JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويدخل هذا البروتوكول أسلوب خطوتين بسيطة لتمييز الخلايا الجذعية الظهارية حوفي القرنية من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية تحت ظروف خالية من خلية ثقافة كرة-وتغذية. أساليب الثقافة الخلية المعروضة هنا تمكين إنتاج خلايا نوعية السريرية المنطبق على خلية القرنية العلاج باستخدام فعالة من حيث التكلفة، وعلى نطاق واسع.

Abstract

القرنية حوفي طلائي الخلايا الجذعية () المسؤولة عن تجديد ظهارة القرنية باستمرار، وثم المحافظة على التوازن القرنية والوضوح البصري. الخلية الجذعية pluripotent البشرية (هبسك)-المشتقة توفير مصدر خلية واعدة للعلاج باستبدال الخلايا القرنية. شروط الثقافة والتمايز غير معرف، إكسينوجينيك يؤدي التباين في نتائج البحث وتعوق ترجمة المستمدة من هبسك المداواة السريرية. يوفر هذا البروتوكول أسلوب قابل لإعادة الإنتاج والكفاءة للتمايز هبسك تحت ظروف خالية من خلية كرة-والتغذية. أولاً، ثقافة أحادي الطبقة هبسك غير متمايزة في المؤتلف laminin-521 (LN-521) والمتوسطة هبسك محددة بمثابة أساس لإنتاج قوية انطلاق المواد عالية الجودة للاختلاف. وثانيا، أسلوب المفاضلة هبسك سريعة وبسيطة غلة السكان ليسك في 24 يوما فقط. ويشمل هذا الأسلوب التعريفي الأدمة سطحية أربعة أيام في تعليق مع جزيئات صغيرة، تليها مرحلة الثقافة ملتصقة رابعا LN-521/الكولاجين تركيبة المصفوفة في متوسطة التمايز الظهارة القرنية محددة. كريوستورينج والتمايز الموسعة كذلك ينقي السكان الخلية وتمكن المصارف الخلايا بكميات كبيرة لخلية العلاج بمنتجات. هبسك-عالية الجودة الناتجة عن تقديم استراتيجية علاج رواية محتملة لإعادة بناء سطح القرنية لعلاج نقص الخلايا الجذعية حوفي (جلبتين).

Introduction

يسمح للضوء بالدخول الشبكية القرنية شفافة على سطح العين وتوفر معظم القوة الانكسارية للعين. يتم إعادة إنشاء الطبقة الأبعد، ظهارة القرنية الطبقية، بشكل مستمر بالخلايا الجذعية حوفي الظهارية (). الموجودة في الطبقة القاعدية لمنافذ حوفي1،مفرق كورنيوسكليرال2. ليسكس تفتقر إلى علامات محددة وفريدة من نوعها، حيث هويتهم يتطلب إجراء تحليل أكثر شمولاً لمجموعة من علامات المفترضة. P63 عامل النسخ الظهارية، ولا سيما ن لا شفاء منها مبتوراً نسخة عن isoform ألفا من p63 (ΔNp63α)، وقد اقترح كذات صلة إيجابية ليس علامة3،4. شعبة غير متماثلة من ليسكس يسمح لهم بتجديد نفسها، ولكن أيضا إنتاج ذرية التي تهاجر سينتريبيتالي والأسفل. كما الخلايا تقدم نحو سطح القرنية أنهم تدريجيا تفقد بهم ستيمنيس وأخيراً لا شفاء منها التفريق للخلايا الحرشفية السطحية التي فقدت بشكل مستمر من سطح القرنية.

الأضرار بأي من طبقات القرنية يمكن أن يؤدي إلى إعاقة بصرية شديدة، وعيوب القرنية وبالتالي واحدة من الأسباب الرئيسية لفقدان البصر في جميع أنحاء العالم. في عوز الخلايا الجذعية حوفي (جلبتين)، ليمبوس دمرها المرض أو الصدمة مما يؤدي إلى كونجونكتيفاليزيشن وعتامه سطح القرنية وفقدان الرؤية5،6لاحقاً. ويقدم العلاج استبدال الخلية باستخدام الطعوم حوفي ذاتي أو متمكنة استراتيجية علاج للمرضى الذين يعانون من جلبتين4،7،،من89. بيد أن حصاد ترقيع ذاتي يحمل خطر المضاعفات على العين السليمة والأنسجة المانحة هو نقص في المعروض. يمكن أن الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس)، على وجه التحديد في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (هيسكس) والخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسكس)، بمثابة مصدر غير محدود من أنواع الخلايا سريرياً ذات الصلة، بما في ذلك الخلايا الظهارية القرنية. ولذلك، المستمدة من هبسك (هبسك-) تمثل مصدرا خلية جديدة جذابة للعلاج باستبدال خلايا العين.

تقليديا، قد اعتمدت أساليب الثقافة هبسك غير متمايزة وبروتوكوليها التمايز إلى ليسكس على استخدام خلايا تغذية غير معرف أو الأمصال الحيوانية، وسائل الإعلام مشروطة أو أغشية السلي10،11، 12 , 13 , 14 , 15-في الآونة الأخيرة، أدت الجهود المبذولة في اتجاه أكثر أماناً خلية العلاج بمنتجات البحث عن بروتوكولات موحدة وخالية من كرة الثقافة والتمايز أكثر. نتيجة لذلك عدة أساليب محددة وخالية من كرة لثقافة طويلة الأجل من هبسكس غير متمايزة هي الآن متوفرة تجارياً16،،من1718. كسلسلة متصلة، توجيه التمايز بروتوكولات الاعتماد على الرموز الجزيئية لتوجيه هبسكس إلى مصير الظهارة القرنية وقد تم مؤخرا عرض19،،من2021،22، 23. بعد العديد من هذه البروتوكولات المستخدمة أما هبسكس تغذية على أساس غير محدد، كابتداء من مواد، أو زجاجات المعقدة، إكسينوجينيك عامل النمو للتمايز.

والغرض من هذا البروتوكول توفير كرة قوية، محسن،-وأسلوب ثقافة خالية من تغذية هبسك والتمايز اللاحقة إلى القرنية. ثقافة أحادي الطبقة هبسكس pluripotent laminin-521 (LN-521) المصفوفة في هبسك محددة وخالية من الزلال المتوسطة (8 تحديداً الأساسية فليكس) يسمح للإنتاج السريع لمادة انطلاق متجانسة للاختلاف. بعد ذلك أدلة بسيطة، استراتيجية التمايز خطوتين هبسكس تجاه مصير الأدمة السطحية في التعليق، متبوعاً بتمايز ملتصقة على ليسكس. يتم الحصول على عدد سكان خلية حيث أعرب > 65% ΔNp63α خلال 24 يوما. تم اختبار البروتوكول خالية كرة والتغذية مع عدة خطوط هبسك (هيسكس وهيبسكس)، دون أي اشتراط للخلية خط التحسين المحددة. تمكين بروتوكولات phenotyping الصيانة، باساجينج، كريوستورينج وهبسك خالية من عطلة نهاية الأسبوع هنا ووصف إنتاج دفعات كبيرة من عالية الجودة السريرية أو لأغراض البحث.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

جامعة تامبيري يحظى بموافقة "السلطة الوطنية" للشؤون ميديكوليجال فنلندا (دنرو 1426/32/300/05) لإجراء البحوث على الأجنة البشرية. ويضم المعهد أيضا البيانات الداعمة "اللجنة الأخلاقية" لمنطقة مستشفى بيركانما لاشتقاق، الثقافة، والتفريق بين خطوط هيس (سكوتمان/R05116) واستخدام خطوط هيبسك في أبحاث العيون (سكوتمان/R14023). لا توجد خطوط الخلية الجديدة استمدت هذه الدراسة.

ملاحظة: يستند البروتوكول وصف هبسك محددة والمتاحة تجارياً وظهاره القرنية التمايز وسائط الإعلام. يرجى الرجوع إلى الجدول للمواد اللازمة لإعداد المعلومات والكتالوجات الصانع/المورد.

1-إنشاء هبسك خالية كرة وتغذية ثقافة

  1. الأعمال التحضيرية
    1. معطف لوحات 24-جيدا مع laminin الماشوب البشري-521 (LN-521). لمرور أول (FF) خالية من علبة التغذية بالورق، استخدم LN-521 في تركيز من 1.09 ميكروغرام/سم2، وعند 0.55 ميكروغرام/سم2 للمقاطع التالية. تركيزات LN-521 المقترح بمثابة نقطة انطلاق لنجاح فرنك فرنسي الثقافة، لكن يمكن تخفيضها.
      1. ذوبان الجليد قنينة LN-521 ببطء في 4 درجات مئوية حسب تعليمات الشركة المصنعة.
        ملاحظة: يمكن تخزين التعامل معها على نحو مناسب LN-521 الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر بعد ذوبان الجليد.
      2. إعداد الحل الطلاء، إضعاف المبلغ المناسب لحل الأسهم LN-521 مع فوسفاتيبوفيريد المالحة (دببس دولبيكو س 1 في) التي تحتوي على Ca2 + و Mg2 + لإجمالي حجم 300 ميليلتر كل بئر.
      3. بيبيت الحل الطلاء للآبار، ختم اللوحة جيدا مع بارافيلم، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. قد يتم تخزين الألواح المغلفة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
        (اختياري): بدلاً من ذلك، لبروتوكول طلاء سريع، احتضان لوحات جيدا بمحلول طلاء ح 2 في 37 درجة مئوية، 5% CO2.
    2. إعداد هبسك الثقافة المتوسطة (8 تحديداً الأساسية فليكس) باستكمال متوسطة القاعدية بتكملة المقدمة، حسب تعليمات الشركة المصنعة. إضافة 50 يو/مليلتر البنسلين-ستربتوميسين. لاحظ أن وضع حساس للضوء وارتفاع درجات الحرارة. ذوبان الجليد في الملحق والدافئة وسائل الإعلام في درجة حرارة الغرفة (RT)، محمية من الضوء. استخدام المتوسط هبسك تستكمل خلال أسبوعين من تاريخ مكملات.
  2. نقل هبسك للثقافة فرنك فرنسي على LN-521
    1. قبل الحارة كل المواد اللازمة والمواد الكاشفة ل RT في هود الاندفاق الصفحي.
    2. هبسكس المرور من نظام الثقافة القياسية في تغذية طبقات (مثل القلفة البشرية المعطل (الأكايمية) أو الليفية الجنينية الماوس)، أو غيرها من النظم الثقافة فرنك فرنسي باستخدام منهجية موحدة. على سبيل المثال، يمكن تشريح المستعمرات هبسك مثقف في الأكايمية علبة تغذية الخلايا إلى قطع صغيرة مع مشرط والقطع ثم فصل مع طرف إبرة. PSCs البشرية المزروعة باستخدام نظم الثقافة FF يمكن نقلها باستخدام الكتلة باساجينج الأسلوب مع أو بدون علاج الإنزيم السابقة.
    3. إزالة الحل طلاء LN-521 من 24-الآبار وإضافة 1 مل هبسك قبل حرارة متوسطة كل بئر.
      ملاحظة: لا تسمح الآبار الجافة كما سيتم إلغاء تنشيط LN-521 عند التجفيف.
    4. نقل مجموعات القطع/خلية مستعمرة LN-521 المغلفة 24-آبار في المتوسطة هبسك مع ماصة. نقل 20 – 30 مستعمرة قطعة في البئر، تجنب الاكتظاظ الآبار.
    5. استبدال المتوسطة مع 1 مل متوسطة هبسك اليوم بعد نقل وكل يوم بعد ذلك. الثقافات على استعداد باساجينج 3 – 4 أيام في وقت لاحق كما نمت هبسكس خارجاً للمستعمرات مع مورفولوجيا غير متمايز، على نحو سلس. للإشارة، انظر الشكل 1 باء (الصورة الأولى). لمرور FF الأول، المستعمرات لا ينبغي أن تنمو إلى أحادي الطبقة المتلاقية تماما، ولكن ينبغي أن تكون باساجيد الثقافات عندما تصل إلى المستعمرات حجم تقريبي ل 1 مم.
  3. باساجينج والحفاظ على ثقافة هبسك فرنك فرنسي
    1. قبل الحارة كل المواد اللازمة والمواد الكاشفة ل RT في هود الاندفاق الصفحي.
    2. من الثانية مرور FF فصاعدا، ممر هبسكس FF عندما وصلت الثقافة كونفلوينسي 80-100%. مرور هبسكس فرنك فرنسي لقانون الجنسية الجديد-521 مغلفة بألواح 24-جيدا باستخدام خلية واحدة باساجينج مرتين في أسبوع (الاثنين والخميس) للحفاظ على الثقافات ذات جودة عالية مع مورفولوجيا غير متمايزة وتحقيق نظام تغذية خالية من عطلة نهاية الأسبوع. لمزيد من التفاصيل، يرجى الرجوع إلى18،،من2425.
      1. شطف هبسكس FF مرتين مع 1 مل x DPBS 1 دون Ca2 + و Mg2 +.
      2. فصل هبسكس فرنك فرنسي مع خالية من كرة التربسين-يدتا (على وجه التحديد تريبل حدد إنزيم) قبل تحضين ميليلتر 500 كل بئر في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2. مدة الحضانة المثلى، تسمح للخلايا التقريب ولكن ليس إلى فصل. وهذا عادة ما يستغرق 3 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 5% CO2 (لا تتجاوز 5 دقائق).
      3. إزالة خالية من كرة التربسين-يدتا وفورا إضافة 500 ميليلتر كل من مثبطات التربسين محددة جيدا.
      4. فصل هبسكس فرنك فرنسي بالدقيق، ولكن شامل بيبيتينج للحصول على تعليق خلية مفردة. نقل تعليق هبسك فرنك فرنسي من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب الطرد مركزي مخروطية 15 مل يحتوي على هبسك قبل حرارة متوسطة.
      5. غسل الآبار مع 1 مل متوسطة هبسك وإضافة المتوسطة الغسيل للأنبوبة المخروطية أجهزة الطرد المركزي 15 مل.
      6. الطرد المركزي من تعليق خلية واحدة فقط لمدة 5 دقائق في 300 x ز ونضح بيليه الخلايا وريسوسبيند في 1 مل هبسك قبل حرارة متوسطة.
      7. عد الخلايا مع هيموسيتوميتير أو العداد الآلي الخلية.
      8. إزالة الحل طلاء LN-521 (0.55 ميكروغرام/سم2) من 24-الآبار وإضافة هبسك المتوسطة كما هو الحال في 1.2.3.
      9. لوحة هبسكس فرنك فرنسي على 0.55 ميكروغرام/سم2 LN-521 المغلفة 24-الآبار في كثافة خلية 40,000 – 50,000 الخلايا/سم2.
      10. استبدال المتوسطة المتوسطة هبسك الطازجة في اليوم بعد باساجينج، وكل يوم بعد ذلك باستثناء أيام الأحد.
    3. الخلايا على استعداد لاستخدامها للتمييز بين 3-4 أيام بعد باساجينج، عندما وصلت إلى الثقافة > كونفلوينسي 85%. لضمان الجودة العالية هبسكس، أرجع إلى توصيف الطرق الموضحة بالتفصيل في السابق يعمل18،،من2425. من المستحسن إلا ثقافة هبسكس حتى مستوى مرور 15 في نظام FF استخدام خلية واحدة باساجينج لتجنب التغييرات كاريوتيبيك. فقط استخدام هبسكس عالية الجودة، وغير متمايزة كابتداء من المواد للاختلاف.

2-توجيه التمايز ونعد من المستمدة من هبسك

  1. الأعمال التحضيرية
    1. إعداد التعريفي خالية من كرة القاعدية المتوسطة (المتوسطة التعريفي القاعدية): تعديل "الملحق دولبيكو" المتوسطة النسر (تحديداً خروج المغلوب دميم) مع استبدال المصل خالية من كرة 15% (سبيسيفيكالي CTS "خروج المغلوب" ريال إكسينوفري)، 2 مم ل الجلوتامين، 0.1 مم 2- ميركابتوثانول والأحماض الأمينية غير الأساسية 1% U/mL 50 البنسلين-ستربتوميسين. استخدام وسيلة التعريفي القاعدية خلال أسبوعين.
    2. تعد وسائل الإعلام لتحريض القرنية في ثقافة الوقف.
      1. يوم 1: الملحق التعريفي القاعدية المتوسطة مع 5 ميكرومترات بليبيستاتين.
      2. يوم 2: تكملة التعريفي القاعدية المتوسطة مع 10 ميكرون SB-505124 و 50 نانوغرام/مل تنتجها الخلايا الليفية الأساسية البشرية عامل النمو (بفجف).
      3. يوم 3-4: الملحق التعريفي القاعدية المتوسطة مع عظم نانوغرام/مل 25 البروتين morphogenetic 4 (BMP-4).
    3. إعداد ظهارة القرنية التمايز المتوسطة (متوسط التمايز، على وجه التحديد المركز الوطني للاستشعار-30) للثقافة ملتصقة: إضافة المكملات الغذائية إلى متوسطة القاعدية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة وإضافة 50 يو/مليلتر البنسلين-ستربتوميسين.
      ملاحظة: وضع متوسطة التمايز حساسة للضوء. استخدام وسيلة تمايز تستكمل في غضون 6 أسابيع تاريخ مكملات.
    4. معطف 100 مم للتمايز ملتصقة أطباق زراعة الأنسجة (راجع الخطوة 2، 3) مع خليط من 5 ميكروغرام/سم2 الكولاجين المشيمة البشرية النوع الرابع (العمود الرابع) و 0.5 ميكروغرام/سم2 LN-521 المخفف في x DPBS 1 التي تحتوي على Ca2 + و Mg2 +، في مجموعة طلاء حجم 5 مل كل طبق. تحضير وتخزين الطلاء مع العقيد الرابع و LN-521، كما هو موضح في 1.1.1.3.
  2. الخطوة الأولى: الاستقراء القرنية في الثقافة تعليق
    1. قبل الحارة كل المواد اللازمة والمواد الكاشفة ل RT في هود الاندفاق الصفحي.
    2. فصل هبسكس فرنك فرنسي إلى تعليق خلية مفردة مع التربسين-يدتا خالية من كرة كما هو موضح في الخطوات 1.3.2.1–1.3.2.6. عد الخلايا، وتوزيع 2-3 × 106 خلايا كل مرفق منخفضة لوحة 6-جيدا جيدا، في إجمالي حجم 3 مل من تحريض القاعدية المتوسطة وتستكمل مع 5 ميكرومترات بليبيستاتين للحث على تشكيل المجلس التنفيذي بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، 5% CO2 (1 يوم).
    3. في اليوم التالي (اليوم 2)، إزالة المتوسطة واستبدال مع 3 مل من تحريض القاعدية المتوسطة وتستكمل مع 10 ميكرون SB-505124 و 50 نانوغرام/مل بفجف.
    4. في ما يلي يومين (3 – 4 أيام)، إزالة المتوسطة واستبدال مع 3 مل متوسطة التعريفي القاعدية وتستكمل مع 25 نانوغرام/مليلتر BMP--4.
  3. الخطوة الثانية: تمايز القرنية في الثقافة ملتصقة
    1. قبل الحارة كل المواد اللازمة والمواد الكاشفة ل RT في هود الاندفاق الصفحي.
    2. في يوم 5، لوحة الحديدية أسفل على أطباق زراعة الأنسجة 100 ملم المغلفة مع 5 ميكروغرام/سم2 العمود الرابع و 0.5 ميكروغرام/سم2 LN-521.
      1. إزالة الحل الطلاء من أطباق زراعة الأنسجة 100 مم وإضافة 10 مل متوسطة التمييز المعالجون مسبقاً للطبق الواحد.
        ملاحظة: لا تسمح الصحون لتجف كما سيتم إلغاء تنشيط LN-521 عند التجفيف.
      2. نقل الحديدية من لوح واحد 6-جيدا جيدا إلى اثنين إلى ثلاثة أطباق زراعة الأنسجة 100 مم (حوالي 50 الحديدية كل سم2) قبل بيبيتينج. توزيع الحديدية بالتساوي بالهز لطيف.
    3. الحفاظ على الخلايا في ثقافة ملتصقة على 37 درجة مئوية، 5% CO2، الاستعاضة عن المتوسط مع 10 مل من التمايز الطازجة المتوسطة ثلاث مرات في الأسبوع (يوم الاثنين والأربعاء والجمعة) 2.5-3 خلال الأسابيع المقبلة. فحص الخلايا بانتظام لظهور مورفولوجيا الظهارية الصحيح باستخدام مجهر تباين المرحلة.
  4. الخطوة الثالثة: Cryo-المصرفي المستمدة من هبسك
    1. قبل الحارة كل المواد اللازمة والمواد الكاشفة ل RT في هود الاندفاق الصفحي، باستثناء المتوسطة للواسمات التي ينبغي أن تكون مبردة مسبقاً.
    2. فصل المستمدة من هبسك مع التربسين-يدتا خالية من كرة وعد الخلايا، كما أوعز هبسكس فرنك فرنسي في 1.3.2.1–1.3.2.6 الخطوات، ولكن استخدام متوسطة التمايز.
      ملاحظة: لاشتقاق هبسك، وقت الحضانة المثلى مع التربسين-يدتا خالية من كرة أطول (حوالي 5 دقائق). استخدام 3 مل خالية من كرة التربسين-يدتا ومثبط التربسين محددة كل طبق 100 مم.
    3. بعد عد الخلايا، وتكرار استخدام الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ز 300 x، نضح المتوسطة وريسوسبيند بيليه خلية في المتوسط للواسمات هبسك برود مسبقاً، خالية من كرة. بيبيت الوحيدة الخلية تعليق في كريوتوبيس حيث يحتوي كل كريوتوبي 0.5 إلى 1 × 106 خلايا في 1 مل للواسمات المتوسطة.
    4. ضع الأنابيب في تجميد الحاويات ونقل مباشرة (في غضون 5 دقائق) إلى-80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    5. اليوم التالي، نقل الأنابيب للنتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
  5. الخطوة الرابعة: ذوبان cryopreserved هبسك-
    1. قبل ذوبان الجليد، معطف لوحات الأطباق/جيدا مع 5 ميكروغرام/سم2 العمود الرابع و 0.5 ميكروغرام/سم2 LN-521.
    2. قبل الحارة كل المواد اللازمة والمواد الكاشفة ل RT في هود الاندفاق الصفحي.
    3. إزالة الحل الطلاء من الأطباق/الآبار وإضافة الحجم المناسب للمتوسطة التمييز المعالجون مسبقاً.
      ملاحظة: لا تسمح الصحون لتجف كما سيتم إلغاء تنشيط LN-521 عند التجفيف.
    4. ذوبان الجليد في الخلايا بسرعة في الرايت ونقل على الفور بتعليق خلية لأنبوب الطرد مركزي مخروطية 15 مل يحتوي على 5 مل متوسطة التمييز المعالجون مسبقاً.
    5. الطرد المركزي بتعليق خلية لمدة 5 دقائق في 300 س ز، نضح، وريسوسبيند بيليه في متوسطة التمايز لإزالة أي وسيط للواسمات.
    6. لوحة الخلايا على الأطباق/الآبار المغلفة مع 5 ميكروغرام/سم2 العمود الرابع و 0.5 ميكروغرام/سم2 LN-521، في متوسطة التمايز في كثافة 40,000 – 50,000 الخلايا/سم2. الحفاظ على الخلايا في 37 درجة مئوية، 5% CO2، الاستعاضة عن متوسطة التمايز ثلاث مرات في أسبوع.

3-فينوتيبينج المستمدة من هبسك

  1. التحليل النوعي الفلورة
    1. الفلورة، معطف 24-12 جيدا أو لوحة الآبار مع 5 ميكروغرام/سم2 العمود الرابع و 0.5 ميكروغرام/سم2 LN-521 ولوحة/ذوبان هبسك-في متوسطة التمايز في كثافة 40 000 000 – 50 خلايا/سم2.
    2. عندما وصلت الثقافات كونفلوينسي، إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4% (PFA): يغسل الآبار مرتين مع x DPBS 1 دون Ca2 + و Mg2 +واحتضان 15-20 دقيقة مع 4% منهاج عمل بيجين في الرايت وبعد ذلك يغسل مرتين مع x DPBS 1 لإزالة أي بقايا منهاج عمل بيجين. استخدام 0.5-1 مل من حلول كل بئر.
      ملاحظة: الخلايا الثابتة قد تكون مخزنة في x DPBS 1 عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد قبل التلوين.
      تنبيه: منهاج عمل بيجين السامة والمسببة للتآكل. التعامل مع منهاج عمل بيجين في غطاء دخان وارتداء الملابس الواقية وحماية العين، والقفازات.
    3. نضح 1 x DPBS وبيرميبيليزي أغشية الخلية بحضانة لمدة 10-15 دقيقة مع 0.1% X-100 تريتون في 1 x DPBS.
    4. نضح 0.1% تريتون X-100 وكتلة جسم غير محدد مواقع الربط التي تفرخ ح 1 مع 3% البقري ألبومين المصل (BSA) في x DPBS 1 في تخفيف جسم الابتدائي تحضير الرايت في جيش صرب البوسنة 0.5% في 1 x DPBS.
      ملاحظة: انظر الجدول 1 للأجسام المضادة الأولية الموصى بها.
    5. نضح 3% جيش صرب البوسنة، واحتضان مع جسم الابتدائي على النحو المناسب المخفف بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    6. غسل الآبار 3 x لمدة 5 دقائق مع 1 x DPBS. إعداد تخفيف جسم الثانوية في جيش صرب البوسنة 0.5% في 1 x DPBS.
      ملاحظة: انظر الجدول 1 للأجسام المضادة الثانوية الموصى بها.
    7. نضح 1 x DPBS واحتضان مع جسم الثانوي مناسبة، على النحو المناسب المخفف ح 1 في الرايت، محمية من الضوء.
      ملاحظة: من هذه الخطوة، تبقى العينات محمية من الضوء للحيلولة دون تﻻشى الأصباغ الفلورية.
    8. غسل الآبار 3 x 5 دقائق مع 1 x DPBS، وأخيراً نواة كونتيرستاين مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) وجبل مع الأسفار تركيب وسائط. ويمكن استخدامها بشكل منفصل وفقا لإرشادات الشركة المصنعة DAPI أو المدرجة في الأجلين المتوسط وتصاعد. مكان الجولة كوفيرسليبس (قطرها 19 و 13 ملم للبئر 12 و 24 لوحات، على التوالي) في كل بئر. اتبع إرشادات الشركة المصنعة فيما يتعلق بتجفيف وتخزين العينات التي تم تحميلها.
    9. صورة الخلايا الملون مع مجهر فلوري.
  2. تحليل كمي الفلورة
    1. إعداد عينات سيتوسبين من هبسك مستمدة في كائن النظارات.
      1. فصل المستمدة من هبسك مع التربسين-يدتا خالية من كرة وعد الخلايا، كما هو موضح في الخطوة 2.4.2.
      2. بعد فرز الأصوات، إضافة x DPBS 1 مبردة مسبقاً والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في غ. س 300 ضبط حجم العينة وتركيز الخلية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة من سيتوسينتريفوجي معينة، مثل الخلايا 50,000 – 100,000 في وحدة تخزين عينة من 150 ميليلتر.
      3. تدور الخلايا وصولاً إلى نظارات الكائن مع سيتوسينتريفوجي مثلاً 5 دقيقة في 28 س ز وإصلاح فورا عن 15-20 دقيقة مع 4% الأرجنتينية في x DPBS 1 في الرايت للوقت الموصى به للغزل والسرعة، أرجع إلى دليل التعليمات من سيتوسينتريفوجي معينة.
    2. المضي قدما إلى تلطيخ عينات سيتوسبين كما هو موضح في الخطوات 3.1.3–3.1.8 استخدام مانع السائل القلم لتطويق العينات مع دائرة مسعور والقيام تلطيخ في معالجة تجميعية للممارسة الاقتصادية. ويمكن تنفيذ يغسل في حاويات مع أصحاب الشريحة، بغية ضمان كفاءة إزالة الأجسام المضادة الزائدة وتلوين خلفية الحد الأدنى. كونتيرستين الأنوية مع DAPI وجبل العينات ملطخة بالأسفار تركيب وسائط، تغطي مع كوفيرسليبس. اتبع إرشادات الشركة المصنعة فيما يتعلق بتجفيف وتخزين العينات التي تم تحميلها.
    3. التقاط الصور 5-10 كل عينة من مواقع مختارة عشوائياً باستخدام مثلاً 10 X التكبير مجهر الأسفار.
    4. تقدير النسبة المئوية للخلايا الملون إيجابيا فيما يتعلق بمجموع (DAPI الإيجابية) الخلايا، مثل أدوات البرمجيات (https://imagej.nih.gov/ij/) إيماجيج معالجة الصور وتحليلها. يفضل أن يكون تحليل > الخلايا 500 كل عينة.
      1. فتح الصورة ليتم تحليلها في برنامج إيماجيج. تكرار الصورة وتصفية مع التمويه الضبابي الافتراضي لإزالة الضوضاء.
      2. إنشاء عتبة. ضبط قيم العتبة للتحديد الأمثل من نواة خلية إيجابيا الملون، وتطبيقها. يتم تحويل الصورة تتكرر الآن إلى طريقة عرض ثنائي.
      3. أدوات عملية صورة ثنائية مع تجهيز ثنائي "ملء الثقوب" و "مستجمعات المياه"، التي سوف تفصل تلقائياً المجالات المدمجة يمثلون نواة واحدة.
      4. استخدم أداة "تحليل الجزيئات" تلقائياً قائمة في مناطق المصالح (رويس) إلى إطار إدارة العائد على الاستثمار، مما سيفتح عند تطبيق الأمر. قم بإغلاق الصورة الثنائية.
      5. تصور رويس في الصورة الأصلية عن طريق اختيار "إظهار الكل" في إدارة العائد على الاستثمار. تأكيد التحديد الصحيح لنواة الخلية الملون، وإذا لزم الأمر، إزالة يدوياً وإضافة الاختيارات الفردية.
  3. تحليل التدفق الخلوي
    1. للتأكد من أن مستويات التعبير p63α، وصمة عار الخلايا للتدفق الخلوي.
      1. فصل المستمدة من هبسك مع التربسين-يدتا خالية من كرة وعد الخلايا، كما هو موضح في الخطوة 2.4.2.
      2. أغسل الخلايا مرتين مع 1 مل يبرد قبل 1 x DPBS والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 x زاي الإصلاح وبيرميبيليزي مع الحلول الجاهزة للاستخدام التثبيت/بيرميبيليزيشن لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. بعد ذلك يغسل مبردة الخلايا مرتين مع 1 مل قبل 1 × بيرميبيليزينج المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
        ملاحظة: من هذه الخطوة على إبقاء الخلايا عند 4 درجة مئوية أو على الجليد، ما لم يشر إلى خلاف ذلك.
      3. تنبيه: يتضمن حل التثبيت/permeabilization فورمالدهايد 4.2 في المائة. التعامل مع الحل الخطرة في غطاء دخان وارتداء الملابس الواقية وحماية العين، والقفازات.
      4. تقسيم العينات إلى أنابيب البولي بروبلين 5 مل. ينبغي أن تحتوي كل عينة على خلايا 100,000 – 200,000 وينبغي تعديل حجم العينة إلى حوالي 100 ميليلتر من 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
      5. إضافة 2 ميليلتر من fluorochrome مترافق p63-α جسم نظام مراقبة الأصول الميدانية (لجسم الموصى به، انظر الجدول للمعدات والمواد) في أنابيب العينة. إجازة أونستاينيد عينة واحدة لتكون بمثابة مراقبة سلبية. دوامة العينات واحتضانها ح 1 في الرايت، محمية من الضوء.
      6. تغسل الخلايا مرتين مع 1 مل من قبل المثلجة 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي، وأخيراً، ريسوسبيند الكريات مع 300 ميليلتر من المخزن المؤقت. تخزين الأنابيب على الجليد، ومحمية من الضوء.
    2. تحليل العينات مع سيتوميتير تدفق. استخدام نموذج المراقبة السلبية أونستينيد النابضة للسكان الخلية الصحيحة، واستبعاد الإشارات الخلفية الفلورية. تحليل الحد أدنى من 10,000 p63-α-الملون الخلايا. لتنفيذ التقنية المفصلة، يرجى الرجوع إلى دليل المستخدم ل cytometer تدفق معين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

من هبسكس إلى هبسك-

وتستغرق العملية برمتها من الذي يحفز تمايز هبسكس فرنك فرنسي إلى كريوستورينج هبسك-حوالي 3.5 أسابيع. نظرة عامة التخطيطي أسلوب المفاضلة تسليط الضوء على خطواتها الرئيسية ترد في الشكل 1A. ويبين الشكل 1B...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

والنتيجة المتوقعة من هذا البروتوكول هو توليد ليسكس ناجحة وقوية من تعليق خلية مفردة هبسك فرنك فرنسي خلال أسبوعين تقريبا 3.5. كما يطور ظهارة القرنية من الأديم الظاهر السطحية29، تهدف الخطوة الأولى من البروتوكول التوجيهي هبسكس تجاه هذه النسب. وتستخدم تحريض ح 24 قصيرة مع تحويل عامل ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

أيده الدراسة أكاديمية فنلندا (رقم المنحة 297886)، وبرنامج قطع الغيار البشرية Tekes، وتمويل الوكالة الفنلندية للتكنولوجيا والابتكار، ومؤسسة مصرف الأنسجة والعين الفنلندية والمؤسسة الثقافية الفنلندية. يشكر المؤلفون فنيي المختبرات الطبية ميلين أوتي وحنا بيكانين فيكشتات أيما هيكيلا أوتي للمساعدة التقنية الممتازة والمساهمة في ثقافة الخلية. أستاذ كاترينا الفأر ألتو-Setälä المسلم لتوفير مرفق "بيوميديتيتش التصوير الأساسية" والخط هيبسك المستخدمة لتوفير المعدات اللازمة للتصوير بالأسفار.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Material/Reagent
1x DPBS containing Ca2+ and Mg2+Gibco#14040-091
1x DPBS without Ca2+ and Mg2+Lonza#17-512F/12
100 mm cell culture dishCorning CellBIND#3296Culture vessel format for adherent hPSC-LESC differentiation
12-well plateCorning CellBIND#3336Culture vessel format for IF samples
24-well plateCorning CellBIND#3337Culture vessel format for IF samples
2-mercaptoethanolGibco#31350-010
6-well plate, Ultra-Low attachmentCorning Costar#3471Culture vessel format for induction in suspension culture
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgThermoFisher Scientific#A-21202Secondary antibody for IF
Alexa Fluor 488 anti-rabbit IgThermoFisher Scientific#A-21206Secondary antibody for IF
Alexa Fluor 568 anti-goat IgThermoFisher Scientific#A-11057Secondary antibody for IF
Alexa Fluor 568 anti-mouse IgThermoFisher Scientific#A-10037Secondary antibody for IF
Basic fibroblast growth factor (bFGF, human)PeproTech Inc.#AF-100-18BAnimal-Free Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization SolutionBD Biosciences#554722Fixation and permeabilization solution for flow cytometry
BD Perm/Wash BufferBD Biosciences#554723Washing buffer for flow cytometry
BlebbistatinSigma-Aldrich#B0560
Bone morphogenetic protein 4 (BMP-4)PeproTech Inc.#120-05A
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-Aldrich#A8022-100G
Cytokeratin 12 antibodySanta Cruz Biotechnology#SC-17099Primary antibody for IF
Cytokeratin 14 antibodyR&D Systems#MAB3164Primary antibody for IF
Cytokeratin 15 antibodyThermoFisher Scientific#MS-1068-PPrimary antibody for IF
CnT-30CELLnTEC Advanced Cell Systems AG#Cnt-30Culture medium for adherent hPSC-LESC differentiation
Collagen type IV (human)Sigma-Aldrich#C5533Human placental collagen type IV
CoolCell LX Freezing ContainerSigma-Aldrich#BCS-405
CryoPure tubesSarsted#72.3801.6 mL cryotube for hPSC-LESC cryopreservation
Defined Trypsin InhibitorGibco#R-007-100
Essential 8 Flex Medium KitThermo Fisher Scientific#A2858501
GlutaMAXGibco#35050061
Laminin 521Biolamina#Ln521Human recombinant laminin 521
ΔNp63α antibodyBioCare Medical#4892Primary antibody for IF
OCT3/4 antibodyR&D Systems#AF1759Primary antibody for IF
p63α antibodyCell Signaling Technology#ACI3066APrimary antibody for IF
p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE Conjugate)Cell Signaling Technology#56687p63-α PE-conjugated antibody for flow cytometry
PAX6 antibodySigma-Aldrich#HPA030775Primary antibody for IF
Penicillin/StreptomycinLonza#17-602E
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich#158127Cell fixative for IF
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPIThermo Fisher Scientific#P36931DAPI mountant for hard mounting for IF
PSC Cryopreservation KitThermo Fisher Scientific#A2644601
TrypLE Select EnzymeGibco#12563-011
KnockOut Dulbecco’s modified Eagle’s mediumGibco#10829018
KnockOut SR XenoFree CTSGibco#10828028
MEM non-essential amino acidsGibco#11140050
SB-505124Sigma-Aldrich#S4696
Triton X-100Sigma-Aldrich#T8787Permeabilization agent for IF
VectaShieldVector Laboratories#H-1200DAPI mountant for liquid mounting for IF
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Cytocentrifuge, e.g. CellSpin IITharmac
Flow cytometer, e.g. BD Accuri C6BD Biosciences
Fluorescence microscope, e.g.Olympus IX 51Olympus

References

  1. Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
  2. Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R. Limbal and corneal epithelial homeostasis. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 348-354 (2017).
  3. Di Iorio, E., Barbaro, V., Ruzza, A., Ponzin, D., Pellegrini, G., De Luca, M. Isoforms of DeltaNp63 and the migration of ocular limbal cells in human corneal regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9523-9528 (2005).
  4. Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. The New England Journal of Medicine. 363 (2), 147-155 (2010).
  5. Notara, M., et al. In sickness and in health: Corneal epithelial stem cell biology, pathology and therapy. Experimental Eye Research. 90 (2), 188-195 (2010).
  6. Osei-Bempong, C., Figueiredo, F. C., Lako, M. The limbal epithelium of the eye--a review of limbal stem cell biology, disease and treatment. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 35 (3), 211-219 (2013).
  7. Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
  8. Sangwan, V. S., et al. Clinical outcomes of xeno-free autologous cultivated limbal epithelial transplantation: a 10-year study. The British Journal of Ophthalmology. 95 (11), 1525-1529 (2011).
  9. Basu, S., Mohan, S., Bhalekar, S., Singh, V., Sangwan, V. Simple limbal epithelial transplantation (SLET) in failed cultivated limbal epithelial transplantation (CLET) for unilateral chronic ocular burns. The British Journal of Ophthalmology. , (2018).
  10. Ahmad, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial-like cells by in vitro replication of the corneal epithelial stem cell niche. Stem Cells. 25 (5), 1145-1155 (2007).
  11. Hanson, C., et al. Transplantation of human embryonic stem cells onto a partially wounded human cornea in vitro. Acta Ophthalmologica. 91 (2), 127-130 (2013).
  12. Hayashi, R., et al. Generation of corneal epithelial cells from induced pluripotent stem cells derived from human dermal fibroblast and corneal limbal epithelium. PLoS ONE. 7 (9), e45435(2012).
  13. Hewitt, K. J., Shamis, Y., Carlson, M. W., Aberdam, E., Aberdam, D., Garlick, J. A. Three-dimensional epithelial tissues generated from human embryonic stem cells. Tissue Engineering. Part A. 15 (11), 3417-3426 (2009).
  14. Shalom-Feuerstein, R., et al. Pluripotent stem cell model reveals essential roles for miR-450b-5p and miR-184 in embryonic corneal lineage specification. Stem Cells. 30 (5), 898-909 (2012).
  15. Cieslar-Pobuda, A., et al. Human induced pluripotent stem cell differentiation and direct transdifferentiation into corneal epithelial-like cells. Oncotarget. 7 (27), 42314-42329 (2016).
  16. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature Biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
  17. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  18. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nature Protocols. 9 (10), 2354-2368 (2014).
  19. Mikhailova, A., Ilmarinen, T., Uusitalo, H., Skottman, H. Small-molecule induction promotes corneal epithelial cell differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 2 (2), 219-231 (2014).
  20. Martinez Garcia de la Torre, R. A., Nieto-Nicolau, N., Morales-Pastor, A., Casaroli-Marano, R. P. Determination of the Culture Time Point to Induce Corneal Epithelial Differentiation in Induced Pluripotent Stem Cells. Transplantation Proceedings. 49 (10), 2292-2295 (2017).
  21. Zhang, C., Du, L., Pang, K., Wu, X. Differentiation of human embryonic stem cells into corneal epithelial progenitor cells under defined conditions. PLoS One. 12 (8), e0183303(2017).
  22. Aberdam, E., Petit, I., Sangari, L., Aberdam, D. Induced pluripotent stem cell-derived limbal epithelial cells (LiPSC) as a cellular alternative for in vitro ocular toxicity testing. PLoS One. 12 (6), e0179913(2017).
  23. Kamarudin, T. A., et al. Differences in the Activity of Endogenous Bone Morphogenetic Protein Signaling Impact on the Ability of Induced Pluripotent Stem Cells to Differentiate to Corneal Epithelial-Like Cells. Stem Cells. 36 (3), 337-348 (2018).
  24. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nature Communications. 5, 3195(2014).
  25. Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 4(2017).
  26. Skottman, H. Derivation and characterization of three new human embryonic stem cell lines in Finland. In vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 46 (3-4), 206-209 (2010).
  27. Ahola, A., Kiviaho, A. L., Larsson, K., Honkanen, M., Aalto-Setälä, K., Hyttinen, J. Video image-based analysis of single human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocyte beating dynamics using digital image correlation. Biomedical Engineering Online. 13, 39(2014).
  28. Ojala, M., et al. Mutation-Specific Phenotypes in hiPSC-Derived Cardiomyocytes Carrying Either Myosin-Binding Protein C Or α-Tropomyosin Mutation for Hypertrophic Cardiomyopathy. Stem Cells International. 2016, 1684792(2016).
  29. Ali, R. R., Sowden, J. C. Regenerative medicine: DIY eye. Nature. 472 (7341), 42-43 (2011).
  30. International Stem Cell Initiative,, et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
  31. Foster, J. W., Wahlin, K., Adams, S. M., Birk, D. E., Zack, D. J., Chakravarti, S. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7, 41286(2017).
  32. Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

140 pluripotent

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved