الكشف عن نشاط ثنائي ملزم يجند المجال الإستروجين مستقبلات ألفا باستخدام مقايسة الهجين اثنين الثدييات

Summary

نحن نقدم طريقة لتحليل 4-هيدروكسي-تاموكسيفين-المعتمدة على الإستروجين مستقبلات ألفا ملزم يجند المجال ثنائي النشاط باستخدام مقايسة الهجين اثنين الثدييات.

Abstract

الإستروجين مستقبلات ألفا (ERα) منظم إستروجين يجند تعتمد على نسخ. هو يحافظ تسلسل البروتين ERα عالية بين الأنواع. وقد كان يعتقد أن وظيفة الإنسان والفأر ERαs مطابق. علينا أن نظهر تأثير التفاضلية 4-هيدروكسي-تاموكسيفين (4OHT) على الماوس والبشرية ERα ملزم يجند المجال (الإعلان) ثنائي النشاط باستخدام المقايسة (M2H) اثنين-الهجين الثدييات. والرزن M2H يمكن إثبات كفاءة الإعلان هوموديميريزيشن النشاط في خلايا الثدييات، الاستفادة من تعداء من اثنين والبلازميدات التعبير البروتين (GAL4 الحمض النووي ملزم المجال [دبد] الانصهار الإعلان و VP16 transactivation المجال [VP16AD] الانصهار الإعلان) عنصر المراعية GAL4 (GAL4RE) تنصهر بلازميد مراسل لوسيفراس. عند الانصهار GAL4DBD الإعلان والانصهار VP16AD قام وجعل من ديمر في الخلايا، هذا البروتين المعقدة يربط GAL4RE، وثم، ينشط تعبير جينات لوسيفراس من خلال نشاط النسخ تعتمد VP16AD. التنشيط بوساطة 4OHT لوسيفراس أعلى في الخلايا HepG2 التي تم transfected مع الماوس قام ERα الانصهار البروتين التعبير والبلازميدات مما في الإعلان ERα البشرية الانصهار البروتين التعبير بلازميد transfected الخلايا. هذه النتيجة تشير إلى أن فعالية الماوس 4OHT-تعتمد على نشاط هوموديميريزيشن قام ERα أعلى من البشر ERα الإعلان. بشكل عام، استخدام الإنزيم M2H أنه ليس مثاليا لتقييم نشاط ثنائي قام مستقبلات النووية، يغاندس ناهضة تعزيز مستوى النشاط قام القاعدية والذي يعوق الكشف عن نشاط ثنائي قام. ووجدنا أن 4OHT لا يعزز النشاط القاعدي قام ERα. وهذا عامل أساسي لكونه قادراً على تحديد وكشف بنشاط ثنائي الإعلان تعتمد على 4OHT بنجاح باستخدام مقايسة M2H. قد يتم تطبيق فحوصات M2H المستندة إلى قام ERα بدراسة نشاط مؤثر جزئي المغيرون مستقبل الإستروجين الانتقائي (مثلاً، 4OHT) في مختلف أنواع الخلايا الثديية.

Introduction

الإستروجين مستقبلات ألفا (ERα) منظم إستروجين يجند تعتمد على نسخ. الغاية هو المحافظة سيكوينسيوف الأحماض الأمينية ERα فيما بين الأنواع. بسبب التماثل أعلى بين الإنسان والفأر ERα، وهو فكر وظيفة هذه المستقبلات متطابقة كما والتفاضلية النشاط الاستروجيني المواد (مثلاً، تاموكسيفين) في هذه الأنواع هو الناجم عن اختلاف الأنواع الأيض الكيميائية بدلاً من الاختلافات الهيكلية من ERα. وقد حفظت ERα عالية مجال الهياكل المشتركة بين فوق عائلة مستقبلات النووية (NR)، عين أ لمجالات و. ه المجال أو المجال ملزم يجند (الإعلان) وتشمل جيب ملزم يجند ووظيفة التنشيط النسخي 2، المسماة بالعربية-2. المجال و هو مترجم متاخم للمجال الإلكتروني وهو المجال الأكثر متغير بين شمالي البحر الأحمر. وحتى بين الإنسان والفأر ERα، والتماثل في المجال و أقل بكثير من أن المجالات الأخرى¹. ويعزز قام يجند متجهة من ERα هوموديميريزيشن البروتين ERα لربط عنصر الحمض النووي الإستروجين استجابة محددة مباشرة لتنظيم النسخ الجيني يجند تعتمد على (العمل الكلاسيكي من ERα). وقد كشفت الدراسات بلورية التفاضلية وضع اللولب 12 (AF-2 المجال الأساسية) مع استراديول (E2)-أو 4-هيدروكسي-تاموكسيفين (4OHT)-منضمة قام dimers^2،3. المجال و ERα (الأحماض الأمينية 45) الاتصال اللولب 12 مباشرة. ومع ذلك، لا توجد معلومات فيما يتعلق بالأثر هذا التمديد من الأحماض الأمينية 45 (و المجال) من اللولب 12 على ثنائي قام ERα. في هذه الدراسة، ونظهر المساهمة في المجال و إلى إبلاغها هوموديميريزيشن قام ERα 4OHT-تعتمد على استخدام مقايسة (M2H) اثنين-هجين الثدييات.

والرزن M2H طريقة لإظهار تفاعلات البروتين البروتين في خلايا الثدييات إدخال المعينة بلازميد مختلفة ثلاث: البروتين هما التعبير والبلازميدات، التي تعبر عن GAL4 الحمض النووي ملزم المجال (DBD) الانصهار الانصهار قام ERα و VP16AD قام ERα، تنصهر GAL4RE لوسيفراس التعبير بلازميد مراسل. عندما تتفاعل الانصهار GAL4DBD قام ERα والانصهار VP16AD قام ERα (جعل ديمر) في الخلايا، هذا البروتين المعقدة يربط GAL4RE و، ثم، ينشط لوسيفراس التعبير الجيني من خلال وظيفة transactivation تعتمد على VP16AD. ويمكن تقييم مستوى هوموديميريزيشن قام بنشاط لوسيفراس.

الإنزيم (Y2H) اثنين-الهجين الخميرة هو أسلوب بديل يستند إلى المبدأ نفسه الذي يستخدم الخميرة كبيئة المضيف. أظهرت تقارير سابقة باستخدام نظام Y2H أن يزيد قام ERα البشرية والمجال اقتطاع E2-تعتمد على كواكتيفاتور التوظيف والختامية أن المجال و يمنع النسخ E2 بوساطة⁴. هذه النتيجة لا يتسق مع التقارير الأخرى التي أظهرت نشاط النسخي الموهنة ERα البشرية والمجال اقتطاع في خلايا الثدييات^5،6. مؤخرا، أظهرت دراستنا، استخدام نظام M2H، أن كواكتيفاتور E2-تعتمد على نشاط التوظيف البشرية ERα قام يتناقص باقتطاع المجال و في خلايا الثدييات، ويتسق مع النسخ النشاط¹. هذه الملاحظات تشير إلى أن دور التفاعل البروتين-بروتين الفسيولوجية تختلف بطريقة خاصة بنوع الخلية والسياق. يمكن أن تثبت مقايسة M2H البروتين-بروتين تفاعل النشاط في نفس السياق الخلوية التي تستخدم لتحديد النشاط الترانسكربتي. وهذا يوفر ميزة للمقايسة M2H مقارنة في Y2H أو في المختبر البروتين-بروتين التفاعل تحليلات أخرى.

لا تزال هناك أسئلة تتعلق بالآليات الجزيئية لنشاط مؤثر جزئي المغيرون مستقبل الإستروجين الانتقائي (SERMs) (مثلاً، 4OHT) لتنظيم النسخ ERα بوساطة. يمكن تطبيق فحوصات M2H المستندة إلى قام ERα بدراسة إليه نشاط مؤثر جزئي سيرمس في مختلف أنواع الخلايا الثديية.

Protocol

1-إعداد والبلازميدات المقايسة الهجين اثنين الثدييات

1. استخدام البلازميدات التالية: لوك pG5، ببيند-ERαEF، وميثاق-ERαEF.
   ملاحظة: والبلازميدات المتوفرة من المؤلفين عند الطلب ويتم إرسالها على ورق الترشيح. لوك pG5 هو بلازميد المراسل الذي يحتوي على تكرار خمسة من GAL4 تنصهر العناصر متجاوبة مع وحدة التعبير لوسيفراس (الشكل 1أ). ببيند-ERαEF هو بلازميد التعبير البروتين للبروتينات تنصهر GAL4DBD قام ERα. ببيند-ERαEF يحتوي على وحدة تعبير لوسيفراس رينيلا لتطبيع كفاءة تعداء (الشكل 1ب). حلف ERαEF هو بلازميد التعبير البروتين للبروتينات تنصهر VP16AD قام ERα (الشكل 1ج). يظهر الرسم التخطيطي هيكل البروتين المعرب عنها من البلازميدات في الشكل 2.
2. إعداد بلازميد السلطات الوطنية المعينة.
   1. قطع منطقة بلازميد محملة من الورق استخدام مقص نظيف ووضعه في أنبوب 1.5 مل. ارتداء القفازات واستخدام الملقط نظيفة لالتقاط الورقة محملة بلازميد. إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت تريس يدتا (TE) (pH 8.0) ودوامه جيدا.
   2. أضف 1 ميليلتر من الحل بلازميد الحمض النووي من الخطوة 1.2.1 إلى المختصة الإشريكيّة القولونية الخلايا (انظر الجدول للمواد) وإبقاء الأنبوب في الثلج لمدة 15 دقيقة.
   3. صدمة الحرارة المضافة بلازميد الخلايا المختصة؛ احتضان tube(s) في حوض ماء 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، وثم الاحتفاظ بها على الجليد لمدة 2 دقيقة.
   4. إضافة 250 ميليلتر من مرق سوبر الأمثل مع كاتابوليتي القمع (شركة نفط الجنوب) متوسطة (درجة حرارة الغرفة) إلى tube(s) والثقافة مع الهز في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   5. لوحة 100 ميليلتر من مثقف القولونية هاء على صفيحة (رطل) مرق لوريا بريوارميد مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين (10 سم-قطر الطبق) والثقافة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
   6. اختيار مستعمرة واحدة من اللوحة وإضافته إلى 14 مل أنبوب يحتوي على 2 مل مرق رائع (السل) مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين. الثقافة مع تهتز عند 37 درجة مئوية حتى بظلالها على المديين المتوسط هو ضعيف.
   7. إضافة 1 مل الوسط مثقف من الخطوة 1.2.6 إلى قارورة زجاج يعقم 250 مل يحتوي على 50 مل السل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين. الثقافة مع الهز في 37 درجة مئوية ح 20-24.
   8. نقل مثقف كولاي إلى 50 مل الأنبوبة المخروطية وأجهزة الطرد المركزي في س 3,450 ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة استخدام الدوار سوينغ-دلو. تجاهل في المتوسط. حفظ بيليه كولاي في-80 درجة مئوية.
   9. أضف 3 مل من محلول استثارة الخلية (انظر الجدول للمواد) إلى كولاي بيليه وتعليق عليه تماما. أضف 3 مل من محلول تحلل الخلية (انظر الجدول للمواد)، مزيج الأنبوب بلطف بعكس ذلك x 10، وإبقائه على الجليد لمدة 5 دقائق (الحفاظ على الوقت الموعد المحدد). إضافة 6 مل من محلول الأبطال (انظر الجدول للمواد)، مزيج الأنبوب مطردا مع التنصت، وثم يبقيه على الجليد لمدة 10 دقائق.
   10. الطرد المركزي الأنبوب في س 3,450 ز في ˚C 4 لمدة 30 دقيقة استخدام الدوار سوينغ-دلو. نقل الحل التي تحتوي على الحمض النووي لأنبوب مخروطي 50 مل جديدة وإضافة 10 مل راتنج تنقية الحمض النووي (انظر الجدول للمواد). تعليق الراتنج بلطف.
   11. الطرد المركزي الأنبوب في 625 x ز 1 دقيقة باستخدام الدوار سوينغ-دلو. تجاهل الحل وإبقاء الراتنج في الجزء السفلي.
   12. إضافة 15 مل من محلول الغسيل العمود (خلات البوتاسيوم 80 مم، 8.5 مم تريس-HCl [الرقم الهيدروجيني 7.5]، 40 ميكرومتر يدتا، ونسبة 55% إيثانول) أنبوب 50 مل المخروطية والتخلص منه بلطف أن تعلق الراتنج. كرر الخطوة 1.2.11.
       ملاحظة: الحل أغسل العمود يجب أن يكون مستعدا باستخدام ثنائي إثيل بيروكاربوناتي (ديبك)-معاملة المياه أو المياه خالية من نوكلاس.
   13. إضافة 5 مل من محلول الغسيل العمود إلى 50 مل الأنبوبة المخروطية وتعليق الراتنج مع بيبيت 5 مل. تطبيق الراتنج للعمود (انظر الجدول للمواد) التي تم تعيينها على فراغ المتشعبة. فراغ العمود حتى تجف الراتنج. إضافة 6 مل من محلول الغسيل عمود إلى العمود والفراغ.
   14. عندما يجف الراتنج بصريا، فصل الخزان من العمود. نقل المقطع السفلي للعمود (راتنج) إلى أنبوب 1.5 مل. الطرد المركزي العمود بأقصى سرعة لمدة 2 دقيقة باستخدام ميكروسينتريفوجي لتجف الراتنج تماما.
   15. نقل المقطع السفلي للعمود (راتنج) إلى أنبوب 1.5 مل جديدة. إضافة 300 ميليلتر من المياه خالية من نوكلياسي إلى العمود وانتظر حتى الراتنج كله يتم استيعابه.
   16. الطرد المركزي العمود بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة لجمع بلازميد الحل التي تحتوي على الحمض النووي (200-250 ميليلتر).
   17. علاج الحل التي تحتوي على الحمض النووي مع الفينول-كلوروفورم (1:1)، ثم مع كلوروفورم كما يلي.
       1. إضافة نفس الحجم من الفينول-كلوروفورم (1:1) لأن الحل الذي يحتوي على الحمض النووي (200-250 ميليلتر) ويهز جيدا، والطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة 2 دقيقة باستخدام ميكروسينتريفوجي. جمع الطبقة العليا (التي تحتوي على الحمض النووي الحل) وإضافته إلى أنبوب 1.5 مل جديدة. كرر هذه الخطوة 1 x.
       2. إضافة نفس الحجم من كلوروفورم إلى الحل الذي يحتوي على الحمض النووي (200-250 ميليلتر)، ويهز جيدا، وأجهزة الطرد المركزي بأقصى سرعة ممكنة للحد الأدنى 1 جمع الطبقة العليا (التي تحتوي على الحمض النووي الحل) وإضافته إلى أنبوب 1.5 مل.
          ملاحظة: يدفع الذيفان (lipopolysaccharide) الإشارات الخلوية في بعض الخلايا. لتجنب مثل هذا أثر الهائل، ينصح بخطوة 1.2.17، التي يمكن أن تقلل من التلوث الذيفان.
   18. يعجل بلازميد الحمض النووي باستخدام تقنية ترسيب الإيثانول كما يلي.
       1. أضف 1/9 حجم خليط الحمض النووي من خلات الصوديوم 3 م (pH 5.5) و x 20 م 3 حجم خلات الصوديوم من الإيثانول 100% للحل التي تحتوي على الحمض النووي. على سبيل المثال، إضافة 27.8 ميليلتر من خلات الصوديوم 3 أمتار و 278 ميليلتر من الإيثانول 100% إلى 250 ميليلتر من الحل الحمض النووي (وحدة التخزين النهائي هو 555.8 ميليلتر).
       2. يبقى الحل في-80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل. الطرد المركزي بأقصى سرعة ممكنة لمدة 20 دقيقة في 4 ˚C. تجاهل الحل وإبقاء بيليه. إضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 75% وشطف داخل الأنبوب. الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية، وتجاهل الحل، وإبقاء بيليه. جاف بيليه الحمض النووي باستخدام مركز فراغ.
       3. إضافة 100-250 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (pH 8.0) إلى الأنبوبة. حل بيليه الحمض النووي والتحقق من أن تركيز الحمض النووي باستخدام جهاز المطياف الضوئي في طول جه 260 نيوتن متر. الحفاظ على تركيز الحمض النووي حوالي 0.5 ملغ/مل.

2-الثدييات بالانزيم اثنين-الهجين

1. الحفاظ على الخلايا.
   1. الثقافة البشرية سرطانه الخلية الكبدية HepG2 الخلايا في 750 مل، 175 سم² زراعة الأنسجة قارورة مع وسائط أساسية خالية من الفينول الحمراء الدنيا (MEM) تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS؛ إبطال الحرارة)، 2 مم ل الجلوتامين، و 1% الحل البنسلين والستربتوميسين (المضادات الحيوية) للحفاظ على الخلايا.
   2. الثقافة الخلايا في شركة 5%₂-المكملة، حاضنة 37 درجة مئوية حتى الخلايا روافد 90% تقريبا.
      ملاحظة: إلى تقليل النشاط الاستروجيني الخلفية، يجب استخدام خالية من الفينول الحمراء المتوسطة لجميع M2H التجارب. وينبغي تنفيذ هذه الخطوة داخل سلامة نظيف مقاعد البدلاء وبيولوجية مجلس الوزراء. ينبغي الإبقاء على الخلايا بعد البروتوكول⁷الثقافة العامة خلايا الثدييات.
2. إعداد الخلايا تعداء.
   ملاحظة: ينبغي إجراء الخطوات الإجرائية التالية داخل مجلس الوزراء سلامة نظيف مقاعد البدلاء والبيولوجية. الخلايا المزروعة/المحتضنة في شركة 5%₂-تستكمل، حاضنة 37 درجة مئوية في هذه الخطوة في كل مرة.
   1. ريبلاتي الخلايا المتلاقية 90% إلى لوحات 24-جيدا؛ شطف الخلايا 1 x مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
   2. إضافة 7 مل من محلول يدتا التربسين 0.05% إلى قارورة الثقافة وامتصاص الخلايا لمدة 1-2 دقيقة مع إبقاء قارورة الثقافة في مقاعد البدلاء نظيف في درجة حرارة الغرفة. إزالة جزء من الحل يدتا التربسين وترك 1-2 مل الحل في قارورة الثقافة. احتضان قارورة الثقافة في الحاضنة لمدة 1-2 دقيقة.
   3. صفعة أسفل قارورة لفصل الخلايا وفحص الخلايا تحت المجهر.
      ملاحظة: إذا كان لا يزال الخلايا موصولة قارورة، احتضانها لآخر 1-2 دقيقة، وثم كرر الخطوة 2.2.3.
   4. تعليق الخلايا في ذاكرة خالية من الفينول الأحمر تستكمل مع 10% FBS الفحم جردت (الحرارة-معطل)، مم 2 لتر-الجلوتامين، ومحلول البنسلين والستربتوميسين 1%.
      ملاحظة: يجب استخدام الفحم جردت FBS التقليل من تأثير الإستروجين الذاتية المستمدة من المصل.
   5. حساب عدد الخلايا والبذور الخلايا في صفيحة 24-جيدا في كثافة 1.2 × 10⁵ خلايا/جيدا. تعيين ثلاثة آبار لكل نقطة بيانات (ثلاث).
   6. ثقافة الخلايا بين عشية وضحاها. ما زالت خطوة 2.4.1.
3. إعداد خليط الحمض النووي تعداء.
   ملاحظة: يتم transfected بلازميد التالية السلطات الوطنية المعينة في بئر واحدة: 100 نانوغرام من لوك pG5 مراسل بلازميد، 50 نانوغرام والبلازميدات التعبير للبروتينات الانصهار GAL4DBD (ببيند)، و 50 نانوغرام والبلازميدات التعبير للبروتينات الانصهار VP16AD (ميثاق).
   1. لتحليل نشاط ثنائي قام ERα تعتمد على يجند، إعداد تركيبات التالية (الشكل 3). تركيبة (ط): pG5-لوك ببيند-hERαEF + الميثاق، ولوك pG5 + ببيند-mERαEF + ميثاق. تركيبة (ثانيا): لوك pG5 ببيند-hERαEF + ميثاق-hERαEF، و pG5-لوك + ببيند-mERαEF + ميثاق-mERαEF. تركيبة (ثالثا): لوك pG5 + ببيند + ميثاق-hERαEF، و pG5 لوك + ببيند + ميثاق-mERαEF.
      ملاحظة: تركيبة (ط) تمثل القاعدية التجريبية مستوى البشرية قام ERα والفأر قام ERα، على التوالي. إذا كانت النتيجة تدل على مستوى عالية بشكل ملحوظ مع يجند وحدها، هذا الأسلوب غير مجد للاستخدام مع أن يجند (مثلاً، ديثيلستيلبيسترول [ديس]). تركيبة (ii) تمثل مستويات ديميريزيد قام ERα البشرية والماوس ديميريزيد قام ERα، على التوالي. تركيبة (ثالثا) يمثل عناصر سلبية؛ تستخدم هذه المجموعة فقط عندما يتم إجراء هذه التجربة للمرة الأولى لتقييم مستوى الخلفية للنظام.
   2. قبل الاختلاط، حساب الإجمالي كمية الدنا المطلوبة استناداً إلى العدد الآبار تعداء. للتجارب التي أجريت في تريبليكاتيس وفي بيانات خمس نقاط، مزيج بلازميد التالية السلطات الوطنية المعينة في أنابيب ميليلتر 1.5 اثنين لتركيبات (ط) و (ثانيا): pG5--لوك، 5 (نقاط البيانات) × 3 (الآبار) x 100 نانوغرام = 1,500 نغ (15 ميليلتر)؛ ببيند-mERαEF، 5 (نقاط البيانات) × 3 (الآبار) x 50 ng = 750 نغ (7.5 ميليلتر)؛ ميثاق (لتركيبة ط) أو ميثاق-mERαEF (لتركيبة الثاني)، 5 (نقاط البيانات) × 3 (الآبار) x 50 ng = 750 نغ (7.5 ميليلتر).
      ملاحظة: يتم تركيز كل حل الحمض النووي بلازميد 0.1 ميكروغرام/ميليلتر.
   3. يعجل بخليط الحمض النووي باستخدام تقنية الترسيب الإيثانول. أضف 1/9 حجم خليط الحمض النووي من خلات الصوديوم 3 م (pH 5.5) و x 20 م 3 حجم خلات الصوديوم من الإيثانول 100% إلى خليط الحمض النووي. ثم، دوامة الأنبوب.
      ملاحظة: على سبيل المثال، إضافة 3.4 ميليلتر من خلات الصوديوم 3 أمتار، وميليلتر 34 من الإيثانول 100% إلى 30 ميليلتر من خليط الحمض النووي بلازميد المتمثلة في خطوة 2.3.2. تساعد هذه الخطوة للحفاظ على شرط تعداء ثابتة، وأنه ليس من الضروري القيام بهذه الخطوة في سلامة بيولوجية مجلس الوزراء.
   4. الاحتفاظ الخليط بين عشية وضحاها في-20 درجة مئوية. الطرد المركزي أنه بأقصى سرعة ممكنة لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل الحل (بيليه غير مرئي). إضافة 120 ميليلتر من الإيثانول 75% للأنبوب؛ ثم شطف داخل الأنبوب. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل الحل والجافة وخليط الحمض النووي باستخدام مركز فراغ لمدة 30 دقيقة.
4. تؤدي تعداء.
   ملاحظة: ينبغي إجراء الخطوات التالية في مقاعد البدلاء نظيفة أو سلامة بيولوجية مجلس الوزراء.
   1. في صباح اليوم التالي، شطف الخلايا المصنفة في صفيحة 24-جيدا (من الخطوة 2.2.6) 2 x مع 0.5 مل من برنامج تلفزيوني (درجة حرارة الغرفة).
   2. إضافة الحار (37 درجة مئوية) تكمل MEM خالية من الفينول الحمراء الطازجة مع 10% الفحم-جردت FBS (الحرارة-معطل) و 2 مم الجلوتامين لام دون المضادات الحيوية لكل بئر (0.5 مل المتوسطة/جيد). إبقاء الخلايا في شركة 5%₂-تستكمل، 37 درجة مئوية حاضنة.
   3. تعليق خليط الحمض النووي بلازميد المجففة (من الخطوة 2.3.4) في المتوسطة تعديل النسر دولبيكو (دميم) (لا مصل، الفينول الحمراء-مجاناً، دون الجلوتامين؛ ميليلتر 13/جيد). حساب كميات دميم من عدد الآبار تعداء.
      ملاحظة: 15 بئرا لتركيبة (ط) × 13 ميليلتر = ميليلتر 195، و 15 بئرا لتركيبة (الثاني) × 13 ميليلتر = ميليلتر 195.
   4. تعليق الكاشف تعداء (انظر الجدول للمواد؛ 1.5 ميليلتر/بئر) في دميم (12.5 ميليلتر في البئر) في أنبوب 1.5 مل آخر. حساب مبالغ كاشف تعداء ودميم من عدد الآبار تعداء.
      ملاحظة: 30 [15 بئرا لتركيبة] (ط) و 15 بئرا لتركيبة (الثاني) × 1.5 ميليلتر من تعداء كاشف + 30 × 12.5 ميليلتر من دميم = 420 ميليلتر.
   5. إضافة مبلغ مساو للمتوسط كاشف تعداء (من الخطوة 2.4.4) لكل أنبوبة (من الخطوة 2.4.3). احتضان هذه الأنابيب لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: 200 ميليلتر من تعداء كاشف المتوسطة + 195 ميكروليتر من مزيج خليط الحمض النووي (ط) = ميليلتر 395، و 200 ميليلتر من تعداء كاشف المتوسطة + 195 ميكروليتر من مزيج خليط الحمض النووي (ثانيا) = ميليلتر 395. من المهم إضافة وحدة تخزين متساوية من تعداء كاشف المتوسطة للأنابيب من تركيبة (ط) و (ثانيا). فإنه ليس من الضروري استخدام ما يصل المتوسطة في هذه الخطوة.
   6. إضافة خليط مجتمعة (من الخطوة 2.4.5) لكل بئر (25 ميليلتر في بئر) من لوحة 24-جيدا (من الخطوة 2.4.2) واحتضان الخلايا ح 6 في 5% CO₂-تستكمل، 37 درجة مئوية حاضنة.
   7. إزالة المتوسطة تعداء من لوحة 24-جيدا. إضافة الحار (37 درجة مئوية) تكمل MEM خالية من الفينول الحمراء الطازجة مع 10% الفحم-جردت مم 2 لتر-الجلوتامين والحل 1% البنسلين-ستربتوميسين، FBS (الحرارة-معطل) ويجند (علقت في الإيثانول) (0.5 مل المتوسطة/جيد). الثقافة الخلايا ح 16-18 في شركة 5%₂-تستكمل، 37 درجة مئوية حاضنة.
5. حصاد العينات.
   1. شطف الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني، وثم إضافة 100 ميليلتر من 1 × تحلل السلبي المخزن المؤقت (انظر الجدول للمواد).
   2. قوة هزة لوحات 24-جيدا مع خلاط دوامة لفصل الخلايا.
   3. تجميد الألواح (خلية ليساتيس) x 1 بالنتروجين السائل أو حفظها في-80 درجة مئوية قبل التحليل. مباشرة قبل الفحص، بقوة يهز اللوحات على شاكر حتى أنهم في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يمنع هذه العملية غير منتظمة تظهر القيم الشاذة للنشاط لوسيفراس.
6. القيام فحص المزدوج-لوسيفراس.
   1. تعد الكواشف لنظام الفحص المزدوج-لوسيفراس (انظر الجدول للمواد).
      1. لجعل لوسيفراس الإنزيم المخزن المؤقت الركازة (جامعة الدول العربية)، إضافة العازلة الإنزيم لوسيفراس جميع إلى الركيزة الإنزيم لوسيفراس وفي زجاجة زجاج براون. حفظ المخزن المؤقت لاس في-20 درجة مئوية.
         ملاحظة: يجب أن استعد في المخزن المؤقت لجامعة الدول العربية إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال.
      2. لجعل المخزن المؤقت الركازة (ريال) لوسيفراس رينيلا، مزيج الركيزة لوسيفراس رينيلا ورينيلا لوسيفراس المخزن المؤقت في نسبة 01:50. جعل المخزن المؤقت لكل مقايسة ريال جديدة واستخدام أنبوب أسود أو أنبوب مظلل بورق ألمونيوم. حساب مقدار ريال المخزن المؤقت إجراء مخزن مؤقت جديد.
         ملاحظة: يجب أن استعد ريال المخزن المؤقت إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال.
   2. تعيين الكواشف في القارئ الميكروسكوبية.
      1. أغسل الحقن خطوط x 2 مع الإيثانول 70%؛ ثم، يغسل الأسطر 2 x مع الماء.
         ملاحظة: هذا المهم للحيلولة دون الإخلال بنتائج الفحص.
      2. مجموعة المخزن المؤقت جامعة الدول العربية إلى فالحاقن خط (حقن الأولى) وتعيين المخزن المؤقت ريال إلى السطر M-حاقن (الثانية حقن). لا تخلط هذه المخازن المؤقتة. المخزن المؤقت ريال يعرقل النشاط لوسيفراس.
   3. تطبيق 10 ميليلتر من عينات المقطوع (من الخطوة 2.5.3) إلى لوحة بلاستيكية بيضاء 96-جيدا.
   4. تطبيق الإعدادات التالية على القارئ الميكروسكوبية. للرتبة فالحاقن، استخدام وحدة تخزين من 50 ميليلتر، تأخير 2 ثانية، وسرعة من 50 ميليلتر/s. M-الحاقن، لاستخدام وحدة تخزين من 50 ميليلتر، تأخير 2 s، وسرعة من 50 ميليلتر/س. تعيين وقت إدماج مجموعة س. 15 درجة الحرارة إلى 25 درجة مئوية.
   5. قم بتشغيل القارئ الميكروسكوبية.
   6. تسجيل قيم النشاط لوسيفراس (إيبفالوي) وقيم النشاط لوسيفراس رينيلا (إيمفالوي) باستخدام برنامج اقتناء البيانات (انظر الجدول للمواد).
   7. أغسل خطوط حقن بعد جمع البيانات (راجع الخطوة 2.6.2.1).
7. القيام بتحليل البيانات.
   1. استخدام القيم التي تم تسويتها (إيبفالوي/إيمفالوي) لتحليل البيانات.
   2. تعيين القيمة التي تم تسويتها من تركيبة (ط) [لوك pG5 + ببيند-ERαEF + ميثاق] مع مركبة (0 يجند nM) ك 1 لحساب المستوى القاعدي وهوموديميريزيد قام ERα المستوى. يتم تمثيل المستويات ك "النشاط النسبي".

النتائج

يعرض الشكل 3 مخطط الاستجابات الممكنة في تركيبة (ط) وتركيبة (ثانيا) بلازميد transfected الخلايا. وترد النتائج التجريبية في الشكل 4. يظهر نشاط مجموعة (ط) (pG5-لوك + ببيند-mERαEF + ميثاق) التحفيز من 10 نانومتر E2 (الشكل 4أ)، لأنه يتضمن ...

Discussion

هنا، نحن وصف البروتوكول للمقايسة M2H، مع التركيز على شروط الفحص للكشف عن نشاط هوموديميريزاتيون قام ERα كمثال. وبصفة عامة، الإنزيم M2H ليست شعبية للتقييم ليجند-تعتمد على نشاط ثنائي قام ERα. هذا سبب الإعلان ERα حيازة دالة تنشيط النسخي؛ النشاط الذي يزعج، في بعض الحالات، نتائج التحليل M2H. ومع ذلك، ك?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pG5-Luc	Promega	E249A	Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pBIND	Promega	E245A	Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pACT	Promega	E246A	Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404010
Centrifuge Rotor	SORVALL	75006445
Swing Buckets	SORVALL	75006441
Cell Resuspension Solution (CRA)	Promega	A7112
Cell Lysis Solution (CLA)	Promega	A7122
Neutralization Solution (NSA)	Promega	A7131
Column Wash Solution (CWB)	Promega	A8102
Wizard Midipreps DNA Purification Resin	Promega	A7701
Wizard Midicolumns	Promega	A7651
MEM, no glutamine, no phenol red	Gibco	51200038
L-glutamine (200 mM)	Gibco	A2916801
0.5% Trypsin-EDTA (10x)	Gibco	15400054
Penicillin-Streptomycin (100x)	Sigma-Aldrich	P0781
BenchMark fetal bovine serum (FBS)	Gemini-Bio	100-106	Heat inactivated
Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum	Gemini-Bio	100-119	Heat inactivated
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red	Gibco	31053028	for transfection
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668027
Passive Lysis 5X Buffer	Promega	E1941
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1980
SpectraMax L microplate reader	Molecular Devices
SoftMax Pro Software	Molecular Devices