الحث المبرمج والكشف في الثقافة الاساسيه للخلايا المعوية الخيار البحر

Summary

هذا البروتوكول يوفر طريقه سهله للتعامل مع الثقافة الخلايا المعوية من خيار البحر ابوستيتشوكوس japonغاريس ومتوافق مع مجموعه متنوعة من العينات الانسجه المتاحة علي نطاق واسع من الكائنات البحرية بما في ذلك اشوداء الجلد ، الرخويات ، قشريات.

Abstract

وتستخدم الخلايا المستزرعة الاوليه في مجموعه متنوعة من التخصصات العلمية كاداات هامه للغاية للتقييم الوظيفي للمواد البيولوجية أو توصيف الانشطه البيولوجية المحددة. ومع ذلك ، ونظرا لعدم وجود وسائل الاعلام الثقافة الخلية المطبقة عالميا والبروتوكولات ، وصفا جيدا أساليب ثقافة الخلية للكائنات البحرية لا تزال محدوده. وفي الوقت نفسه ، فان التلوث الجرثومي والخواص المتعددة المدارات للخلايا لافقاريات البحرية التي تحدث بشكل شائع تعيق إنشاء استراتيجية فعاله لاستزراع الخلايا في لافقاريات البحرية. هنا ، ونحن وصف طريقه سهله التعامل لزراعه الخلايا المعوية من الخيار البحر ابوستيشووس جابونوكوس. بالاضافه إلى ذلك ، ونحن نقدم مثالا علي الحث في المختبر المبرمج والكشف في الخلايا المعوية المستزرعة الاوليه. وعلاوة علي ذلك ، توفر هذه التجربة تفاصيل حول أسلوب الثقافة المناسبة ومجموعه الخلايا. البروتوكول الموصوف متوافق مع مجموعه متنوعة من عينات الانسجه المتاحة علي نطاق واسع من الكائنات البحرية بما في ذلك الجلد الشحمي ، الرخويات ، قشريات ، ويمكن ان توفر خلايا كافيه للعديد من التطبيقات التجريبية في المختبر. ومن شان هذه التقنية ان تمكن الباحثين من التلاعب بكفاءة بثقافات الخلايا الاوليه من لافقاريات البحرية وتيسير التقييم الوظيفي للمواد البيولوجية المستهدفة علي الخلايا.

Introduction

وتوفر الخلايا المزروعة تحت ظروف خاضعه للسيطرة المصطنعة ، وليس في بيئتها الطبيعية ، مواد تجريبية موحده للدراسات البيولوجية ، وخاصه بالنسبة للأنواع التي لا يمكن زراعتها بسهوله في بيئة مختبريه. تمثل لافقاريات البحرية أكثر من 30% من جميع أنواع الماشية¹، وتوفر العديد من المواد البيولوجية لاجراء البحوث حول أليات التنظيمية لعمليات بيولوجية محدده ، مثل التجديد^2،3، الاستجابة للإجهاد⁴، والتكيف البيئي^5،6.

خيار البحر ، Apostichopus japonغاريكوس، هو واحد من الأنواع اشوديرم الأكثر دراسة التي تسكن المياه المعتدلة علي طول ساحل شمال المحيط الهادي. ومن المعروف جيدا باسم الأنواع الهامه تجاريا والمراسي علي نطاق واسع في شرق اسيا ، وخاصه في الصين⁷. العديد من الاسئله العلمية المتعلقة ب. japonغاريكوس، بما في ذلك أليات التنظيمية الكامنة وراء التجدد المعوي بعد أحشاء⁸ وانحطاط في استيميل⁹، والسيطرة الايضيه^10،11، واستجابه المناعي^12،13 تحت الضغوط الحرارية أو المسببة للامراض ، ومع ذلك ، بالمقارنة مع الحيوانية نموذج مدروسه جيدا ، والبحوث الاساسيه ، وخاصه علي المستوي الخلوي ، محدوده بالاختناقات التقنية ، مثل عدم وجود أساليب متقدمة ثقافة الخلية.

وقد كرس الباحثون الكثير من الجهد لإنشاء خطوط خلوية ، ولكنهم واجهوا أيضا العديد من التحديات ولم يتم إنشاء اي خط خلوي من اي لافقاريات بحري حتى الآن¹⁴. ومع ذلك ، فقد تقدمت ثقافات الخلايا الاوليه من لافقاريات البحرية في العقود الاخيره^15،16، وانها أتاحت فرصه لتجريب علي المستوي الخلوي. فعلي سبيل المثال ، استخدمت الخلايا المتجددة من ا. japonغاريكوس كمصدر للخلايا لثقافات الخلايا طويلة الأجل التي وفرت طريقه عمليه لثقافة الخلايا الاوليه لافقاريات البحرية¹⁷. ويجمع هذا البروتوكول والأمثل بين ثقافة الخلية لافقارياته ويطور أسلوبا للثقافة الاوليه مناسبا علي نطاق واسع لخيار البحر أو لافقاريات البحرية الأخرى.

المبرمج هو برنامج انتحار الخلية المتاصله التي تسببها مختلف المحفزات الخارجية والمحلية. تنسيق المبرمج هو أمر حاسم بالنسبة للعديد من النظم البيولوجية^18,19, وقد تورطت في الانحدار المعوي من خيار البحر اثناء الاستيميل⁹. للتحقيق في عمليه ابوتوتيك في الكائنات الحية من الفائدة ، وقد تم إنشاء سلسله من الطرق ، بما في ذلك تلطيخ Hoechst واختبارات المجهر ، وتطبيقها بنجاح²⁰. هنا ، أجرينا الحث المبرمج والكشف في الخلايا المعوية المستزرعة الاوليه من خيار البحر لتقييم قابليه استخدام الخلايا الاوليه في الدراسات البيولوجية لافقاريات البحرية. وقد استخدم ديكساميثازون ، واحده من كورتيزون الاصطناعية الشائعة الاستخدام²¹، للحث علي المبرمج في الخلايا المعوية مثقف من خيار البحر ، وتم الكشف عن اشاره Hoechst 33258 كبيره بنجاح في الخلايا الملونة عن طريق المجهر الفلورسنت.

Protocol

1. خليه ثقافة الاعداد المتوسطة

1. اعداد السائل كوميوميك
   1. جمع السوائل كوميوميك: في ظل ظروف معقمه ، تشريح خيار البحر صحية (الوزن الرطب من 85-105 غرام) ، وجمع السائل كوميوميك ، وتخزينها في قارورة زجاجيه معقمه.
   2. أزاله الخلايا كوميوميك: الطرد المركزي السائل كوميوميك في أنابيب الطرد المركزي 50 mL في 1,700 x g لمده 5 دقائق ونقل ماده طافي إلى قارورة زجاجيه معقمه جديده ؛ المقبل ، وجمع السائل الخلوي خاليه من الخلايا من خيار البحر.
   3. تكمله المكونات التعطيل: احتضان القارورة الزجاجية المعقمة ، التي تحتوي علي السائل المائي الخيار البحر ، في 40-50 درجه مئوية حمام المياه لمده 20-40 دقيقه للحصول علي مكونات مكمله-السائل كوميوميك المعطل.
   4. أزاله Microbe: أزاله البكتيريا والكلاميديا عن طريق الترشيح من خلال مرشحات غشاء 0.22 μm. المقبل ، وأزاله الميكوبلازما وغيرها من الجزيئات الدقيقة عن طريق الترشيح باستخدام مرشحات غشاء 0.1 μm للحصول علي محلول المعالجة السائلة كوميوميك.
   5. التكيف الملوحة: ضبط ملوحة محلول المعالجة السائلة كوميوميك إلى 30‰ (تقاس بمقياس الرطوبة) عن طريق أضافه 20 ٪ تركيز عاليه تعقيمها وتصفيتها محلول كلوريد الصوديوم (المخفف بواسطة السائل كوميوميك المعالجة المسبقة) أو DDW (الماء المقطر مزدوجة). نقل السائل الخيار البحر كوميوميك إلى زجاجه معقمه ، وختم الزجاجة ، وتخزين السائل في 4 درجه مئوية لمزيد من التجارب.
2. Leibovitz ل L-15 خليه ثقافة التحسين المتوسط
   1. تزن 5.05 غرام من كلوريد الصوديوم ، 0.135 غرام من KCl ، 0.15 غرام من CaCl₂، 0.25 g من Na₂حتى₄، 0.975 g من mgcl₂، 0.25 g من الجلوكوز ، و 6.25 ملغ من تورين وتمييع لهم في 40 ml من leibovitz L-15 المتوسطة في 50 مل المعقمة أنبوب الطرد المركزي. اجتت الأنبوب علي شاكر لمده 1 ساعة لضمان ذوبان الأملاح تماما.
   2. أضافه 2.5 mL من L-الجلوتامين (100 ملغ/مل) و 500 μL من محلول VE (1.75 mg/L) في المتوسطة المعدة مسبقا Leibovitz L-15 ومزيد من تصفيه المتوسطة من خلال المرشحات غشاء 0.22 μm.
   3. ضبط حجم المتوسطة الاجماليه إلى 500 مل مع الطازجة Leibovitz L-15 المتوسطة ومع 100 mL من السائل كوميوميك المعدة مسبقا; المقبل ، وضبط درجه الحموضة إلى 7.6 باستخدام الحل NaOH. الحفاظ علي عمليه التشغيل في بيئة معقمه. النسبة المركبة من السائل المخروطي يمكن ان تكون 10 ٪-50 ٪ ، و 20 ٪ كافيه ل . japonغاريكوس الخلايا المعوية الثقافة.

2. اعداد الخلايا المعوية

1. البحر خيار الأمعاء المعالجة
   1. تخدير خيار البحر الصحي في علبه ثلج. تشريح وجمع الأمعاء الاماميه ، ثم قسم عينات الانسجه عموديا وأزاله المحتويات الداخلية.
   2. غسل عينات الانسجه في الفوسفات مخزنه المالحة (التلفزيونية) مرتين وتطهيرها عن طريق الغمر في محلول الايثانول المائي (75 ٪ من حيث الحجم) لمده لا تزيد عن 2 ثانيه.
   3. غسل عينات الانسجه في الخدمات التلفزيونية ثلاث مرات لأزاله الايثانول ونقل حوالي 100 ملغ من عينه الانسجه إلى 2.0 mL أنبوب الطرد المركزي المعقمة.
2. مجموعه الخلايا
   1. أضف 1.5 مل من متوسط الثقافة المحسنة إلى كتله النسيج المعوي لخيار البحر وفرم الكتلة بمقص جراحي معقم حتى يصبح المحلول غائما.
      ملاحظه: بالنسبة للبروتوكول المبسط الاختياري ، أضف 0.5 مل من متوسط الثقافة المحسنة مسبقا إلى كتله النسيج المعوي لخيار البحر واقطع الكتلة بمقص جراحي معقم إلى 1 مم³. نقل العينات مباشره إلى الاطباق الثقافية متبوعا بخطوات الاحتضان اللاحقة.
   2. أضافه 400 μL من التريبسين (0.25 ٪) ، مزيج الحل عن طريق عكس ، واحتضانه لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة ؛ ثم ، تصفيه الحل باستخدام مصفاه الخلية 100 μm.
      ملاحظه: انه اختياري لأضافه التريبسين لتشتت الخلايا عند معالجه عينات الانسجه المختلفة. وينبغي احتواء حمض ايثيلنديدياتيتاياستيك (أدتا) في محلول التريبسين للحد من النشاط المثبطة من Ca^{2 +} و Mg^{2 +} في الثقافة المتوسطة.
   3. جمع الترشيح إلى جديد معقم 2.0 mL أنبوب الطرد المركزي ، والطرد المركزي في 1,700 x ز لمده 3 دقائق ، وتجاهل supernatant ، ثم أعاده تعليق بيليه في الثقافة المتوسطة (تستكمل مع المضادات الحيوية) ويغسل مرتين.
      ملاحظه: اعداد الطازجة ثقافة ما قبل الأمثل المتوسطة تستكمل مع 2 ٪ البنسلين-ستربتوميسين الحل (10,000 U/mL البنسلين و 10 ملغ/مل ستربتومايسين) و 1 ٪ جنتاميسين (4 ملغ/مل) قبل بداية التجربة.

3. ثقافة الخلية

1. حاضنه الضبط المسبق: مسبقا حاضنه للثقافة الخلية وتشغيله مقدما علي الأقل 24 ح مع درجه حرارة 18 درجه مئوية والرطوبة المشبعة.
   ملاحظه: تغذيه CO₂ في حاضنه اعتمادا علي خصائص ثقافة الخلية المتوسطة ؛ لا يحتاج CO₂ ليتم توفيرها عند استخدام الوسيطة الاساسيه من L-15 Leibovitz.
2. ثقافة خليه المرحلة الاولي
   1. لمنع نمو الميكروبات وتعزيز الانتشار خلال المرحلة الاوليه من ثقافة الخلية ، أضافه 10 مل من محلول البنسلين-ستربتوميسين (10,000 U/mL البنسلين و 10 ملغ/مل ستربتومايسين) و 0.5 مل من جنتاميسين (40 mg/mL) في كل 500 مل من متوسط الثقافة المحسنة مسبقا. علاوة علي ذلك, تكمله كل 500 mL الثقافة المتوسطة مع 0.6 mL من الانسولين (10 مغ/مل), 100 μL من عامل النمو الشبيهة بالانسولين (0.1 ميكروغرام/μL), و 25 μL من عامل نمو الخلايا الليفية (0.1 ميكروغرام/μL).
   2. جمع الخلايا في أنابيب 1.5 mL ، أعاده التعليق عليها باستخدام 200 μL من المتوسطة المشار اليها ، وماصه pipet-x لهم في الاطباق φ 4 سم.
   3. ثقافة الخلايا في حاضنه وأضافه 2.0 مل من المتوسطة المشار اليها في الخلية الاطباق بعد 6 ح. تغيير نصف المتوسطة كل 12 ساعة حتى تصل إلى المرحلة التالية.
      ملاحظه: التعامل مع التغيير المتوسط برفق ، لأنه لا يتم إرفاق الخلايا إلى الاطباق باحكام. ويمكن استخدام الاطباق المغلفة بولي دي يسين لربط فضفاضة لخلايا الطبق.
3. ثقافة خليه المرحلة الثانية
   1. للحد من الآثار السلبية للمضادات الحيوية إلى الخلايا المستزرعة ، والحد من تركيز المضادات الحيوية المشار اليها (البنسلين ، ستربتومايسين ، و جنتاميسين) في الثقافة المتوسطة إلى النصف.
      ملاحظه: استخدام الانسولين وعوامل النمو يعتمد علي ظروف ثقافة الخلية واختياري.
   2. استبدلت الخلية ثقافة وسط; اجراء تغييرات متوسطه كل يومين إلى ثلاثه أيام اعتمادا علي كثافة الخلية.
      ملاحظه: مراقبه الخلايا المستزرعة يوميا تحت المجهر وتسجيل ظروف النمو.
4. تمرير الخلية
   ملاحظه: المرور والثقافة الفرعية الخلايا ، عندما تصل كثافة الخلية الاساسيه 60 ٪.
   1. اغسل الخلايا المستزرعة مرتين باستخدام الخدمات التلفزيونية في درجه حرارة الغرفة. أضافه 200 μL من محلول التريبسين (0.25%) لكل طبق ويدويا الحصول علي الطبق ضمان تغطيه القاع كله. تجاهل الحل التريبسين واحتضان الخلايا لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة.
   2. يغسل الخلايا مع 1.0 mL من الثقافة الطازجة المتوسطة عن طريق الأنابيب وأعاده تعليق الخلايا. نقل 0.5 mL من تعليق الخلية إلى طبق جديد ، أضافه 1.5 mL من المتوسطة الطازجة ، واحتضان الخلايا في 18 درجه مئوية.
      ملاحظه: يمكن استخدام قصاصات الخلايا لتجميع الخلايا عند فشل حل التريبسين لهضم وفصل الخلايا من الاطباق (بعض خطوط الخلايا لاصقه جدا). ومع ذلك ، لا تقم باجراء كلا الأسلوبين في نفس الوقت.
   3. تغيير المتوسطة بعد 12 ساعة ومراقبه الخلايا تحت المجهر لتقييم الظروف. ثقافة الخلايا لفحوصات تجريبية بعيده.

4. الحث المبرمج والكشف في الخلايا المعوية. japonغاريكوس

1. الخلية الثقافة والعلاج ديكساميثازون
   1. اعداد الخلايا المعوية بعد البروتوكول الذي تم إدخاله سابقا وأضافه الخلايا قطره إلى لوحه 12 بئر في حجم الخلية من 2 × 10⁶ في البئر.
   2. بعد ثلاثه أيام في الثقافة ، وبعد خطوات من "ثقافة خليه المرحلة الاولي" ، وغسل الخلايا ثلاث مرات مع تلفزيوني واستبدال المتوسطة مع المتوسطة الأمثل (دون المضادات الحيوية وعوامل النمو).
   3. تمييع ديكساميثازون (DXMS) في الثقافة المتوسطة لاعداد الطازجة 2 μM و 200 μM الحلول DXMS قبل البدء في التجارب.
   4. أضافه حلول DXMS في تركيزات مختلفه للخلايا المستزرعة المزروعة بنفس حجم الوسط الذي يتم زراعته. تعيين ثلاث مجموعات تجريبية بما في ذلك التحكم (CTL) ، 1 μM ، و 100 μM DXMS.
2. تلوين هويشت
   1. اغسل الخلايا بالصورة التلفزيونية ثلاث مرات بعد الحضانة مع/بدون DXMS للفترات الزمنيه المشار اليها (0 h, 24 h, و 48 h).
   2. أضافه 300 μL من الحل Hoechst 33258 لكل بئر للوحه 12 بئر واحتضان في 18 درجه مئوية لمده 30 دقيقه. اجتت برفق لوحه لتغطيه جميع الخلايا ضمان تلطيخ بهم.
   3. أزاله الحل تلطيخ Hoechst وإصلاح الخلايا عن طريق أضافه 300 μL من محلول بارافورمالدهيد 4 ٪ (في تلفزيوني) لكل بئر. الاثاره بلطف لمده 15 دقيقه.
      تحذير: بارافورمالدهيد هو سام باعتدال عن طريق ملامسه الجلد أو استنشاقه ، ويتم تعيينه كماده مسرطنه محتمله للإنسان. وينبغي استخدام أغطيه الدخان الكيميائية ، ومرفقات التوازن تنفيس ، أو غيرها من التدابير الوقائية اثناء وزنها والتعامل مع بارافورمالدهيد.
   4. اغسل الخلايا الثابتة ثلاث مرات في الاذاعه التلفزيونية. لا تجاهل التلفزيوني بعد الغسيل للحفاظ علي الخلايا المغطية.
3. تحليل المجهر الفلورسنت
   1. قم بتشغيل أجهزه المجهر الفلورسنت بما في ذلك طاقة مصباح الزئبق وطاقة ضوء الفلورسنت والكمبيوتر. قم بتسجيل الدخول إلى حساب نظام التشغيل ، وتشغيل البرنامج ، والتحقق من التكوين الخاص به.
   2. ضع اللوحة المعدة علي مرحله المجهر. ضع العينة علي العدسة الموضوعية باستخدام وحده تحكم المرحلة.
   3. العثور علي خلايا الفائدة تحت المجهر الضوء ، والتحول إلى المجهر الفلورسنت ، والتقاط الصور عن طريق ضبط المعلمات.
      ملاحظه: لمراقبه الاشاره الفلورية Hoechst 33258 منضما إلى نوى الحمض النووي ، وينبغي اجراء المجهر الفلوري مع الاثاره والانبعاثات في حوالي 352 نانومتر و 461 نانومتر ، علي التوالي.

النتائج

هنا ، انشانا ثقافة الخلايا المعوية الاساسيه من ا. japonغاريكوس وعبور الخلايا. يظهر الشكل 1 الخلايا المستديرة في مراحل مختلفه من الخياطة. واختبارات تلطيخ ايدو توفر أدله مباشره للكشف عن النشاط التكاثري لهذه الخلايا المستديرة في مرحله لاحقه (الشكل 2). نحن أي?...

Discussion

وقد كرست جهود بحثيه مكثفه لإنشاء خطوط خلوية في العقود الاخيره ، ومع ذلك ، لا يزال من الصعب احراز تقدم بشان الثقافة الطويلة الأجل للخلايا من لافقاريات البحرية^14،22. وقد أفيد بان الخلايا المستزرعة من تجديد انسجه هولوثوريان كانت قابله للحياة لفتره طويلة من الزم...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 μm filter	Millipore	SLVV033RS
0.22 μm filter	Millipore	SLGP033RB
0.25% Trypsin	Genom	GNM25200
100 μm filter	Falcon	352360
4 cm dishes	ExCell Bio	CS016-0124
4% paraformaldehyde solution	Sinopharm Chemical Reagent	80096618	in PBS
Benchtop Centrifuges	Beckman	Allegra X-30R
BeyoClick EdU-488 kit	Beyotime	C0071S
CaCl2	Sinopharm Chemical Reagent	10005817
Constant temperature incubator	Lucky Riptile	HN-3
Dexamethasone	Sinopharm Chemical Reagent	XW00500221
Electric thermostatic water bath	senxin17	DK-S28
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	80176961	75%
Fibroblast Growth Factor(FGF)	PEPROTECH	100-18B
Fluorescent microscope	Leica DMI3000B	DMI3000B
Garamycin	Sinopharm Chemical Reagent	XW14054101
Glucose	Sinopharm Chemical Reagent	63005518
Hoechst33258 Staining solution	Beyotime	C1017
Insulin	Sinopharm Chemical Reagent	XW1106168001
Insulin like Growth Factor(IGF)	PEPROTECH	100-11
KCl	Sinopharm Chemical Reagent	10016308
Leibovitz's L-15	Genom	GNM41300
L-glutamine (100 mg/mL)	Genom	GNM-21051
MgCl2	Sinopharm Chemical Reagent	XW77863031
Na2SO4	Sinopharm Chemical Reagent	10020518
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent	10019308
NaOH	Sinopharm Chemical Reagent	10019718
PBS	Solarbio	P1020	pH7.2-7.4
Penicillin-Streptomycin	Genom	GNM15140
PH meter	Bante	A120
Taurine	SIGMA	T0625
VE	Seebio	185791