Method Article
قمنا بتطوير استراتيجية لتنقية والصورة عدد كبير من centrioles في توجهات مختلفة قابلة للفحص المجهري القرار فائقة والجسيمات واحد في المتوسط.
Centrioles تجميعات الجزيئات الكبيرة الهامة للتنفيذ السليم للعمليات البيولوجية الخلية الأساسية مثل انقسام الخلية أو حركية الخلية إشارات الخلية. الطحالب الخضراء رينهاردتي تشلاميدوموناس ثبت أن طراز الثاقبة في دراسة الهندسة المعمارية مريكز، الدالة، وتكوين البروتين. وعلى الرغم من التقدم الكبير نحو فهم بنية سينتريولار، أحد التحديات الراهنة تحديد التعريب الدقيق لمكونات سينتريولار داخل المناطق الهيكلية مريكز من أجل فهم أفضل لدورها في مريكز نشوء حيوي. قيداً رئيسيا يكمن في حل مجهرية الأسفار، مما يعقد تفسير التعريب البروتين في هذا عضية مع أبعاد قريبة من الحد حيود. لمعالجة هذه المسألة، ونحن نقدم وسيلة لتنقية والصورة عدد كبير من رينهاردتي C. centrioles مع توجهات مختلفة باستخدام الفحص المجهري القرار فائقة. هذا الأسلوب يسمح لمزيد من المعالجة للبيانات عن طريق فلوري واحد-الجسيمات المتوسط (فلوو-سبأ) نظراً للعدد الكبير من centrioles المكتسبة. فلوو-سبأ يولد متوسطات الملون centrioles C. رينهاردتي في توجهات مختلفة، وبالتالي تيسير إضفاء الطابع المحلي على البروتينات متميزة في المناطق الفرعية سينتريولار. الأهم من ذلك، يمكن تطبيق هذا الأسلوب بصورة centrioles من الأنواع الأخرى أو التجميعات الجزيئات الكبيرة الأخرى.
مريكز هو عضية تقحم مصانة التي تكمن في صميم سينتروسومي في الخلايا الحيوانية، ويمكن أن تعمل كهيئة القاعدية (المشار إليها ك centrioles أدناه) بأهداب القالب أو سياط في كثير من حقيقيات النوى1،2. على هذا النحو، حاسمة بالنسبة للعمليات البيولوجية الخلية الأساسية تتراوح بين الجمعية المغزل إلى الخلية إشارات centrioles. ولذلك، ارتبطت مع العديد من الأمراض البشرية بما في ذلك سيليوباثيس والسرطانات3عيوب في الجمعية مريكز أو دالة.
Centrioles تضاعف، متناظرة، ميكروتوبولي الثلاثي القائم على الهياكل الاسطوانية التي هي، عادة، ~ 450 نانومتر طويلة و ~ 250 نانومتر واسعة4،5،،من67. المجهر الإلكتروني التقليدية والتصوير المقطعي cryo-إلكترون من centrioles من الأنواع المختلفة قد كشفت عن أن centrioles هي الاستقطاب على طول محورها طويل مع ثلاث مناطق متميزة: منطقة الدانية، ونواة مركزية، و منطقة البعيدة5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11-الأهم من ذلك، كل من هذه المناطق يعرض السمات الهيكلية المحددة. أولاً، يتضمن تجويف منطقة شمال البحر الأبيض المتوسط طوله الدانية 100 هيكل عجلة العربة متصلة بالثلاثي ميكروتوبولي من خلال عنصر رأس الدبوس12. ثانيا، يتضمن منطقة وسط شمال البحر الأبيض المتوسط طوله 300-400 كثافة ليفية في السمات الهيكلية والتجويف على طول الوجه الداخلي ميكروتوبوليس: رابط على شكل Y والذيل ج-A-9كعب الروتين. وأخيراً، منطقة شمال البحر الأبيض المتوسط 50 – 100 القاصي المعارض الملاحق الفرعية البعيدة والبعيدة التي تحيط بالجزء الأعلى من5،مريكز13.
لقد اتسمت في العقدين الأخيرين باكتشاف عدد متزايد من البروتينات سينتريولار، مما أدى إلى إجراء تقدير الحالي لبروتينات مميزة حوالي 100 كونها جزءا من مريكز14،،من1516، 17-وعلى الرغم من أوجه التقدم هذه، التعريب الدقيق لهذه البروتينات داخل مريكز يظل بعيد المنال، لا سيما داخل المناطق الفرعية الهيكلية. الأهم من ذلك، تعيين ترجمة دقيقة للمناطق الهيكلية مريكز أمر حاسم لفهم أفضل لوظيفتها. وفي هذا الصدد، centrioles رينهاردتي C. قد ساعدت في كلا من الجوانب بأول واﻻستعانة السمات الهيكلية المختلفة على طول الاسطوانة9،18،19، مما أتاح ثم الباحثين للربط بين إضفاء الطابع المحلي على مجموعة فرعية بروتينات باستخدام مجهر فلوري إلى منطقة شبه هيكلية. ويشمل هذا، على سبيل المثال، البروتينات Bld12p و Bld10p، الذي ترجمة في المنطقة الدانية، وفي هيكل عجلة العربة خاصة20،21،،من2223. كما تشمل قائمة البروتينات الهيكلية المترجمة POB15 و POC16، هما البروتينات الرواية حددها الكتلي التي تزين المنطقة الداخلية الأساسية المركزية centrioles رينهاردتي جيم- 17.
تقدم هذه الورقة وصف كامل للطريقة التي وضعت لعزل والصورة centrioles رينهاردتي C. للفحص المجهري القرار فائقة اللاحقة والجسيمات واحد في المتوسط. ولتحقيق هذا الهدف، من المهم أن تحدد القيود التقنية التي يتعين التغلب عليها. أولاً، يمكن أن تؤثر على تنقية مريكز البنيان الشامل، مع هيكل عجلة العربة وكثيراً ما يتم فقدان أثناء الخطوات المختلفة لعزل9. وثانيا، أبعاد مريكز قريبة جداً من الحد حيود في المجهر الضوئي. في الواقع، هو القرار الجانبية التي يمكن الحصول عليها في الفحص المجهري [كنفوكل] حوالي 200 نانومتر24، مماثلة للقطر مريكز، والقرار في ض-محور عن 2 – 3 س أقل، مما يؤدي إلى وحدة تخزين متباين. وثالثاً، يمكن أن يحد إلى التباين في اتجاه وضع العلامات ومريكز جسم تفسير الحاجة إلى ترجمة بروتين في منطقة سينتريولار الفرعية محددة. وأخيراً، توجد centrioles في نسختين فقط كل خلية، مما يجعل من الصعب الحصول على عدد كبير من الصور، والبحث عن اتجاه مريكز لا لبس فيها. للالتفاف حول هذه المسائل التقنية، قمنا بتطوير أسلوب يعتمد على تطبيق القرار فائقة مجهرية على عدد كبير من centrioles المعزولة التي تعتمد التوجهات المختلفة. نحن سوف تصف أول بروتوكول لتنقية رينهاردتي C. centrioles التي تمكن من تنقية centrioles سليمة هيكلياً وبروسينتريوليس التي تحتوي على عجلة العربة. ثم، ونحن سوف تصف بروتوكول خطوة بخطوة للتركيز centrioles على كوفيرسليبس للتصوير بواسطة التقليدية أو مجهرية فائقة القرار الفلورسنت. تسمح هذه الخطوة هامة لزيادة عدد centrioles تصويرها في اتجاهات متعددة. وأخيراً، نحن سوف تصف إجراء لإجراء واحد-الجسيمات في المتوسط على البيانات التي يحصل عليها من شأن المجاهر الفلورسنت التي تسهل الكشف عن centrioles في اتجاهات مختلفة. إجمالاً، يمكن تطبيقها على الصورة centrioles هذا الأسلوب من مختلف الأنواع أو التجميعات الجزيئات الكبيرة الأخرى.
1-وسائل الإعلام "إعداد" الثقافة رينهاردتي C. و "عزل مريكز"
2-عزل Centrioles رينهاردتي جيم
ملاحظة: انظر الشكل 1.
3-تحديد مقدار Centrioles معزولة عن كوفيرسليبس: الطرد المركزي والفلوره
ملاحظة: انظر الشكل 2.
4-تركيز Centrioles في وسط كوفيرسليبس
ملاحظة: انظر الشكل 3.
5-واحد الجسيمات في المتوسط
ملاحظة: انظر الشكل 4.
جيم-رينهاردتي "مريكز العزلة":
لعزل centrioles، cw15-نمت في الثقافة السائل لعدة أيام تحت ضوء الخلايا رينهاردتي C. والقريبون في وقت لاحق باستخدام الطرد المركزي في 600 x ز للخلايا بيليتيد 10 دقيقة تم غسلها x 1 مع برنامج تلفزيوني وحراكه في ديفلاجيليشن المخزن المؤقت قبل ديفلاجيليشن عن طريق إجراء صدمة الأس الهيدروجيني باستخدام حمض الخليك 0.5 M إلى الرقم الهيدروجيني نهائي من 4.5 – 4.7 لمدة 2 دقيقة(الشكل 1). واستخدم إضافة 1 ن كوه لاستعادة درجة الحموضة 7.0. فصل سياط منفصلة عن الهيئات الخلية، تم فصل الخلايا ديفلاجيلاتيد أولاً لإزالة الجزء الأكبر من سياط. بيليه ثم غسلها x 2 مع برنامج تلفزيوني وحراكه في 30 مل من برنامج تلفزيوني قبل تحميله ببطء على وسادة 25%-سكروز (الشكل 1ب). وكان نسج الأنبوب في 600 x ز لمدة 15 دقيقة عند 4 درجة مئوية لإزالة معظم سياط منفصلة. بعد الطرد المركزي، الهيئات الخلية التي كانت تنتشر في وسادة السكروز (الشكل 1ج) واستردادها عن طريق إزالة حوالي 30 مل من المادة طافية (حتى السهم الأحمر في الشكل 1ج). ثم حراكه في 20 مل من برنامج تلفزيوني الباردة 20 مل الناتجة من الخلايا غسلها وفصل في 600 x ز لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، تم تجاهل المادة طافية، وكانت حراكه الخلايا تماما في 10 مل من برنامج تلفزيوني. نقل الخلايا إلى زجاجة 250 مل وتحلل المخزن المؤقت تمت إضافتها إلى الخلايا ريسوسبينديد في وقت واحد. إضافة إلى تحلل الدناز والمحتضنة ح 1 في 4 درجات مئوية. بعد خطوة الطرد المركزي لإزالة الحطام الخلية (انظر بيليه الأبيض في الشكل 1د)، تم جمع المادة طافية وتحميلها بعناية على وسادة سكروز 60% 2 مل قبل الطرد المركزي في 10,000 س ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. لاحظ أنه بالنسبة 100 مل تحلل، استخدمت أنابيب 8 من 15 مل للقيام بهذه الخطوة، تناظر 12.5 مل من المخزن المؤقت تحلل تحميل في 2 مل سكروز كل أنبوب. بعد الطرد المركزي، تمت إزالة معظم المادة طافية يصل إلى 1 مل فوق وسادة. 1 مل من المادة طافية المتبقية ثم جمعها مع وسادة 2 مل وثم مختلطة وتجميعها للحصول على وحدة تخزين نهائي لمل 24. ثم تم تحميل التجمع اليوم 40%، 50%، 70%-السكروز التدرج ونسج في س 68,320 ز ح 1 و 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. وأخيراً، جمعت centrioles معزولة بثقب في الجزء السفلي من الأنبوب الطرد المركزي باستخدام إبرة وتم جمع القطرات في 12 × 500 ميليلتر الكسور. بسبب كثافة عالية من السكروز مختلفة، شكلت الانخفاض ببطء شديد في البداية (السكروز 70%)، ومن ثم أكثر سرعة (السكروز 40%).
الفلورة Centrioles معزولة
لتقييم نوعية إجراءات العزل، ثم كان تثفيل 10 ميليلتر لكل جزء الانحدار التي تم جمعها إلى ساترة استخدام محول دعم ساترة (الشكل 2A-2D). الأهم من ذلك، لإزالة بأمان ساترة، وقد صمم جهاز التوصيل مخصص (الشكل 2ب). بعد ذلك، حللت كوفيرسليبس واسطة الفلورة. واستخدمت في هذه الدراسة يشير إلى وجود هيكل عجلة العربة و α-توبولين (DMA1) لتسليط الضوء على الجدار سينتريولار أجسام مضادة ضد CrSAS-6(Bld12p). عد عدد centrioles التي كانت إيجابية بالنسبة كرساس-6 و α-tubulin كل مجال الرؤية وثم حساب إجمالي عدد centrioles كل الكسور، كان من الممكن لتحديد الكسور التي كانت إثراء لعزل centrioles ( الشكل 2 واو-ح 2). من المثير للاهتمام، كانت أثري الكسور 6 ل centrioles (الشكل 2 واو ز 2، الكسور #1 – 6)، مع ذروة للكسر #3، بينما كسور الأخير لم تكن، مشيراً إلى أنه يعمل التنقية. علما أن 95% centrioles مجموع في هذه التجربة خاصة، كانت إيجابية كرساس-6 و α-tubulin في كسر #3. يشير هذا إلى أن centrioles الأكثر عزلة الاحتفاظ بهم كارتوهيلس. إذا لوحظ لا إثراء centrioles في كسور الأولى، لم تنجح إجراءات العزل وينبغي تكراره. لاحظ أنه يمكن ملاحظة بعض القطع فلاجلر معظمها في كسور تخلو من centrioles.
المقبل، لحساب إجمالي عدد centrioles كل ميليلتر، ينبغي أن تضاعف عدد مريكز كل مجال الرؤية بالنسبة المبينة في الشكل 2ح. ثم تقسم الرقم الناتج بحجم الكسر المستخدمة الفلورة للحصول على عدد centrioles كل ميليلتر. في هذا الإجراء عزلة خاصة، الوارد الكسر المخصب الأكثر centrioles حوالي 37 لمنطقة 0.00846 مم2 (مع مجال رؤية من 92 × 92 ميكرومتر2). وكان سطح المقطع أنبوب 7.5 ملم في دائرة نصف قطرها بإجمالي مساحة 176 مم2. كانت النسبة المقابلة ثم 176/0.00846 = 20,803.8، لذا ما مجموعة centrioles 769,740 (37 × 20، 803.8) في 10 ميليلتر. ولذلك، كان عدد centrioles في 1 ميليلتر 76,974.
تركيز Centrioles المعزولة في كوفيرسليبس:
زيادة عدد centrioles كل حقل يزيد من فرصة للكشف عن اتجاه مريكز لا لبس فيها، فضلا عن زيادة فرصة للكشف عن التوجهات المماثلة التي يمكن استخدامها لزيادة إجراءات حساب المتوسطات الجسيمات. كما لا تزال متناثرة في ساترة centrioles من الكسور تتركز، قمنا بتطوير ملحق الطرد المركزي لتركيز centrioles في وسط ساترة (الشكل 3أ) اسمه مركز. لاحظ أن ملف.stl مع التدابير المحددة للطباعة ثلاثية الأبعاد يتم توفيرها مع هذه المخطوطة.
أولاً، قد شنت ساترة واحدة من 12 ملم على مركزات (الشكل 3ب). المحول وضعت على رأس ساترة وأنبوب أسفل المائدة المستديرة كان مقلوب ووضعها فوق محول تجميعها والمكثف. أنبوب أسفل المائدة المستديرة كان ثم بلطف مقلوب، مما يسمح لتحميل العينة (الخطوة 4، 2 منالبروتوكول ). ثم كانت تثفيل في centrioles في 10,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. وبعد ذلك تعرضوا الفلورة centrioles والملون كرساس-6/Bld12p و α-tubulin (الشكل 3-3E). الأهم من ذلك، دون مركزات، centrioles حوالي 30 شوهدت كل مجال الرؤية (الشكل 3ج)، بينما شوهدت 183 centrioles كل مجال الرؤية عندما كان مركزات المستخدمة (الشكل 3D-3F). علما بأن centrioles تغطي فقط قرص من 4 مم في القطر في منتصف ساترة. هذه النتيجة تبين أن هذه الخطوة تركيز يعمل ويسمح إثراء 6-fold centrioles في منطقة محددة من كوفيرسليبس، وبالتالي تخفيف الكشف عنها والتصوير.
واحد-الجسيمات الفلورية المتوسط لعزل جيم-رينهاردتي Centrioles:
هنا، باستخدام الفحص المجهري سيم أنه يمكن التوصل إلى حل لحوالي 120 نانومتر، centrioles الملون لتعديل توبولين في ميكروتوبوليس سينتريولار، مونوجلوتاميلاتيد توبولين (GT335، الرقم 4)، كانت المصورة24. رينهاردتي C. centrioles هي حوالي 500 نانومتر طويلة، دائماً في أزواج، وكثيراً ما وجدت مع المرتبطة وحديثا تكرار الهيئات بروباسال (المشار إليها بروسينتريوليس أدناه) و striated الألياف المرتبطة ميكروتوبولي19. ولذلك، كان هذا التجميع النهائي حوالي 1 ميكرومتر كبيرة. لهذا السبب، ومن أجل صورة centrioles في مجملها، نوصي بالحصول على كدسة Z في centrioles معزولة.
هنا، بعد اكتساب، تم إنشاء صورة نهائية عن طريق إجراء إسقاطات أقصى كثافة استخدام ImageJ28 (الصورة/رزمة/Z المشروع/ماكس كثافة الإسقاط، الشكل 4ب). من مثل هذه الصور، أجرى تحليل واحد-الجسيمات استخدام برامج الفحص المجهري الإلكترون البرد جعل فئات centrioles مع توجهات مماثلة، ومن ثم حساب متوسط أجرى. للقيام بذلك، وكان لون الصورة مقلوب أولاً بغية تحسين تصور الكائنات (الشكل 4ج). اختار centrioles يدوياً في مربع تتوسط كل الجسيمات باستخدام البرمجيات Scipion متاحة بحرية29 أن يدمج العديد من البرامج الميكروسكوب الإلكتروني مثل Xmipp3 (الشكل 4د). علما بأن حجم المربع وقد ليتم تعريفها من قبل المستخدم. هنا، المربعات 50 × 50 بكسل لحجم بكسل 31.84 استخدمت شمال البحر الأبيض المتوسط. بعد ذلك، كانت جميع الجزيئات المستخرجة (الشكل 4ﻫ) ومحاذاتها باستخدام Xmipp3 (الشكل 4و). بعد ذلك، تم تطبيق قناع دائرية 12 بكسل في دائرة نصف قطرها لعزل كل مريكز من سينتريولار-الزوج (الشكل 4ز). ثم تم تصنيف الجسيمات، باستخدام Xmipp3، لتوليد عدة متوسطات. وأبقى فقط المتوسطات فئة متجانسة، بمعنى أن الجزيئات التي تحيد عن المتوسطات فئة مستبعدة يدوياً. وتكررت هذه الخطوة بغية توليد بمتوسط شبه مثالية لكل التوجه الذي تم اختياره. بعد خمسة تكرارات، تولدت فئتان من المتوسطات: عرض طريقة عرض أعلى من الكائنات 63 (الشكل 4ح) وجانب من جزيئات 98 (الشكل 4أنا) مونوجلوتاميلاتيد centrioles. وتحددت أبعاد الكائن بقياس المسافة بين القمم للتشكيل الجانبي كثافة الأرض على طول إشارة مونوجلوتاميليشن.
الأهم من ذلك، هو طول متوسط فئة عرض الجانب 260 nm يبلغ قطرها 250 نانومتر، قابلة للمقارنة إلى إشارة tubulin مونوجلوتاميلاتيد المقاس الذي يظهر إلى ترجمة إلى منطقة من 286 ± 33 شمال البحر الأبيض المتوسط في الطول داخل نواة مريكز17.
الشكل 1 : تنقية جيم-رينهاردتي centrioles. (أ) هذا تمثيل تخطيطي لكل خطوة تؤدي إلى عزل رينهاردتي C. centrioles. أنه يتضمن خطوات الممثل (ج) لبروتوكول (ب) قبل وبعد الطرد المركزي على التدرج 25%-السكروز. يشير السهم الأحمر في لوحة ج إلى حجم الحد الأدنى للحفاظ على بعد الطرد المركزي. (د) هذا الفريق يظهر بيليه الأبيض لتفكيك الخلايا بعد الطرد المركزي. السهم الأسود يشير إلى بيليه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الإعداد الطرد المركزي لأداء الفلورة على عزل centrioles. (A) 10 ميليلتر لكل جزء المجمعة هو المخفف أولاً في 100 ميليلتر من 10 مم كالانابيب (الرقم الهيدروجيني 7.2). (ب) هذا تمثيل تخطيطي لأجهزة الطرد المركزي، تشمل أنبوب أسفل جولة 15 مل، ساترة 12 مم، محول ساترة، وجهاز التوصيل مصنوعة خصيصا لاسترداد ساترة بعد الطرد المركزي. لوحات C و D إظهار الرسومات التي تشرح كيفية استعادة ساترة بعد الطرد المركزي. (ج) مكان الأداة مدمن مخدرات في حفرة موجودة في فترة زمنية محددة حافة محول و (د) سحب بلطف. (ﻫ) هذه صور لقاعة الرطبة اللازمة للقيام بتصوير الفلورة. يشير السهم إلى ساترة 12 مم. (و) هذه الصور [كنفوكل] الممثل في 63 X (تكبير 2) للكسور التدرج #1-8، التي تم جمعها خلال عملية التنقية والملون كرساس-6 (أحمر) و α-tubulin (أخضر). وتناظر insets المنطقة أشارت إلى جانب مربع أبيض في آراء التكبير أقل. شريط المقياس = 10 ميكرون. (ز) هذا الرسم بياني الذي يمثل عدد centrioles الإيجابية كرساس-6 و α-tubulin كل مجال الرؤية في كل جزء. ملاحظة في الإثراء في الكسور #1-6. متوسط عدد centrioles كل حقل في كل جزء: #1 = ± 16.3 4.7، #2 = ± 24.0 4.6، #3 = ± 37.0 17.0، #4 = 23.3 ± 11.4، #5 = 14.3 ± 2، 1، #6 = 13.7 ± 9.3، #7 = 2.7 ± 1، 2، #8 = ± 1.0 0.0، #9 = ± 1.0 0.0، #10 = ± 0.0 0.0، #11 = ± 0.3 0.6، #12 = 0.0 ± 0.0. لكل جزء، تم تصويرها 3 حقول عشوائية. لاحظ أنه عند حساب الكسر المخصب الأكثر #3، وجدنا أن 95% centrioles إيجابية كرساس-6 و α-tubulin (n = 205 centrioles). (ح) نسبة عدد centrioles موجودة في منطقة ميكروجرافس قياس يستخدم لحساب العدد الإجمالي ل centrioles الحالية في مجال الأنبوب. ويمكن حساب عدد مريكز كل ميليلتر من الكسور 10 ميليلتر تثفيل أصلاً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : هي تثفيل centrioles المعزولة باستخدام مركزات. (أ) هذا الفريق يظهر أجهزة الطرد المركزي اللازمة لتركيز centrioles على كوفيرسليبس قبل الفلورة، بما في ذلك أنبوب أسفل جولة 15 مل ومركز وساترة 12 مم وجهاز محول دعم. (ب) هذا الفريق يوضح الخطوات لتجميع جهاز الطرد المركزي. لوحات ج-ه تظهر الصور [كنفوكل] من centrioles ملطخة مركزات كرساس-6 (أحمر) و α-tubulin (الأخضر) (ج) دون أو (د-ه). وتناظر insets المنطقة أشارت إلى جانب مربع أبيض في آراء التكبير أقل. شريط مقياس من 10 ميكرون. علما أن centrioles هي أثري في منتصف ساترة (خط منقط يمثل حدود منطقة مركزة). (و) هذا الرسم البياني تمثل عدد centrioles كل مجال الرؤية دون ومع مركزات. وجرى تحليل خمسة حقول نظر عشوائية. هو متوسط عدد centrioles، دون مركزات، 29.8 ± 2.9، ومع المكثف، ± 182.6 11.5، ف < 0.0001. كان تقييم الدلالة الإحصائية مزاوج تي-اختبار. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : جسيم واحد في المتوسط في عزلة جيم-رينهاردتيي centrioles. (أ) هذا الفريق صور المكدس يظهر Z centrioles ملطخة GT335 واكتسب استخدام مجهر سيم. (ب) إظهار هذه الألواح إسقاطاً Z شدة قصوى لصور مكدسة. مقياس بار = 1 ميكرومتر. (ج) تظهر هذه اللوحات صورة ممثل مع تباين مقلوب. ويمثل اقحم تكبير في تصور centrioles أفضل. (د) هذه الجسيمات تظهر لوحات الانتقاء. اقحم يبين كيف تم انتقاء الجزيئات. (ﻫ) وهذه أمثلة من 5 استخراج الجسيمات. (و) هذا الفريق يظهر الجسيمات بعد المحاذاة. (ز) هذا الفريق يظهر الجسيمات بعد تطبيق قناع. تظهر لوحات ح ، و هما فئة المتوسطات: عرض (ح) أعلى (الجسيمات 63) و (أنا) وجهة نظر جانب (الجسيمات 98). السهم المزدوج يشير إلى أبعاد إشارة GT335. شريط المقياس = 250 نيوتن متر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الملف التكميلي 1. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الملف التكميلي 2- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
أحد التحديات في مجال البيولوجيا فك التعريب الدقيق للبروتينات في سياق معمارية. مريكز بنية مثالية لتطبيق هذه الأساليب، كما درست الهندسة المعمارية استخدام التصوير المقطعي الإلكترون البرد، تكشف عن ملامح ultrastructural مثيرة للاهتمام على طوله. ومع ذلك، بسبب أبعادها قريبة من حد القرار بالمجهر الضوئي، من الصعب دقة ترجمة بروتين من الفلورة إلى منطقة مريكز استخدام المجاهر التقليدية30الفرعية هيكلية.
يقتصر القرار في المجهر الضوئي من حيود الضوء الذي يعطي، تقريبا، قرارا أقصى أفقي من 200 نانومتر في المجهر الضوئي24. ومع ذلك، قد هذا الحد تجنبت بواحدة من كبرى إنجازات السنوات ال 20 الماضية في المجهر الضوئي: اختراع أساليب القرار فائقة. هذه النهج يمكن الصورة خارج حدود حيود في قرارات مختلفة: 120 نانومتر سيم حوالي 50 نانومتر ليحث إذاعة استنزاف (STED) و 20 – 40 نانومتر للتعريب جزيء واحد مجهرية (سملم)24. مع هذه التطورات الجديدة من الفحص المجهري القرار فائقة، قابلة المناطق الفرعية الهيكلية من مريكز. ومع ذلك، في الممارسة العملية، ما زال من الصعب تحديد دقة التعريب من البروتين لعنصر هيكلي للسبب الرئيسي في أن centrioles ناضجة موجودة في نسخ 2 فقط لكل خلية والتوجهات العشوائية، مما يجعل تفسير الترجمة الصعبة. لهذا السبب، تم بروتوكول إنشاء الذي يسمح للباحثين صورة فائقة القرار عدد كبير من centrioles، زيادة فرصة لمراقبة التوجهات غير غامضة. الأهم من ذلك، حيث يعتمد هذا الأسلوب على استخدام centrioles معزولة، ونحن نقدم وسيلة لتنقية سليمة رينهاردتي C. centrioles التي تحتوي على centrioles ناضجة وبروسينتريوليس.
وأخيراً، نظراً لمجموعة التوجهات مريكز التي يمكن تصويرها بهذا البروتوكول، تحليل الجسيمات واحد يمكن تطبيقها استخدام البرمجيات الميكروسكوب الإلكتروني. ينتج عن هذا الجيل من متوسط فئات centrioles في اتجاه معين. الأهم من ذلك، يمكن استخدام هذه الصور 2-د الناتجة ثم تقييم التعريب بروتين محددة على طول مريكز. وفي الواقع، هذا الأسلوب يمكن تطبيقها على الصور ذات الدقة الفائقة المزدوج-لون، ويمكن استخدام لون واحد للكشف عن مريكز هيكل عظمى (مثلاً، توبولين)، في حين الألوان الأخرى يمكن أن يعزى إلى بروتين سينتريولار محددة. عن طريق طرح المتوسطات التي تم الحصول عليها مع لون واحد أو لونين، يصبح من الأسهل لتسجيل نسبة بروتين على طول مريكز (الدانية أو المركزية أو البعيدة). علما أنه ينبغي مواءمة القناتين بدقة لمنع أي تفسيرات مضللة. وعلاوة على ذلك، سوف تساعد المتوسطات لآراء كبار فك إذا كان بروتين يموضع داخل التجويف سينتريولار، على طول الجدار microtubule، أو خارج مريكز.
ويمتاز هذا الأسلوب للتأكد من إضفاء الطابع المحلي على البروتينات المحددة التي يمكن أن تكون صعبة لتعريب خلاف ذلك بسبب العلامات غير متجانسة. نلاحظ أن أساليب أخرى لتعيين البروتينات داخل centrioles قد وصف في الارتباطية سيم/سملم ثلاثي الأبعاد مع، على سبيل المثال، تقييم توجهات محددة centrioles بتحديد الشخصية اهليلجية علامة تشكيل الحيد حول مريكز بتصوير سيم. تستخدم هذه المعلمة، من الممكن ترجمة البروتين بدقة من 4 – 5 نانومتر30. لاحظ أيضا أن يستخدم الأسلوب الموصوفة هنا centrioles معزولة مع سليمة بروسينتريوليس، إشارة إلى أن بنية مريكز الأكثر احتمالاً يحافظ إلى حد كبير. ومع ذلك، لا يمكننا أن نستبعد أن بعض المعالم المعمارية باﻻنزعاج أثناء تنقية، مثل قطر مريكز متفاوتة مع تركيز الكاتيونات divalent كما تتضخم مع عزلة centrosome البشرية5.
واحدة من الخطوات الحاسمة للبروتوكول المعروضة هنا الحصول على مركزة بما فيه الكفاية centrioles معزولة في توجهات مختلفة قابلة لقطع-سبأ. للقيام بذلك، تأكد أولاً من النقاء وكفاءة إجراءات العزل مريكز. تركيز منخفض من centrioles معزولة يمنع التصوير السليم والاستمرار في معالجة الصورة. لهذا الغرض، ونحن نقدم وسيلة لإثراء عدد centrioles كل مجال الرؤية. اعتماداً على عدد centrioles في الكسر المستخدمة، ينبغي تعديل وحدة التخزين المحملة في مركزات، مع وحدة تخزين كحد أقصى من 250 ميليلتر.
الأهم من ذلك، أن هذا الأسلوب قد وضعت لجدار الخلية ناقص الخلايا رينهاردتي cw15--جيم . في هذه السلالة، هشاشة جدار الخلية يسمح تحلل سليم للخلايا، ومن ثم تحرير المحتوى الخاص به. هذا البروتوكول ليس من الكفاءة للبرية من نوع C. رينهاردتي الخلايا، كما يمنع جدار الخلية تحلل سليم. الاستراتيجيات البديلة مثل سونيكيشن أو حضانة قبل الخلايا مع أوتوليسين، إنزيم يمكن أن تتحلل في جدار الخلية31، يتعين أن توضع بتغيير الخلية جدار قبل تطبيق البروتوكول العزلة المعروضة هنا.
يمكن استخدام هذا الإعداد مع أنواع مختلفة من المجاهر، تتراوح بين المجاهر التقليدية [كنفوكل] المجاهر القرار فائقة الإنتاجية العالية مخصصة. لاحظ أن عند القيام سملم، المخزن مؤقت خاص المطلوب للتصوير السليم، وهكذا، ينبغي أن تستخدم غرفة مكيفة ساترة 12 مم مع المخزن المؤقت على رأس ساترة. سيتم إجراء تصوير اللاحقة مع المجهر المقلوب. إذا كان لا يسمح بتركيب المجهر ساترة 12 مم، يمكن تطبيقها البروتوكول المعروضة هنا على كوفيرسليبس 18 ملم باستخدام أنبوب أسفل جولة 30 مل ومحول تم التعديل والمكثف. كما أن من المهم ملاحظة أن نوعية إعادة إعمار سملم النهائي سيتوقف على النوعية لتلطيخ وجسم الأولية المستخدمة، فضلا عن طريقة التثبيت.
وباختصار، نحن نقدم أسلوب التي يمكن تطبيقها على الصورة التي أعقبت centrioles العديد من فلوو-سبأ التي سوف تولد متوسطات centrioles في التوجهات المختلفة، مما يساعد على ترجمة البروتين سينتريولار بدقة. الأهم من ذلك، يمكن تطبيق هذا الأسلوب أكثر عموما centrioles معزولة من الأنواع الأخرى، العضيات الأخرى، أو جمعيات الجزيئات الكبيرة. وأخيراً، نهج إعداد عينة المعروضة هنا، جنبا إلى جنب مع تطوير خوارزمية الأخيرة لتحليل واحد-الجسيمات الفلورية سملم البيانات32، يمكن أن تفتح المزيد من تحسين في الخرائط الجزيئية الكبيرة الجزيئات التجميعات.
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
ونشكر بيير Gönczy وبيويماجينج والبصريات منصة (بيوب) في مدرسة البوليتكنيك Fédérale دي لوزان، لوزان، سويسرا، حيث تم اقتناء صور سيم centrioles. كلنا نيكولاي ودافيدي جامباروتو معتمدة من قبل مجلس البحوث الأوروبي (ERC) ابتداء منح (الجنيه الاسترليني) 715289 (تمييز) وجينك Le Maeva، بول كيشار، والفرنسية فيرجيني هامل من PP00P3_157517 مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (سنسف). سوزان بورجيرس معتمد من قبل جامعة جنيف.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mouse monoclonal anti-apha tubulin (clone DM1A) | Abcam | ab7291 | dilution 1:300 |
DNaseI | Roche | 10104159001 | |
12 mm coverslips | Roth | YX03.1 | |
18 mm coverslips | Roth | LH23.1 | |
K2HPO4 | Fluka | 60355 | |
KH2PO4 | Fluka | 60230 | |
Tris base | Biosolve Chimie SARL | 0020092391BS | |
acetic acid | Carlo Erba Reagents | 524520 | |
NH4Cl | Sigma | A-4514 | |
CaCl2 | Sigma | C-7902 | |
MgSO4 | Sigma | 63140-500G-F | |
steritop filter | Millipore | SCGPT05RE | |
sucrose | Sigma | S7903-1KG | |
HEPES | AppliChem PanReac | A3724,0250 | |
PIPES | Sigma | P6757-500G | |
MgCl2 | ACROS ORGANICS | 197530010 | |
NP-40 | AppliChem PanReac | A1694,0250 | |
Round-bottom (Kimble) tubes 15 mL | Fisherscientific | 09-500-34 | |
Round-bottom (Kimble) tubes 30 mL | Fisherscientific | 09-500-37 | |
cover glass staining rack | Thomas scientific | 8542E40 | |
crystal polystyrene transmission lab box | FISHERS | 11712944 | |
Methanol | VWR | 20864.32 | |
BSA | Roche | 10735086001 | |
Triton X100 | Roth | 3051.3 | |
goat anti-mouse coupled to Alexa 488 | invitrogen | A11029 | dilution 1:1,000 |
goat anti-rabbit coupled to Alexa 568 | invitrogen | A11036 | dilution 1:1,000 |
mounting medium | abcam | ab188804 | |
Tube, thinwall polypropylene | Beckman Coulter | 326823 | |
Poly-D-Lysine 1 mg/mL | SIGMA | A-003-E | |
Mouse monoclonal anti-Polyglutamylation modification mAb (GT335) | Adipogen | AG-20B-0020 | dilution 1:1,000 |
glycerol mounting medium with DAPI and DABCO | Abcam | ab188804 | |
50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | |
Eppendorf 5810R centrifuge | Eppendorf | 5811000622 | |
Beckman JS-13.1 swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 346963 | |
Beckman SW 32Ti rotor | Beckman Coulter | 369694 | |
parafilm | Bemis | 13-374-10 | |
Leica TCS SP8 with Hyvolution mode | Leica | ||
OSRAM L18W/954 LUMILUX | Luxe Daylight/ OSRAM | ||
Whatman filter paper | Sigma | WHA1001325 | |
CrSAS-6/Bld12 antibody | dilution 1:300 (Hamel el al., 2014) | ||
Scipion | http://scipion.i2pc.es/ | ||
EM CCD camera (Andor iXON DU897) | Andor |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved