبقائه الرطبة، واحتضان كوفيرسليبس مع الحل شماعة لمالا يقل عن 3 ح في الظلام. يمكن العمل حضانة بين عشية وضحاها، وكذلك.
    6. فصل أزواج ساترة ومواكبة الوجه السطحية فونكتيوناليزيد وشطف كوفيرسليبس استخدام عالي النقاوة ح2س على نطاق واسع، وتجفيفها مع غاز النيتروجين.
    7. وضع علامة على الجانب فونكتيوناليزيد من كوفيرسليبس في إحدى الزوايا باستخدام قلم ماركر، الحفاظ على الجانب فونكتيوناليزيد الوجه لأعلى ووضعها في صناديق وتخزينها المربعات في مجففة فراغ لمدة شهر واحد.
    8. لتخزين في كوفيرسليبس لفترة أطول، ضع ساترة واحد في أنبوب 50 مل حفر مع فتحه واحدة في برنامجه، ثم وضع الأنبوب في كيس من بلاستيك، وختم الحقيبة باستخدام السدادة من فراغ. وبهذه الطريقة، كوفيرسليبس يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية حوالي 3 أشهر.

4-تدفق الخلية الجمعية

  1. قطع قناة 15 ملم × 2 ملم في وسط قطعة من الشريط على الوجهين (30 ملم × 12 ملم) باستخدام تثقيب.
  2. قشر قبالة الجانب ورقة من الشريط على الوجهين ولصقه على الشريحة الزجاجية مع اثنين من الثقوب. اضغط لإزالة فقاعات الهواء. استناداً إلى تجربتنا، أنه من الأسهل إزالة فقاعات الهواء عن طريق تقشير قبالة الجانب ورقة من البلاستيك جانب الشريط على الوجهين.
  3. قطع ساترة فونكتيوناليزيد (60 مم × 24 مم) إلى أربعة أجزاء (30 ملم × 12 ملم) باستخدام كوب مقلوب الماس الكاتب، وإزالة الأنقاض باستخدام غاز النيتروجين. تذكر أن تحافظ فونكتيوناليزيد جانب الوجه لأعلى.
  4. قشر قبالة الجانب البلاستيك من الشريط على الوجهين، ولصق الشريحة في ساترة فونكتيوناليزيد. اضغط برفق لإزالة فقاعات الهواء بين ساترة والشريط. إزالة فقاعات الهواء جيدا يمكن أن تحمي الخلية تدفق من تسريب بينما المخازن المؤقتة تم ضخها في ذلك.
  5. إدراج مدخل ومخرج الأنابيب في الثقوب الصغيرة والكبيرة، على التوالي. إصلاح الأنابيب استخدام الإيبوكسي.
  6. ضخ 20 ميليلتر من ستريبتافيدين (0.2 مغ/مل) في خلية تدفق يدوياً باستخدام المحاقن واحتضان في RT لمدة 10 دقائق. ثم ضخ حظر العازلة10 في الخلية تدفق ليحل محل ستريبتافيدين، ويبقيه في درجة حرارة الغرفة.

5-واحد جزيء التصور

  1. الحصول على تنسيق محاذاة الأحمر واستعملنا مع A5 على الأسفار المجهر اختبار الشريحة #1 بالإثارة المتزامنة استخدام ليزر 532 نانومتر وليزر 640 نانومتر. إنتاج الصور الطول الموجي مزدوج مع تقسيم البصريات (انظر الجدول للمواد).
  2. وضع الخلية تدفق على المجهر، والاتصال أنابيب مأخذ توصيل أنابيب أطول مع ربيع 10 مل مثبتة على مضخة لضخ/سحب الآلي لبرمجة.
    ملاحظة: ضخ المخازن المؤقتة إلى تدفق الخلية المذكورة أدناه وسائل سحب المخازن المؤقتة من أنابيب مدخل الخلية تدفق للمحاقن.
  3. مضخة المخزن المؤقت حظر في 500 ميليلتر/دقيقة في الخلية تدفق إزالة الهواء بسرعة وتأكد من أن المخزن في الخلية تدفق غير المحظورة. ثم ضخ المخزن المؤقت حظر في 200 ميكروليتر/دقيقة في الخلية تدفق والوجه الأنابيب منفذ لإزالة فقاعات الهواء من الأنبوب مدخل وخلية تدفق دقيق.
    ملاحظة: يجب أن يطرد كافة المخازن المؤقتة ضخها في الخلية تدفق في مجفف فراغ لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
  4. إضافة 0.5 ميليلتر بيوتينيلاتيد λ-ARS317 الحمض النووي إلى 80 ميليلتر من المخزن المؤقت لحظر، وضخه في الخلية تدفق في الدقيقة 25 ميليلتر لمدة 2 دقيقة. ثم مسح λ-ARS317 الحمض النووي باستخدام 200 ميليلتر من المخزن المؤقت لحظر بمعدل 50 ميكروليتر/دقيقة.
  5. ضخ 200 ميليلتر ملزم العازلة10 بمعدل 50 ميكروليتر/دقيقة لإزالة المخزن المؤقت حظر في الخلية تدفق.
  6. إضافة ميليلتر 0.2 المغلفة streptavidin قدوت705 (1 ميكرومتر) و 0.2 ميليلتر من بيوتينيلاتيد شركة مصفاة نفط عمان (1.2 ميكرومتر) في أنبوب، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ثم إضافة 20 ميليلتر من ربط المخزن المؤقت في الأنبوب، ووضعه على الجليد. يكون التركيز النهائي لشركة مصفاة نفط عمان-قدوت705 حوالي 10 نانومتر.
  7. إضافة 2 ميليلتر من شركة مصفاة نفط عمان-قدوت705 (10 نانومتر)، 1 ميليلتر من DTT (100 ملم)، 1 ميليلتر من ATP (200 ملم) إلى 96 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم. يكون التركيز النهائي لشركة مصفاة نفط عمان-قدوت705 0.2 شمال البحر الأبيض المتوسط.
  8. ضخ 20 ميليلتر من 0.2 nM شركة مصفاة نفط عمان-قدوت705 بمعدل 10 ميليلتر/دقيقة في الخلية التدفق. طرد المفرط شركة مصفاة نفط عمان-قدوت705 استخدام 200 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم بمعدل 100 ميليلتر/دقيقة. ثم ضخ المخزن المؤقت ملزم مع 30 نانومتر سيتو البرتقالي إلى الخلية تدفق إلى وصمة عار ركائز الحمض النووي بمعدل 100 ميليلتر/دقيقة.
  9. تثير إشارة705 شركة مصفاة نفط عمان-قدوت والملون "البرتقالي سيتو" إشارة الحمض النووي باستخدام ليزر 405 نانومتر و 532 نانومتر الليزر، على التوالي. مراقبة الإشارات في نفس الوقت مع تدفق ميليلتر في الدقيقة 100 باستخدام عامل تصفية ممر الموجه رباعية (FF01-446/510/581/703-25)، وتسجيل الصور من م-اتفاقية مكافحة التصحر مع 100 مللي ثانية لكل إطار. جمع 20 صورة كدسات من مختلف المجالات.

6-بيانات التحليل

  1. المحاصيل الصور باستخدام البرمجيات فيجي مع البرنامج المساعد جديد، والذي يتم تعديله بأنفسنا استناداً إلى صورة البرنامج المساعد (OI_cut_RGBmerge) وضعه مختبر الدكتور رون Vale في جامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو.
    1. المحاصيل كومة من الصور (512 × 512 بكسل) إلى الكدسات اثنين من الصور (256 × 256 بكسل). واحد هو 532 نانومتر الليزر نتيجة مثيرة، والآخر هو 405 نانومتر الليزر نتيجة مثيرة.
  2. معالجة صور متسلسلة 61 استخدام المشروع فيجي-الصورة-مداخن-Z (متوسط الشدة).
  3. قياس طول الحمض النووي (Lالحمض النووي) والمسافة من موقع شركة مصفاة نفط عمان-قدوت705 (Lشركة مصفاة نفط عمان) ملزمة للحمض النووي للحمض النووي المربوطة نهاية يدوياً.
  4. حساب نتيجة لشركة مصفاة نفط عمان/l:الحمض النووي باستخدام excel وتحليل البيانات باستخدام الأسلوب bootstrap بالبحث والتطوير، ثم إنشاء الرسم البياني وتناسب توزيعات الضبابي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تصور التفاعل بين شركة مصفاة نفط عمان المسمى قدوت وجمعية الإغاثة اﻷرمنية، نحن أولاً بناء الركيزة الحمض النووي λ-ARS317. تم إدماج جزء من الحمض النووي الذي يحتوي على ARS317 في زهوأنا الموقع (33.5 كيلو بايت) من الحمض النووي λ الأصلي طريق جزئ المتجانسة (الشكل 1A). ا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

نقدم هنا، وضع بروتوكول لمراقبة التفاعل بين البروتين المسمى قدوت والحمض النووي λ سيتيسبيسيفيكالي المعدلة باستخدام تيرفم في خلية تدفق. وتشمل الخطوات اللازمة الخاصة بالموقع تعديل الركازة الحمض النووي والحمض النووي بيوتينيليشن، وتنظيف ساترة والروغان، خلية تدفق إعداد، وتصوير جزيء واحد. وه?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

نشكر الدكتور حسن يارديمسى ويارديمسي Dr.Sevim معهد فرانسيس كريك لنوع المساعدة في التجارب جزيء واحد، الدكتور دانيال دوزديفيتش من مختبر الدكتور إريك جيم غرين من جامعة كولومبيا، الدكتور يوجي الشمس من جامعة بكين والدكتور كونلي تشن من جامعة تسينغهوا لإجراء مناقشة مفيدة. وأيد هذه الدراسة "الوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين" 31371264، 31401059، فريق الابتكار متعدد التخصصات الأكاديمية ونيوتن المتقدم الزمالة (NA140085) من "الجمعية الملكية".

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Lambda DNANew England BiolabsN3011Store 25 μL aliquots at -20 ºC.
XhoI enzymeThermo Fisher ScientificFD0694
Quick-fusion cloning kitBiotoolB22611
MaxPlax Lambda
Packaging Extracts		EpicentreMP5110Bacterial strain LE392MP
is included in this package.
MgSO4Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10013092Any brand is acceptable.
TrisAmresco0497-5KG
NaClBeijing Chemical worksN/AAny brand is acceptable.
MgCl2Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10012818
ChloroformBeijing Chemical worksN/AAny brand is acceptable.
NZ-amineAmrescoJ853-250G
Casamino acidsSigma-Aldrich22090-500G
PEG8000BeyotimeST483
Magnetic stirring apparatusIKAKMO2 basic
15 mL Eppendorf tubeEppendorf3012215115 mL, sterile, bulk, 500pcs
RnaseSIGMAR4875-100MG
DnaseSIGMAD5319-500UG
Proteinase KAmresco0706-100MG
Biotinylated primersThermo Fisher ScientificN/A
T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x)New England BiolabsM0202
CoverslipThermo Fisher Scientific22266882
EthanolSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10009259
Potassium hydroxide (KOH)Sigma-Aldrich306568-100G
AcetoneThermo Fisher ScientificA949-4
H2SO4Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80120891sulfuric acid
H2O2Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd1001121830% Hydrogen peroxide
MethanolSigma-Aldrich322415-2L
Acetic acidSigma-AldrichV900798
APTESSigma-AldrichA3648
mPEG
(methoxy-polyethylene glycol)		LysanmPEG-SVA-5000
biotin-PEG
(biotin-polyethylene glycol)		LysanBiotin-PEG-SVA-5000
NaHCO3Sigma-Aldrich31437-500G
Vacuum desiccatorTianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.IPC250-1
Vacuum sealerMAGIC SEALWP300
Diamond-tipped glass scribeELECTRON MICROSCOPY SCIENCES70036
Glass slideSail Brand7101
Inlet tubingSCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE/2inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm.
Outlet tubingSCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE/4inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm.
Double-sided tapeSigma-AldrichGBL620001-1EA
EpoxyLEAFTOP9005five minutes epoxy
StreptavidinSigma-AldrichS4762
Fluorescence MicroscopeOlympusIX71
Infusion/withdrawal
programmable pump		Harvard apparatus70-4504
532 nm laserCoherentSapphire-532-50
640 nm laserCoherentOBIS-640-100
EMCCD CameraAndorDU-897E-CS0-BV
W-View Gemini Imaging
splitting optics		Hamamatsu photonics K.K.A12801-01
TIRF illumination systemOlympusIX2-RFAEVA2
60×TIRF objectiveOlympusAPON60XOTIRF
Quad-edge laser dichroic
beamsplitter		SemrockDi01-R405/488/
532/635-25x36
Quad-band bandpass filterSemrockFF01-446/510/
581/703-25
Dichroic beamsplitterSemrockFF649-Di01-25x36
Emission filterChroma Technology CorpET585/65m
Emission filterChroma Technology CorpET665lp
FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1Thermo Fisher ScientificF36909
SYTOX OrangeThermo Fisher ScientificS11368
Qdot705 Streptavidin ConjugateThermo Fisher ScientificQ10163MPStore at 4 ºC, do not freeze.
ATPAmresco0220-25GPrepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC.
DTTAmrescoM109-5GPrepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC.

References

  1. Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
  2. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
  3. Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of transcriptional bursting in bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
  4. Wegner, K. D., Hildebrandt, N. Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).
  5. Gao, X., et al. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).
  6. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62(2014).
  7. Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).
  8. Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot. Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).
  9. Redding, S., et al. Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system. Cell. 163 (4), 854-865 (2015).
  10. Xue, H., et al. Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level. Frontiers in microbiology. 8, 2062(2017).
  11. Duzdevich, D., et al. The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level. Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).
  12. Hughes, C. D., et al. Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes. Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).
  13. Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).
  14. Chandradoss, S. D., et al. Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies. Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
  15. Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts. Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).
  16. Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57 (2), 179-186 (2012).
  17. Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).
  18. Lockett, T. J. A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates. Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).
  19. Smith, E. A., Chen, W. How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes. Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).
  20. Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies. Scientific reports. 7 (1), 2071(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

137

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved