الامتصاص من جديد جسيمات نانوية المغلفة بالدهون التي تحتوي على فالكارينديول بالخلايا الجذعية البشرية الوسيطة

Summary

توضح هذه المقالة تغليف فالكارينديول في المغلفة بالدهن 74 نانومتر جسيمات نانوية. ويرصد على الإقبال جسيمات نانوية من الخلايا الجذعية البشرية إلى قطيرات الدهن الخلوية التصوير الفلورسنت و [كنفوكل]. جسيمات نانوية ملفقة بطريقة الحقن السريع للمذيبات التحول، ويقاس حجمها مع تقنية تشتت الضوء الحيوي.

Abstract

جسيمات نانوية هي محط اهتمام متزايد في أنظمة توصيل العقاقير لعلاج السرطان. جسيمات نانوية المغلفة بالدهن هي مستوحاة في هيكل وحجم من البروتينات الدهنية low-density (LDLs) لأن الخلايا السرطانية بحاجة متزايدة الكولسترول آخذة في الانتشار، وهذا تم استغلاله كآلية لإيصال الأدوية السرطان بالسرطان الخلايا. وعلاوة على ذلك، تبعاً لكيمياء العقاقير، تغليف المخدرات يمكن أن تكون مفيدة لتجنب تدهور للمخدرات خلال الدورة الدموية المجراة. ولذلك، في هذه الدراسة، يستخدم هذا التصميم اختﻻق جسيمات نانوية المغلفة بالدهن من فالكارينديول المخدرات السرطان، توفير نظام التسليم جديدة محتملة فالكارينديول من أجل استقرار هيكلها الكيميائية ضد التدهور وتحسين به الامتصاص بالأورام. جسيمات نانوية فالكارينديول، مع أحادي الطبقة فسفوليبيد والكولسترول، تغليف المخدرات المنقي جوهر الجسيمات، وقد صممت. يتكون الطلاء أحادي الطبقة الدهنية 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (دسبك)، ونسبة الكولسترول في الدم (شول) و 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (دسب شماعة 2000) جنبا إلى جنب مع فلوري التسمية دي (نسب المولى من 43:50:5:2). ملفقة جسيمات نانوية استخدام أسلوب الحقن السريع، وتقنية سريعة وبسيطة يعجل جسيمات نانوية بواسطة مذيب جيد للمذيبات المضادة تبادل. وهو يتألف من حقنه السريع محلول الإيثانول التي تحتوي على مكونات نانوحبيبات إلى مرحلة مائي. ويقاس حجم جسيمات نانوية الفلورية استخدام تشتت الضوء الحيوي (DLS) في شمال البحر الأبيض المتوسط ± 6.7 74.1. يتم اختبار الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة (همسكس) على الإقبال جسيمات نانوية وتصويرها باستخدام الأسفار والفحص المجهري [كنفوكل]. ويلاحظ على الإقبال جسيمات نانوية في همسكس، مما يوحي باحتمال هذه المخدرات مستقر نظام توصيل فالكارينديول.

Introduction

جسيمات نانوية المغلفة بدهن نشهد اهتماما متزايداً فيما يتعلق بوظيفتها كنظم إيصال العقاقير ل علاج السرطان¹. السرطان قد غيرت إعادة برمجة دهن الأيض² وازدياد حاجة الكولسترول تنتشر³. أوفيريكسبريس LDLs¹ ، وتأخذ في LDLs أكثر من الخلايا الطبيعية، بقدر ما عد LDL مريض السرطان يمكن أن تنخفض حتى⁴. ويعزز امتصاص LDL تعمل العدوانية⁵ مما أدى إلى انتشار وغزو في سرطان الثدي⁶. وفرة مستقبلات LDL (لدلرس) مؤشر تنبؤاتها المحتملة النقيلي⁷. مستوحاة من LDL وفي امتصاص الخلايا السرطانية، تم وضع استراتيجية جديدة تسمى: جعل المخدرات تبدو مثل الأغذية السرطان⁸. وهكذا، هذه نانوحبيبات المخدرات تسليم التصاميم الجديدة^8،،من⁹¹⁰ ولقد استلهمت التصميم الأساسية والدهن استقرت LDLs الطبيعية¹¹ كآلية لإيصال الأدوية السرطان للخلايا السرطانية. وتؤيد هذا السلبي استهداف نظام التسليم تغليف، لا سيما، المخدرات مسعور، والتي ترد عادة في شكل الجرعة الفموية ولكن توفر فقط كمية صغيرة من المخدرات إلى مجرى الدم، حتى تحد من فعالية المتوقعة على¹². كما مع الشبح الدهنية¹³، طلاء البولي إثيلين غليكول (شماعة) يساعد على تقليل أي استجابة مناعية ويمتد التداول في مجرى الدم لامتصاص الورم الأمثل بالمفترض تعزيز تخلل وأثر الاحتفاظ (EPR) ^{14 , 15}-ومع ذلك، بالإضافة إلى في بعض الحالات، وعدم الاستقرار في التداول والتوزيع غير المرغوب فيها في نظام¹⁶، بعض العقبات التي تظل دون حل، مثل كيف وإلى أي مدى هذه الجسيمات النانوية هي اتخذتها الخلايا، وما هو مصيرهم داخل الخلايا. ومن هنا أن تتناول هذه الورقة استيعاب نانوحبيبات خاصة المخدرات السرطان مسعور فالكارينديول واستخدام [كنفوكل] وتقنيات التصوير ابيفلوريسسينسي.

الهدف من هذه الدراسة هو اختﻻق جسيمات نانوية المغلفة بالدهن من فالكارينديول ودراسة عن امتصاص داخل الخلايا في همسكس. وبالتالي، يحتمل أن استقرار إدارته، والتغلب على التحديات المرتبطة بإيصال وتحسين التوافر الأحيائي. ومن ثم تقييم نظام توصيل جديد لهذه المخدرات السرطان. سابقا، فالكارينديول قد تم تدار شفويا عن طريق فالكارينديول تركيز عال تنقيته ك تكملة أغذية¹⁷. ومع ذلك، هناك الحاجة إلى اتباع نهج أكثر تنظيماً لتقديم هذا الدواء تبشر بالخير. لذلك، صممت جسيمات نانوية فالكارينديول، مع فسفوليبيد وتغليف أحادي الطبقة مع تنقية المخدرات التي تشكل جوهر الجسيمات، نسبة الكولسترول في الدم. أسلوب الحقن السريع للمذيبات التحول، وضعتها مؤخرا نيدام et al. ⁸، يستخدم في هذه الدراسة لتغليف فالكارينديول بولياسيتيليني.

الأسلوب قد استخدمت سابقا لتصنيع جسيمات نانوية الدهن لتغليف^18،وكلاء التصوير التشخيصي¹⁹، فضلا عن اختبار جزيئات (تريولين)²⁷ والمخدرات (orlistat، ستيرات niclosamide)^{8 ،،}من²⁷²⁸. وأسلوب بسيط نسبيا عندما تنفذ بالجزيئات الصحيحة. أشكال الجسيمات نانوسيزيد، في حدود على التنو الحرجة (~ 20 نانومتر القطر)، غير قابلة للذوبان العالية الذوائب مسعور المذابة في المذيبات قطبية. يتم إنجاز تبادل المذيبات بحقنه سريع للحل الأساسي في وجود فائض أنتيسولفينت (عادة، مرحلة مائي في عضوية 1:9: نسبة حجم مائي)^20،21.

تصميم التركيبية جسيمات نانوية تؤدي إلى مزايا متعددة. توفر مكونات DSPC:Chol أحادي الطبقة جداً ضيق وتقريبا كتيمة ومتوافق حيويا والقابلة للتحلل. شماعة يوفر واجهة ستيريكالي استقرار الذي يعمل كدرع من أوبسونيزاتيون بالنظام المناعي، وإبطاء امتصاص أي نظام شبكي (الكبد والطحال) وحماية ضد النظام بلعمية وحيدات النوى، ومنع ما استبقاء وتدهور بنظام المناعة، ومن ثم زيادة تداولها نصف الوقت في الدم²². وهذا يسمح للجزيئات أن يعمم حتى أنهم اكسترافاساتي في مواقع المريضة، مثل الأورام، وحيث أن نظام الأوعية الدموية راشح، السماح للجيش الثوري الشعبي-تأثير أن تؤدي إلى تراكم سلبي للجسيمات. بالإضافة إلى ذلك، يسمح معطف الدهن واحد لتحسين السيطرة على حجم جسيمات نانوية بمحاصرة كينيتيكالي الأساسية في^27،البعد نواة الحرجة في²⁸. حمل الدهون الخصائص السطحية المختلفة (بما في ذلك الببتيد الاستهداف، التي لم تكن متاحة لهذا المشروع) ونواة المخدرات نقية و^27،22،بوليديسبيرسيتي انخفاض²⁸. الطريقة المستخدمة لتحليل حجم الجسيمات من دائرة الأراضي والمساحة، أسلوب الذي يسمح للباحثين لقياس حجم عدد كبير من الجسيمات في نفس الوقت. ومع ذلك، هذا الأسلوب يمكن التحيز القياسات لأحجام أكبر، إذا لم تكن جسيمات نانوية مونوديسبيرسيد²³. ويتم تقييم هذه المسألة مع معطف الدهن كذلك. تعطي مزيدا من التفاصيل عن هذه التصاميم الأساسية والتحديد الكمي لكل الخصائص في سائر المنشورات^27،28.

المخدرات مغلفة بجسيمات نانوية فالكارينديول، polyacetylene غذائية الموجودة في النباتات من عائلة خيمية. وهو المستقلب ثانوية من نوع بولياسيتيلينيس₁₇ج الاليفاتيه التي تم العثور عليها لعرض آثار تعزيز الصحة، بما في ذلك الأنشطة المضادة للالتهابات والآثار المضادة للبكتيريا سيتوتوكسيسيتي ضد طائفة واسعة من خطوط خلايا السرطان. تفاعلية عالية تتصل بقدرتها على التفاعل مع الجزيئات الحيوية المختلفة، بوصفها عامل الكيلاتينج جداً من رد الفعل ضد ميركاتو والمجموعات الأمينية²⁴. فالكارينديول سابقا قد ثبت للحد من عدد الآفات الورمية في القولون^17،25، على الرغم من أن الآليات البيولوجية التي لا تزال غير معروفة. بيد أن من يعتقد أن يتفاعل مع الجزيئات الحيوية مثل NF-κB، COX1، كوكس-2، ونشدد على السيتوكينات، التي تحول دون ورم الخلية وتطور انتشار عملياتها، مما أدى إلى اعتقال خلية دورة، هيولى (ER)، والمبرمج ^17،26 في الخلايا السرطانية. ويستخدم فالكارينديول في هذه الدراسة كما مثال المخدرات السرطان بسبب إمكاناتها السرطان وآلية هي قيد الدراسة حاليا، ونظرا لأنه يظهر آثار السرطان واعدة. يتم اختبار في همسكس على الإقبال جسيمات نانوية الهاتف الخلوي وتصويرها باستخدام ابيفلوريسسينسي والفحص المجهري [كنفوكل]. واختير هذا النوع الخلية بسبب كبر حجمها، يجعلها مثالية للفحص المجهري.

Protocol

1-نانوحبيبات التوليف بالمذيبات السريعة التحول تقنية

1. قم بإعداد الإجراءات التالية لإعداد جسيمات نانوية: مركز سخان/عينة كتلة، مجفف، الاستغناء عن نظام رقمي مع حقنه زجاجية 1 مل، قنينة زجاج 12 مل، محرض مغناطيسي، برغوث مغناطيسي (15 ملم × 4.5 ملم، في شكل أسطواني مع طلاء تترافلوروايثيلين [PTFE]) داخل القنينة الزجاجية، ومبخر الدنمارك.
2. الاستغناء عن 2.4 مل من 250 ميكرون فالكارينديول الأسهم حله في 70% EtOH المياه الخليط في قنينة التﻷلؤ.
3. تتبخر الكسر السائل، استخدام مركزات عينة لما يقرب من 4 ح، للحصول على فالكارينديول الجافة.
   1. إدراج القنينة التﻷلؤ في سخان كتلة؛ يسلم مركزات عينة الغاز على العينة باستخدام الإبر الفولاذ المقاوم للصدأ، والتركيز العينة. تتبخر في درجة حرارة الغرفة؛ يجب عدم استخدام الحرارة.
4. مرة واحدة المجففة، أضف المكونات التالية للطلاء الدهني في القنينة التﻷلؤ المذكورة أعلاه: ميليلتر 16.3 مم 31.64 دسبك كلوروفورم حل الأسهم، ميليلتر 3.4 ملم 17.82 دسب شماعة 2000 كلوروفورم حل الأسهم، 24 ميليلتر من الأسهم كلوروفورم الكوليسترول 25 مم الحل، وميليلتر 6 من 4 مم دي كلوروفورم حل الأسهم. تنظيف المحاقن مع كلوروفورم بعد إضافة كل مكون لتجنب التلوث المتبادل.
   تنبيه: إغلاق فورا قارورة تحتوي على الدهون حيث أن المذيب لا تتبخر و، وبالتالي تعديل التركيز. ويعمل في غطاء دخان.
   ملاحظة: تركيزات كلوروفورم حلول الأسهم يمكن أن تختلف، تبعاً للمورد الكيميائية أو تخفيف في المختبر.
5. لف القنينة مع رقائق الألومنيوم لحماية دي من الضوء. اترك العينة بين عشية وضحاها في مجففة تتبخر في كلوروفورم.
6. إذابة العينة يهتمان في الإيثانول المطلق لوحدة تخزين نهائي 1.2 مل، الذي يعطي تركيزات النهائي دسبك دسب شماعة 2000، نسبة الكولسترول في الدم ودي من 0.43، 0.05 مم، 0.5 مم، و 0.02 ملم، على التوالي. ويمثل هذا الحل في المرحلة العضوية.
7. تأخذ قنينة زجاج 12 مل وملء مع 9 مل مياه النقية، وإضافة البرغوث المغناطيسي إلى القنينة التي تحتوي على 9 مل من الماء. تبقى القنينة على محرض المغناطيسي، إثارة 500 لفة في الدقيقة (الشكل 1).
8. إرفاق المحاقن الزجاجية 1 مل إلى الاستغناء عن النظام وتنظيفه مع كلوروفورم لتجنب أي تلوث. وهذا، بسحب كلوروفورم في محقن الزجاج ببطء والاستغناء عن يدوياً إلى تيمز جامع نفايات على الأقل 10.
   تنبيه: يجب أن يكون ذلك تحت غطاء دخان.
9. رئيس الوزراء المحاقن مع الإيثانول. فتيلة يستبدل المذيب القديمة، فضلا عن إزالة أي فقاعات الهواء.
   تنبيه: يجب أن يكون ذلك تحت غطاء دخان.
10. استخدام المحاقن، نضح 1 مل المرحلة العضوية.
11. إدراج المحاقن في القنينة الزجاج، حتى منتصف مائية مل 9، والحفاظ على ثابت في منتصف القنينة (كما هو موضح في الشكل 1).
12. حقن الحل بسرعة المحدد لحقن (833 ميليلتر/s) بالضغط على زر dispense على الاستغناء عن النظام (الشكل 2). يقوم هذا بإنشاء 10 مل من 50 ميكرومتر المغلفة بدهن جسيمات نانوية من فالكارينديول في المياه التي تحتوي على الإيثانول 10%.
    ملاحظة: تم العثور على هذه السرعة حقن تحقيقا للجسيمات أرقى، الحصول على توزيع حجم جسيمات ضيقة. من المهم التأكد من المحاقن في مركز وثابت، ومباشرة عند الاستغناء عن الحل.
13. فورا بعد الحقن، إزالة القنينة من محرض ونقل العينة قارورة مستديرة قاع 50 مل (المصرف).
14. إرفاق المصرف مبخر دوراني وتتبخر 1 مل المذيبات العضوية، باستخدام مبخر دوراني في درجة حرارة الغرفة. تجنب تشكيل فقاعة الزائدة.
    ملاحظة: سيتم اتخاذ هذه الخطوة ~ 5 دقيقة.
15. نقل تعليق نانوحبيبات من المصرف إلى آخر قنينة زجاج 12 مل. تأكد من أن وحدة التخزين مل 9. تقسيم العينة في قارورة زجاج 12 مل اثنين (وضع 4.5 مل في كل منهما).
16. إضافة 0.5 مل من الماء عالي النقاوة إلى واحدة من القنينات و 0.5 مل من 10 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) إلى القنينة الأخرى. إخراج 1 مل لكل عينة لقياس حجم الجسيمات.

2-تحليل حجم الجسيمات باستخدام تقنية DLS

ملاحظة: أجريت قياسات الحجم باستخدام محلل DLS الذي يحدد توزيع حجم الجسيمات. وهي مجهزة بليزر 100 ميغاواط التي تعمل في موجه 662.2 شمال البحر الأبيض المتوسط ومع كاشف الضوئي الانهيار جليدي وضعها بزاوية 90 درجة لزاوية الحادث. الشعاع متناثرة جسيمات نانوية والكشف عنها بواسطة فوتوديتيكتور.

1. قم بتشغيل الأداة DLS وضبط درجة الحرارة المطلوبة عند 20 درجة مئوية، إلى حين أن يستقر.
2. تعيين معلمات الصك كما يلي: وقت اقتناء البيانات = 4 s، وعدد من المقتنيات = 30، الدالة التلقائي-التوهين =، والحدود الزمنية السيارات-التوهين = 0.
3. ملء ومبومو البلاستيك مع 1 مل تعليق نانوحبيبات وبدء القياس.
4. تقرير حجم يقاس تبعاً للمذيبات المستخدمة (الماء أو برنامج تلفزيوني).
   ملاحظة: اعتماد القياس في برنامج تلفزيوني أن فكرة تقريبية عن حجم الخلايا في المتوسط عند علاج الخلايا. وسوف يتم معالجة الخلية مع جسيمات نانوية المذابة في الماء.
5. تكرار القياسات 24 ساعة بعد التوليف، للتحقق من تجميع الجسيمات.

3-خلية العلاج

1. ينمو همسكس في المتوسط الأساسية الدنيا (MEM) تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين/ستربتوميسين، 1% في دائرة هوميفيد في 37 درجة مئوية مع 5% CO₂.
   تنبيه: العمل في "هود الاندفاق الصفحي" العقيمة للخطوات 3.1 و 3.2 و 3.3.
2. وضع البذور حوالي 50,000 الخلايا للحصول على كثافة خلية حوالي 30 في المائة في السابق المطلق-EtOH-تعقيم كوفيرسليبس #1.5 في لوحات 6-جيدا. إضافة ذاكرة كي يكون وحدة تخزين نهائي 3 مل في كل بئر. احتضانها ح 24 بالشروط نفسها كما في الخطوة 3، 1. بذور الخلايا 24 ساعة قبل العلاج.
   ملاحظة: من الأهمية بمكان الخلايا هي المصنفة على الأقل 24 ساعة قبل العلاج نانوحبيبات، التأكد من أن الخلايا في التقاء كافية.
3. دون إزالة المتوسطة، إضافة 3 ميليلتر من الحل نانوحبيبات، لتركيز فالكارينديول نهائي من 5 ميكرومتر. إينكوباتي على 24 ساعة في الظروف نفسها كما في الخطوة 3، 1.
   ملاحظة: أجريت إعداد جسيمات نانوية اليوم لعلاج الخلية، لتجنب تراكم الجسيمات.
4. وفي وقت لاحق، بعد 24 ساعة علاج، تغسل الخلايا 2 x مع برنامج تلفزيوني، إصلاحها في 4% فورمالدهايد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتخزينها في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لتصل إلى عدة أشهر حتى تصويرها.
   تنبيه: يجب أن يكون ذلك تحت غطاء دخان.
   1. وبدلاً من ذلك، بعد التثبيت، 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) تلطيخ النووية يمكن أن يؤديها. لذلك، بعد تحديد الخلايا، بيرميبيليزي لهم مع 0.1% X-100 تريتون لمدة 30 دقيقة، غسلها x 2 مع برنامج تلفزيوني، ووصمة عار لهم مع 250 ميليلتر من 300 نانومتر DAPI لمدة 5 دقائق، محمية من الضوء.

4-الفحص المجهري

1. مجهر الأسفار
   1. استخدام مجهر الأسفار ويديفيلد مجهزة بكاميرا CCD ضرب إلكترون للحصول على الصور. استخدام 150 × 1.45 غ النفط الهدف والقناة LP التجارة والنقل.
2. مجهر [كنفوكل]
   1. الحصول على صور مجهرية [كنفوكل]، باستخدام 63 × 1.4 غ النفط الهدف، ليزر أرجون (514 nm) دي، وليزر اثنين-فوتون (780 نانومتر) ل DAPI، للتأكد من الأخذ جسيمات نانوية داخل الخلايا.

النتائج

وكانت نوعين مختلفين من جسيمات نانوية جسيمات نانوية فالكارينديول ملفقة، إلا وهي نقية وجسيمات نانوية فالكارينديول المغلفة بالدهن. تم اختبار تركيزات مختلفة من الدهون والكوليسترول في الدم. كما هو مبين في الجدول 1، جسيمات نانوية غير المصقول تشكلت في المياه، ويقاس ف...

Discussion

بروتوكول مفصل لاختلاق جسيمات نانوية المغلفة بالدهن لإيصال الأدوية مع البسيطة، أسلوب الحقن السريع سريع واستنساخه، وقابلة التحول المذيبات كان يتبع^27،في الفترة من²⁸ ويرد في هذه الورقة، كما تطبيق فالكارينديول. التحكم في سرعة حقن المرحلة العضوية في المرحلة الم...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 mL Screw Neck Vial (Clear glass, 15-425 thread, 66 X 18.5 mm)	Microlab Aarhus A/S	ML 33154LP
6 well plates	Greiner Bio One International GmbH	657160
Absolute Ethanol	EMD Millipore (VWR)	EM8.18760.1000
Chloroform	Rathburn Chemicals Ltd.	RH1009
Cholesterol	Avanti Polar Lipids, Inc.	700000P
Confocal Microscope	Zeiss LSM510
Cover Slips thickness #1.5	Paul Marienfeld GmbH & Co	117650
Desiccator	Self-build
DiI	Invitrogen	D282
DLS	Beckman Coulter	DelsaMAXpro 3167-DMP
DSPC (Chloroform stock)	Avanti Polar Lipids, Inc.	850365C
DSPE PEG 2000 (Chloroform stock)	Avanti Polar Lipids, Inc.	880120C
eVol XR	SGE analytical science, Trajan Scientific Australia Pty Ltd.	2910200
Fetal Bovine serum	Gibco	10270-106
Fluorescence Miccroscope	Olymous IX81		With Manual TIRF and Andor iXon EMCCD
Incubator	Panasonic	MCO-18AC
Magnetic flea	VWR Chemicals	15 x 4.5 mm	Cylindrical shape with PTFE coating
Magnetic stirrer	IKA	RT-10
Minimum Essential Media	Gibco	32561-029
PBS tablets for cell culture	VWR Chemicals	97062-732
Pen/strep	VWR Chemicals	97063-708
Phosphate Buffer Saline (PBS, pH 7.4)	Thermo Fisher	10010031
Rotary Evaporator	Rotavapor, Büchi Labortechnik AG	R-210
Sample concentrator	Stuart, Cole-Parmer Instrument Company, LLC	SBHCONC/1