JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف لنا طريقة بسيطة للقياس الكمي السريع من وميلامين متعدد الفوسفات غير العضوية في البكتيريا المتنوعة، بما في ذلك الأنواع المتفطرات إيجابية وسلبية الغرام.

Abstract

وميلامين متعدد الفوسفات غير العضوي (سليلة) بوليمر بيولوجية الموجودة في الخلايا من جميع مجالات الحياة، ومطلوب من أجل الفوعة وإجهاد استجابة في العديد من البكتيريا. وهناك مجموعة متنوعة من أساليب لتحديد سليلة في المواد البيولوجية، والعديد منها كثيفة العمالة أو غير حساسة، يحد من فائدتها. نقدم هنا طريقة مبسطة للقياس الكمي سليلة في البكتيريا، تستخدم استخراج عمود غشاء والسليكا الأمثل للمعالجة السريعة لعينات متعددة والهضم من سليلة مع اكسوبوليفوسفاتاسي الخاصة سليلة سكبكس، والكشف عن فوسفات الحرة الناتجة مع مقايسة اللونية حساسة على أساس حمض الأسكوربيك. هذا الإجراء مباشرة، وغير مكلفة، ويسمح سليلة موثوقية القياس الكمي في مختلف أنواع الجراثيم. نقدم الكمي سليلة الممثل من بكتيريا سلبية الغرام (الإشريكيّة القولونية) وبكتيريا حمض الالكتيك إيجابية (ريوتيري اكتوباكيللوس)، والأنواع المتفطرات (بكتريا سميجماتيس). نحن تشمل أيضا بروتوكول بسيط لتنقية النيكل تقارب كميات مغ من سكبكس، التي ليست متاحة تجارياً حاليا.

Introduction

وميلامين متعدد الفوسفات غير العضوي (سليلة) هو بيوبوليمير خطية وحدات الفوسفات المرتبطة فوسفوانهيدريدي موجودة في جميع مجالات الحياة1،،من23. في البكتيريا المتنوعة، سليلة ضروري لاستجابة الإجهاد وحركية وتشكيل بيوفيلم، مراقبة دورة الخلية، ومقاومة المضادات الحيوية والفوعه4،5،،من67،8 9، ،،من1011. ولذلك قد دراسات الأيض سليلة في البكتيريا يمكن أن تسفر عن الأفكار الأساسية في قدرة البكتيريا تسبب المرض وتزدهر في بيئات متنوعة. في كثير من الحالات، ومع ذلك، الأساليب المتوفرة لتحديد سليلة في الخلايا البكتيرية عاملاً مقيداً في هذه الدراسات.

وهناك العديد من الطرق المستخدمة حاليا لقياس مستويات سليلة في المواد البيولوجية. عادة ما تشمل هذه الأساليب خطوتين متمايزتين: استخراج سليلة والتحديد الكمي سليلة موجودة في تلك المقتطفات. طريقة معيار الذهب الحالية، وضعت للخميرة Saccharomyces cerevisiae Bru والزملاء في12، سليلة مقتطفات جنبا إلى جنب مع الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي باستخدام الفينول وكلوروفورم، تليها الإيثانول هطول الأمطار، المعاملة مع deoxyribonuclease (الدناز) وريبونوكليسي (رناسي)، والهضم من سليلة المنقي الناتج مع S. cerevisiae اللاإنسانية سليلة إنزيم اكسوبوليفوسفاتاسي (سكبكس)13 لإنتاج الفوسفات مجاناً، والتي يتم بعد ذلك كمياً باستخدام الملكيت الأخضر-على أساس مقايسة اللونية. هذا الإجراء الغاية الكمية لكن كثيفة العمالة، مما يحد من عدد العينات التي يمكن معالجتها في تجربة واحدة، وليس الأمثل للعينات البكتيرية. وقد أبلغ آخرون استخراج سليلة من مجموعة متنوعة من الخلايا والأنسجة باستخدام الخرز السليكا ("جلاسميلك") أو السليكا غشاء الأعمدة6،،من1415،16،17، 18. هذه الأساليب لا كفاءة استخراج سلسلة قصيرة سليلة (أقل من 60 وحدة الفوسفات)12،،من1415، على الرغم من أن هذا أقل قلقا للبكتيريا، والتي يعتقد عموما أن توليف أساسا 3من سليلة سلسلة طويلة. الأساليب القديمة لاستخراج سليلة استخدام الأحماض القوية19،20 لم تعد تستخدم على نطاق واسع، منذ سليلة غير مستقرة تحت الظروف الحمضية12.

وهناك أيضا مجموعة متنوعة من أساليب سليلة تحديد المبلغ عنها. ومن بين الأكثر شيوعاً هو 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)، صبغة فلورسنت أكثر عادة ما تستخدم لوصمة عار الحمض النووي. المجمعات سليلة DAPI لها الأسفار المختلفة ماكسيما الإثارة والانبعاثات من الحمض النووي DAPI مجمعات21،22، لكن هناك تدخل كبير من المكونات الخلوية الأخرى، بما في ذلك الجيش الملكي النيبالي والنيوكليوتيدات الإينوزيتول الفوسفات12،،من1516،23، الحد من خصوصية وحساسية من سليلة القياسات باستخدام هذا الأسلوب. بدلاً من ذلك، يمكن تحويل سليلة و diphosphate الأدينوزين (ADP) إلى أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) استخدام المنقي الإشريكيّة القولونية سليلة كيناز (PPK) و ATP الناتجة كمياً باستخدام لوسيفراس14،17 ،18. وهذا يتيح الكشف عن كميات صغيرة جداً من سليلة، ولكن يتطلب خطوتين رد الفعل الأنزيمي ولوسيفرين وشرطة نقية جداً، التي هي الكواشف باهظة الثمن. سكبكس تحول دون التحديد النبذ سليلة إلى فوسفات حرة6،،من1213،24، التي يمكن الكشف عنها باستخدام طرق أبسط، ولكن سكبكس ب الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي12، مقتطفات الدناز يستلزم المعاملة رناسي المحتوية على سليلة. PPK سكبكس ليست متاحة تجارياً، وتنقية PPK معقدة نسبيا25،26.

يمكن أيضا تصور سليلة في ليساتيس الخلية أو مقتطفات في الهلام بولياكريلاميدي ب DAPI السلبية تلطيخ27،28،،من2930، أسلوب الذي يسمح بتقييم لطول السلسلة، ولكن هو انخفاض الإنتاجية وضعف الكمية.

ونحن الآن تقرير مقايسة سليلة سريعة وغير مكلفة، الإنتاجية المتوسطة يسمح التحديد الكمي السريع من سليلة المستويات في مختلف أنواع الجراثيم. يبدأ هذا الأسلوب بواسطة ليسينج الخلايا البكتيرية في 95 درجة مئوية في م 4 غوانيدين isothiocyanate (جتك)14 لإلغاء تنشيط phosphatases الخلوية، متبوعاً استخراج عمود غشاء والسليكا الأمثل للمعالجة السريعة لعينات متعددة. ثم يهضم الناتجة عن استخراج المحتوية على سليلة مع فائض كبير في سكبكس، مما يلغي الحاجة إلى معاملة الدناز ورناسي. نحن تشمل بروتوكول للنيكل واضحة انجذاب تطهير كميات مغ من سكبكس. وأخيراً، المستمدة من سليلة فوسفات حرة كمياً ب مقايسة اللونية البسيطة، حساسة، وتستند على حمض الأسكوربيك24 وتطبيع لمجموع البروتين الخلوي. يبسط هذا الأسلوب قياس سليلة في الخلايا البكتيرية، ونظهر استخدامه مع الممثل الأنواع من البكتيريا سلبية الغرام وإيجابية البكتيريا المتفطرة.

Protocol

1-تنقية الخميرة اكسوبوليفوسفاتاسي (سكبكس)

  1. تحويل سلالة overexpression بروتين كولاي BL21(DE3)31 مع بلازميد pScPPX26 انهانسر32 أو33من التحول الكيميائي.
  2. تطعيم 1 لتر مرق ليسوجيني (رطل) التي تحتوي على 100 ميكروغرام مل-1 الأمبيسلّين في قارورة أونبافليد ل 2 مع مستعمرة واحدة من BL21(DE3) التي تحتوي على pScPPX2، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية دون المصافحة، لامتصاص 600 نيوتن متر (600) من حوالي 0.3، كما يقاس جهاز المطياف الضوئي.
  3. بدء ثقافة الهز (180 لفة في الدقيقة) واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، خلال الوقت الذي سوف تنمو الخلايا إلى A600 من 0.4-0.5.
  4. إضافة الأيزوبروبيل β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج) بتركيز نهائي 1 ملم وإضافية 100 ميكروغرام مل-1 الأمبيسلّين، ثم احتضانها ح 4 في 37 درجة مئوية مع الهز 180 لفة في الدقيقة.
    ملاحظة: هذا البروتوكول overexpression يولد كمية كبيرة من سكبكس قابلة للذوبان. ومع ذلك، أوفيريكسبريشن سكبكس متسامح جداً، وقد استخدمت مجموعة متنوعة من البروتوكولات overexpression البروتين الشائعة الأخرى لتنقية سكبكس بنجاح.
  5. نقل الخلايا باستخدام زجاجة 1 لتر للطرد مركزي وحصادها من سينتريفوجينج لمدة 20 دقيقة في 5000 س ز في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية ونقل بيليه الخلية إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
    ملاحظة: الكريات خلية يمكن تخزينها إلى أجل غير مسمى في-80 درجة مئوية.
  6. ذوبان الجليد بيليه على الجليد، ثم ريسوسبيند أنه في 9 مل من 50 مم حبيس و 0.5 م كلوريد الصوديوم ايميدازول 5 مم (درجة الحموضة 8) لوحدة تخزين إجمالي حوالي 10 مل.
  7. إضافة lysozyme-1 مل 1 ملغ (تركيزات النهائي) و 2 مم مجكل2وحدات 50 مل-1 من endonuclease اللاإنسانية من الجيش الملكي النيبالي والحمض النووي (انظر الجدول للمواد)، واحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.
    ملاحظة: سكبكس ربط الأحماض النووية (البيانات لا تظهر)، ولذلك من الضروري معاملة نوكلاس أثناء تنقية.
  8. استخدام سونيكاتور مع ميكروتيب (انظر الجدول للمواد)، الخلايا بدورات سونيكاتيون على الجليد بقوة 50%، النبض 5 2 s s 5 وعلى الخروج، مع راحة 2 دقيقة بين الدورات.
    ملاحظة: تستخدم لحماية السمع المناسبة أثناء sonication. وبالمثل للحال بالنسبة أوفيريكسبريشن، مجموعة متنوعة من أساليب تحلل الخلية مقبولة لتنقية سكبكس.
  9. إزالة الحطام غير قابلة للذوبان سينتريفوجينج لمدة 20 دقيقة في 20,000 ز x عند 4 درجة مئوية. تصفية المادة طافية الناتجة (حوالي 10 مل) من خلال مرشح حقنه اسيتات السليلوز حجم مسام 0.8 ميكرومتر.
  10. تحميل ليساتي على مل 5 مشحونة بالنيكل خالب العمود (انظر الجدول للمواد) باستخدام مضخة تمعجية أو حقنه كبيرة.
  11. شطف العمود مع 50 مل من 50 مم حبيس، 0.5 م كلوريد الصوديوم، 5 ملم ايميدازول (pH 8).
  12. شطف العمود مع 50 مل من 50 مم هيبيس، 0.5 م كلوريد الصوديوم، 20 مم ايميدازول (pH 8).
  13. الوت سكبكس مع 50 ملم حبيس وكلوريد الصوديوم M 0.5 0.5 M ايميدازول (pH 8)، جمع الكسور 1 مل 15. اختبار هذه الكسور شطف للبروتين المحتوى مع مقايسة البروتين برادفورد34 (انظر الجدول للمواد)، وتشغيل صفحة الحزب الديمقراطي الصربي جل35 للتأكد من الكسور التي تحتوي على سكبكس المنقي (الوزن الجزيئي = كاتشين 45).
  14. تجمع الكسور التي تحتوي على سكبكس نقية وضبط تركيز البروتين المجمعة إلى حوالي 2 مغ مل-1 مع 50 ملم حبيس و 0.5 م كلوريد الصوديوم. قد يعجل بتركيزات أعلى من البروتين في الخطوة التالية.
  15. تبادل سكبكس المنقي في المخزن المؤقت لتخزين (20 مم تريس-HCl [الرقم الهيدروجيني 7.5]، 50 مم بوكل، والغليسيرول 10% [v/v]) عن طريق الغسيل الكلوي. ضع المجمعة سكبكس الكسور في طول مختومة من 12,000-14,000 دا الوزن الجزيئي الغسيل الكلوي قطع غشاء أنابيب (انظر الجدول للمواد) وتعليق في 1 لتر من المخزن المؤقت لتخزين مع التحريك المستمر في 4 درجات مئوية عن ه على الأقل 4. كرر هذه الخطوة مع الطازجة المخزن المؤقت لتخزين ما مجموعة 3 المخزن المؤقت تغييرات.
  16. نقل البروتين المنقي، دياليزيد إلى أنبوب الطرد مركزي أو أنابيب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 20,000 ز x عند 4 درجة مئوية لإزالة أي مجاميع غير قابلة للذوبان. نقل المادة طافية بعناية إلى أنبوب مخروطي نظيف 15 مل.
  17. ضبط تركيز سكبكس المنقي ل مل مغ 1-1 مع المخزن المؤقت لتخزين، وإضافة 0.1% (w/v) ألبومين المصل البقري خالية من مبطلات (جيش صرب البوسنة؛ والتركيز النهائي)، ومخزن لمدة تصل إلى 6 أشهر في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: سكبكس يفقد أكثر من 90% نشاطها عندما يكون المجمدة13.

2-جمع عينات لاستخراج وميلامين متعدد الفوسفات.

  1. تنمو البكتيريا ظروف الاهتمام لتحديد محتوى سليلة. لهذا البروتوكول، تنمو reuteri ملبنة36 بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية دون المصافحة في إنزيم مالك التعريفي (مي) المتوسطة37 دون سيستين (مي-ج).
  2. جني ما يكفي من خلايا بالطرد المركزي في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل بإجمالي 50 – 100 ميكروغرام من البروتين الخلوي (راجع الخطوة 3 أدناه). كولاي، هذا 1 مل ثقافة المرحلة سجل A600 من 0.2-0.4. وهذا لام ريوتيري، 1 مل ثقافة بين عشية وضحاها. ضبط حسب الضرورة للأنواع الأخرى من الفائدة.
  3. إزالة المادة طافية من الكريات الخلية.
  4. ريسوسبيند الكريات الخلية في 250 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل جيتك (isothiocyanate غوانيدين م 4، 50 مم تريس-HCl، ودرجة الحموضة 7) و بالحضانة عند 95 درجة مئوية للحد الأدنى 10 ليساتيس المخزن في-80 درجة مئوية.
    ملاحظة: تكون متسقة مع مرور الوقت تحلل، منذ الحضانة الموسعة في درجة حرارة عالية قد ينتج عن تدهور سليلة بالتحلل المائي38. ويمكن تخزين ليساتيس إلى أجل غير مسمى في-80 درجة مئوية.
    تنبيه: isothiocyanate غوانيدين هو ملح تشاوتروبيك وينبغي التعامل مع القفازات والتخلص منها كنفايات خطرة.

3-قياس البروتين محتوى الخلية ليساتيس

  1. إعداد معايير جيش صرب البوسنة الذي يحتوي على 0، 0.1، 0.2 و 0.4 مغ مل-1 لجيش صرب البوسنة في المخزن المؤقت لتحلل جتك.
    ملاحظة: من المهم جعل المعايير جيش صرب البوسنة في جتك، إذ جتك يؤثر وضع لون المقايسة برادفورد. ويمكن تخزين معايير جيش صرب البوسنة إلى أجل غير مسمى في-20 درجة مئوية.
  2. الكوة 5 ميليلتر ليساتيس خلية المذابة، مختلطة جيدا والمعايير جيش صرب البوسنة لفصل الآبار في لوحة واضحة 96-جيدا.
  3. إضافة ميليلتر 195 من برادفورد كاشف34 لكل بئر وقياس امتصاص في 595 نانومتر (595) في قارئ لوحة (انظر الجدول للمواد).
  4. حساب كمية البروتين في كل بئر بالمقارنة إلى المنحنى المعياري جيش صرب البوسنة، باستخدام الصيغة y = mx + b، حيث y هو595x ميكروغرام لجيش صرب البوسنة، m هو منحدر المنحنى المعياري وب هو التقاطع y للمنحنى المعياري. قم بضرب القيمة الناتجة عن 0.05 لتحديد مجموع ملغ من البروتين في كل عينة.

4-استخراج وميلامين متعدد الفوسفات.

  1. إضافة 250 ميليلتر من الإيثانول 95% لكل عينة تفكيك جتك ودوامه المزيج.
  2. تطبيق هذا الخليط على السليكا غشاء عمود الدوران وجهاز الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 16,100 س ز.
  3. تجاهل في التدفق من خلال، ثم إضافة 750 ميليلتر من 5 مم تريس-HCl (درجة الحموضة 7.5)، 50 مم كلوريد الصوديوم، 5 مم يدتا، الإيثانول 50% وجهاز الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 16,100 س ز.
  4. تجاهل من خلال التدفق والطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 16,100 س ز.
  5. وضع العمود في أنبوب [ميكروفوج] مل 1.5 نظيفة وإضافة 150 ميليلتر من 50 مم تريس-HCl (pH 8).
  6. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق، ثم الوتي سليلة من سينتريفوجينج لمدة 2 دقيقة في 8,000 س ز.
    ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، الواتس يمكن تخزين في-20 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد على الأقل.

5-هضم وميلامين متعدد الفوسفات.

  1. إعداد المعايير التي تحتوي على 0, 5, 50 أو 200 ميكرومتر البوتاسيوم الفوسفات في 50 ملم تريس-HCl (pH 8).
    ملاحظة: المعايير فوسفات البوتاسيوم يمكن تخزينها إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة.
  2. الكوة ميليلتر 100 لكل معيار الفوسفات واستخراج عينات سليلة في آبار منفصلة من لوحة واضحة 96-جيدا.
  3. إعداد تحتوي على مزيج الرئيسي (لكل عينة): 30 ميليلتر من 5 x ScPPX رد فعل المخزن المؤقت (100 ملم تريس-HCl، 25 مم مجكل2، خلات الأمونيوم 250 ملم، ودرجة الحموضة 7.5)13و 19 ميليلتر من ح2س 1 ميليلتر من سكبكس المنقي (1 mg مل-1).
  4. إضافة 50 ميليلتر من مزيج الرئيسي لكل بئر من لوحة 96-جيدا. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، سليلة هضم العينات التي يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.

6-الكشف عن الفوسفات الحرة24

  1. إعداد الكشف عن الحل الأساسي بإذابة 0.185 ز من الأنتيمون طرطرات البوتاسيوم في 200 مل الماء، إضافة 150 مل "ح ن" 42حتى4، ثم إضافة 1.49 g موليبدات أمونيوم. يحرك بحل وإحضار ثم إلى وحدة تخزين نهائي لمل 456. تصفية الحل لإزالة الجسيمات وتخزين محمية من الضوء عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  2. إعداد حل أسهم من حمض الأسكوربيك 1 متر. مخزن محمية من الضوء عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
  3. إعداد مخزون عمل جديدة للكشف عن حل كل يوم بخلط 9.12 مل من محلول الكشف عن قاعدة مع 0.88 مل حمض الأسكوربيك 1 متر. السماح بالكشف عن الحل للتوصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال.
  4. إضافة 50 ميليلتر من الكشف عن الحل لكل نموذج ومعيار في لوحة 96-جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لحوالي 2 دقيقة للسماح بوضع اللون.
  5. قياس امتصاص في 882 شمال البحر الأبيض المتوسط مع قارئ لوحة وحساب تركيز الفوسفات لكل عينة بالمقارنة إلى المنحنى القياسي فوسفات البوتاسيوم.
    تنبيه: الكشف عن الحل الذي يحتوي على الأملاح السامة والأحماض القوية. ارتداء القفازات وعلاج حل الزائدة كنفايات سامة.

7-حساب محتوى وميلامين متعدد الفوسفات الخلوية

  1. تحويل تركيزات الفوسفات تحديده في الخطوة 6، 5 إلى نانوموليس المستمدة من سليلة الفوسفات في كل الخلية بأكملها ليساتي وفقا للصيغة التالية:
    سليلة نمول = 1.5 x (الفوسفات ميكرومتر/10)
    ملاحظة: يحدد الأسلوب القائم على المنحنى القياسي في الخطوة 6 تركيز الفوسفات (في ميكرومتر) في كل عينة سليلة ميليلتر 100 اليكووتيد في الخطوة 5، 2. لتحويل هذا التركيز إلى عدد من نمول، ينقسم 100 ميليلتر من 106 لإعطاء وحدة تخزين في لام، مضروبة في التركيز (µmol ل-1)، ثم مضروبة 1,000 (عدد نمول في µmol). وهذا يقلل إلى قسمة التركيز 10. حجم استخراج مجموع إعدادها في الخطوة 4 هو 150 ميليلتر، ولذلك من الضروري أن تتضاعف القيمة الناتجة من 1.5 حساب نمول الفوسفات في استخراج كامل.
  2. تطبيع المحتوى سليلة الخلوية لمجموع البروتين الخلوي بقسمة سليلة نمول ملغ إجمالي البروتين في عينة كل تحديد في الخطوة 3، 4. يتم التعبير عن مستويات سليلة من حيث تركيز الفوسفات الحرة الفردية سليلة-مشتقة.
    ملاحظة: في بعض الحالات، قد تقع كمية الفوسفات المستمدة من سليلة موجودة في عينة خارج النطاق الخطي للمنحنى المعياري الفوسفات (الخطوة 6، 5). إذا كانت مستويات سليلة عالية جداً، يمكن أن تضعف 01:10 أو 1: 100، حسب الاقتضاء، النذرة المحتوية على سليلة الزائدة من الخطوة 4، 6 وثم يقاس مرة أخرى كما هو موضح في الخطوات من 5 إلى 7.

النتائج

الخطوات الرئيسية للبروتوكول هي تخطيطي في شكل مبسط في الشكل 1.

للتدليل على استخدام هذا البروتوكول مع بكتيريا سلبية الغرام، البرية من نوع كولاي MG165539 قد ازدادت إلى سجل منتصف المرحلة المتوسطة الغنية رطل في 37...

Discussion

البروتوكول هو موضح هنا يبسط ويسرع الكمي لمستويات سليلة في البكتيريا المتنوعة، مع مجموعة نموذجية من عينات 24 أخذ حوالي 1.5 ح الكامل عملية. هذا يسمح بالفحص السريع للعينات وتحليل لمكتبات متحولة، ويبسط الحركية تجارب قياس تراكم سليلة على مر الزمن. لقد أظهرنا أن البروتوكول يعمل بشكل فعال على ممثل...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

وأيد هذا المشروع جامعة ألاباما في "برمنغهام قسم الأحياء المجهرية" أموال بدء التشغيل والمعاهد الوطنية للصحة منحة R35GM124590 (MJG)، والمعاهد الوطنية للصحة منحة R01AI121364 (مهاجم).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
E. coli BL21(DE3)Millipore Sigma69450
plasmid pScPPX2Addgene112877available to academic and other non-profit institutions
LB brothFisher ScientificBP1427-2E. coli growth medium
ampicillinFisher ScientificBP176025
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Gold BiotechnologyI2481C
HEPES bufferGold BiotechnologyH-400-1
potassium hydroxide (KOH)Fisher ScientificP250500for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions
sodium chloride (NaCl)Fisher ScientificS27110
imidazoleFisher ScientificO3196500
lysozymeFisher ScientificAAJ6070106
magnesium chloride (MgCl2)Fisher ScientificBP214-500
Pierce Universal NucleaseFisher ScientificPI88700Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute
Model 120 Sonic DismembratorFisher ScientificFB-120other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective
5 mL HiTrap chelating HP columnGE Life Sciences17040901any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted
nickel(II) sulfate hexahydrateFisher ScientificAC415611000for charging HiTrap column
0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filtersFisher Scientific09-302-168
Bradford reagentBio-Rad5000205
Tris bufferFisher ScientificBP1525
Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCOFisher Scientific08-667Bother dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work
hydrochloric acid (HCl)Fisher ScientificA144-212for adjusting the pH of Tris-buffered solutions
potassium chloride (KCl)Fisher ScientificP217500
glycerolFisher ScientificBP2294
10x MOPS medium mixtureTeknovaM2101E. coli growth medium
glucoseFisher ScientificD161
monobasic potassium phosphate (KH2PO4)Fisher ScientificBP362-500
dibasic potassium phosphate (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-500
dehydrated yeast extractFisher ScientificDF0886-17-0
tryptoneFisher ScientificBP1421-500
magnesium sulfate heptahydrateFisher ScientificM63-50
manganese sulfate monohydrateFisher ScientificM113-500
guanidine isothiocyanateFisher ScientificBP221-250
bovine serum albumin (protease-free)Fisher ScientificBP9703100
clear flat bottom 96-well platesSigma-AldrichM0812-100EAany clear 96-well plate will work
Tecan M1000 Infinite plate readerTecan, Inc.not applicableany plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work
ethanolFisher Scientific04-355-451
silica membrane spin columnsEpoch Life Science1910-050/250
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Fisher ScientificBP120500
1.5 mL microfuge tubesFisher ScientificNC9580154
ammonium acetateFisher ScientificA637-500
antimony potassium tartrateFisher ScientificAAA1088922
4 N sulfuric acid (H2SO4)Fisher ScientificSA818-500
ammonium heptamolybdateFisher ScientificAAA1376630
ascorbic acidFisher ScientificAC401471000

References

  1. Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
  2. Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate--an ancient energy source and active metabolic regulator. Microbial Cell Factories. 10, 63 (2011).
  3. Kornberg, A., Rao, N. N., Ault-Riche, D. Inorganic polyphosphate: a molecule of many functions. Annual Review of Biochemistry. 68, 89-125 (1999).
  4. Albi, T., Serrano, A. Inorganic polyphosphate in the microbial world. Emerging roles for a multifaceted biopolymer. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 32 (2), 27 (2016).
  5. Gray, M. J., Jakob, U. Oxidative stress protection by polyphosphate--new roles for an old player. Current Opinion in Microbiology. 24, 1-6 (2015).
  6. Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
  7. Racki, L. R., et al. Polyphosphate granule biogenesis is temporally and functionally tied to cell cycle exit during starvation in Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2440-E2449 (2017).
  8. Rashid, M. H., et al. Polyphosphate kinase is essential for biofilm development, quorum sensing, and virulence of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (17), 9636-9641 (2000).
  9. Candon, H. L., Allan, B. J., Fraley, C. D., Gaynor, E. C. Polyphosphate kinase 1 is a pathogenesis determinant in Campylobacter jejuni. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8099-8108 (2007).
  10. Richards, M. I., Michell, S. L., Oyston, P. C. An intracellularly inducible gene involved in virulence and polyphosphate production in Francisella. Journal of Medical Microbiology. 57 (Pt 10), 1183-1192 (2008).
  11. Singh, R., et al. Polyphosphate deficiency in Mycobacterium tuberculosis is associated with enhanced drug susceptibility and impaired growth in guinea pigs. Journal of Bacteriology. 195 (12), 2839-2851 (2013).
  12. Bru, S., Jimenez, J., Canadell, D., Arino, J., Clotet, J. Improvement of biochemical methods of polyP quantification. Microbial Cell. 4 (1), 6-15 (2016).
  13. Wurst, H., Kornberg, A. A soluble exopolyphosphatase of Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization. Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 10996-11001 (1994).
  14. Ault-Riche, D., Fraley, C. D., Tzeng, C. M., Kornberg, A. Novel assay reveals multiple pathways regulating stress-induced accumulations of inorganic polyphosphate in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 180 (7), 1841-1847 (1998).
  15. Lee, W. D., et al. Simple Silica Column-Based Method to Quantify Inorganic Polyphosphates in Cartilage and Other Tissues. Cartilage. , (2017).
  16. Martin, P., Van Mooy, B. A. Fluorometric quantification of polyphosphate in environmental plankton samples: extraction protocols, matrix effects, and nucleic acid interference. Applied and Environmental Microbiology. 79 (1), 273-281 (2013).
  17. Cremers, C. M., et al. Polyphosphate: A Conserved Modifier of Amyloidogenic Processes. Molecular Cell. 63 (5), 768-780 (2016).
  18. Dahl, J. U., et al. The anti-inflammatory drug mesalamine targets bacterial polyphosphate accumulation. Nature Microbiology. 2, 16267 (2017).
  19. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 2. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , 15-35 (2004).
  20. Werner, T. P., Amrhein, N., Freimoser, F. M. Novel method for the quantification of inorganic polyphosphate (iPoP) in Saccharomyces cerevisiae shows dependence of iPoP content on the growth phase. Archives of Microbiology. 184 (2), 129-136 (2005).
  21. Aschar-Sobbi, R., et al. High sensitivity, quantitative measurements of polyphosphate using a new DAPI-based approach. Journal of Fluorescence. 18 (5), 859-866 (2008).
  22. Kulakova, A. N., et al. Direct quantification of inorganic polyphosphate in microbial cells using 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Environmental Science and Technology. 45 (18), 7799-7803 (2011).
  23. Kolozsvari, B., Parisi, F., Saiardi, A. Inositol phosphates induce DAPI fluorescence shift. Biochemical Journal. 460 (3), 377-385 (2014).
  24. Christ, J. J., Blank, L. M. Enzymatic quantification and length determination of polyphosphate down to a chain length of two. Analytical Biochemistry. 548, 82-90 (2018).
  25. Ahn, K., Kornberg, A. Polyphosphate kinase from Escherichia coli. Purification and demonstration of a phosphoenzyme intermediate. Journal of Biological Chemistry. 265 (20), 11734-11739 (1990).
  26. Zhu, Y., Lee, S. S., Xu, W. Crystallization and characterization of polyphosphate kinase from Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 997-1001 (2003).
  27. Smith, S. A., Morrissey, J. H. Sensitive fluorescence detection of polyphosphate in polyacrylamide gels using 4',6-diamidino-2-phenylindol. Electrophoresis. 28 (19), 3461-3465 (2007).
  28. Livermore, T. M., Chubb, J. R., Saiardi, A. Developmental accumulation of inorganic polyphosphate affects germination and energetic metabolism in Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (4), 996-1001 (2016).
  29. Rudat, A. K., Pokhrel, A., Green, T. J., Gray, M. J. Mutations in Escherichia coli Polyphosphate Kinase That Lead to Dramatically Increased In Vivo Polyphosphate Levels. Journal of Bacteriology. 200 (6), e00697-e00617 (2018).
  30. Smith, S. A., Wang, Y., Morrissey, J. H. DNA ladders can be used to size polyphosphate resolved by polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. , (2018).
  31. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  32. JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. , (2018).
  33. JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , (2018).
  34. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  35. JoVE Science Education Database. . Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , (2018).
  36. Mu, Q., Tavella, V. J., Luo, X. M. Role of Lactobacillus reuteri in Human Health and Diseases. Frontiers in Microbiology. 9, 757 (2018).
  37. Alcantara, C., Blasco, A., Zuniga, M., Monedero, V. Accumulation of polyphosphate in Lactobacillus spp. and its involvement in stress resistance. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1650-1659 (2014).
  38. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 1. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , 3-13 (2004).
  39. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  40. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  41. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein. Journal of Biological Chemistry. 267 (31), 22556-22561 (1992).
  42. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. An exopolyphosphatase of Escherichia coli. The enzyme and its ppx gene in a polyphosphate operon. Journal of Biological Chemistry. 268 (1), 633-639 (1993).
  43. Rao, N. N., Liu, S., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate in Escherichia coli: the phosphate regulon and the stringent response. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2186-2193 (1998).
  44. van Pijkeren, J. P., Britton, R. A. High efficiency recombineering in lactic acid bacteria. Nucleic Acids Research. 40 (10), e76 (2012).
  45. Zhang, H., Ishige, K., Kornberg, A. A polyphosphate kinase (PPK2) widely conserved in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16678-16683 (2002).
  46. Sander, P., Meier, A., Bottger, E. C. rpsL+: a dominant selectable marker for gene replacement in mycobacteria. Molecular Microbiology. 16 (5), 991-1000 (1995).
  47. Hartman, S., Bont, J. A. M. D., Balows, A. . The Prokaryotes, a handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, application. , 1215-1237 (1992).
  48. Winder, F. G., Denneny, J. M. The metabolism of inorganic polyphosphate in mycobacteria. Journal of General Microbiology. 17 (3), 573-585 (1957).
  49. Jankute, M., Cox, J. A., Harrison, J., Besra, G. S. Assembly of the Mycobacterial Cell Wall. Annual Review of Microbiology. 69, 405-423 (2015).
  50. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  51. Cogan, E. B., Birrell, G. B., Griffith, O. H. A robotics-based automated assay for inorganic and organic phosphates. Analalytical Biochemistry. 271 (1), 29-35 (1999).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143 mycobacteria

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved