JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

طريقة لتوصيل الخلايا الجذعية العصبية، قابلة للتكيف مع حلول الحقن أو التعليقات، من خلال الشريان السباتي المشترك (الماوس) أو الشريان السباتي الخارجي (الجرذ) بعد السكتة الدماغية الإقفارية. يتم توزيع الخلايا عن طريق الحقن على نطاق واسع في جميع أنحاء الدماغ parenchyma ويمكن الكشف عنها تصل إلى 30 د بعد الولادة.

Abstract

العلاج بالخلايا الجذعية العصبية (NSC) هو علاج مبتكر ناشئ للسكتة الدماغية وإصابات الدماغ الرضية والاضطرابات العصبية. بالمقارنة مع الولادة داخل الجمجمة، فإن الإدارة داخل الشرايين للNSCs أقل توغلاً وتنتج توزيعاً أكثر انتشاراً للـ NSCs داخل الدماغ. وعلاوة على ذلك، يسمح التسليم داخل الشرايين تأثير المرور الأول في الدورة الدموية في الدماغ، مما يقلل من احتمال محاصرة الخلايا في الأجهزة الطرفية، مثل الكبد والطحال، وهي مضاعفات مرتبطة بالحقن المحيطي. هنا، نحن بالتفصيل منهجية، في كل من الفئران والجرذان، لتسليم NSCs من خلال الشريان السباتي المشترك (الماوس) أو الشريان السباتي الخارجي (الفئران) إلى نصف الكرة الأرضية أقل من المتوسط بعد السكتة الدماغية. باستخدام NSCs المسمى GFP ، نوضح التوزيع الواسع النطاق الذي تحقق في جميع أنحاء نصف الكرة الأرضية الإب وسائل القوارض في 1 d و 1 أسبوع و 4 أسابيع بعد الولادة بعد الإشهار ، مع كثافة أعلى في موقع إصابة الإقفاري أو بالقرب منه. بالإضافة إلى البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل، نعرض أدلة على تمايز الخلايا التي تحمل علامة GFP في 4 أسابيع. ويمكن أيضاً استخدام نهج التسليم داخل الشرايين الموصوف هنا بالنسبة للـ NSCs في إدارة المركبات العلاجية، وبالتالي قابليته للتطبيق الواسع على نماذج الإصابات والأمراض المتنوعة في الجهاز العصبي المركزي عبر أنواع متعددة.

Introduction

العلاج بالخلايا الجذعية (SC) يحمل إمكانات هائلة كعلاج للأمراض العصبية، بما في ذلك السكتة الدماغية، صدمة الرأس والخرف1،2،3،4،5،6. ومع ذلك ، فإن طريقة فعالة لتقديم SCs الخارجية إلى الدماغ المريض لا تزال إشكالية2،6،7،8،99،10،11،12،13. SCs تسليمها من خلال طرق التسليم الطرفية، بما في ذلك الحقن الوريدي (IV) أو داخل الصفاق (IP)، تخضع لتصفية أول تمريرة في دوران الأوعية الدقيقة، وخاصة في الرئة والكبد والطحال والعضلات8،,9،,13،,14،وزيادة فرص تراكم الخلايا في المناطق غير المستهدفة. طريقة الحقن داخل المخية الغازية ينتج في الأنسجة المخية المترجمة الضرر وتوزيع مقيد جدا من SCs بالقرب من موقع الحقن2,6,8,14,15,16. لقد أنشأنا مؤخرًا طريقة حقن داخل الشرايين تعتمد على القسطرة لتقديم SCs العصبية الخارجية (NSCs) ، والتي يتم وصفها هنا في نموذج القوارض من السكتة الدماغية الدماغية المحورية. نحن نحفز عابرة (1 ح) إصابة نقص التروية reperfusion في نصف الكرة الأرضية واحد باستخدام خيوط مطاط سيليكون المغلفة لocclude الشريان الدماغي الأوسط الأيسر (MCA) في الفأر أو الفئران17،18،19. في هذا النموذج لاحظنا أن ما يقرب من 75-85٪ اكتئاب تدفق الدم الدماغي (CBF) في نصف الكرة الأرضية ipsilateral مع دوبلر الليزر أو الليزر التصوير البقع17،19، مما يؤدي إلى عجز عصبي ثابت17،18،19.

لأغراض توفير الوقت، يتم تعيين الفيديو للعب بمعدل ضعف السرعة العادية والإجراءات الجراحية الروتينية مثل إعداد الجلد وإغلاق الجرح مع خياطة واستخدام وإعداد مضخة حقنة الآلية لا تقدم. ويتضح طريقة التسليم داخل الشرايين من NSCs في سياق نموذج انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO) من السكتة الدماغية التجريبية في القوارض. لذلك، نحن نشمل إجراء السكتة الدماغية الإقفارية العابرة من أجل إظهار كيفية إجراء الجراحة الثانية، الحقن داخل الشرايين، باستخدام الموقع الجراحي السابق على نفس الحيوان. 10- ويتضح جدوى الولادة داخل الشرايين من مراكز الأمومة الوطنية في نماذج السكتة الدماغية القوارض من خلال تقييم توزيع والبقاء في المراكز غير المتخصصة الخارجية. سيتم الإبلاغ عن فعالية العلاج NSC لتكين أمراض الدماغ والخلل العصبي بشكل منفصل.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل لجنة العناية الحيوانية المؤسسية (IACUC) في جامعة كنتاكي ، وتم اتخاذ العناية المناسبة لتقليل الإجهاد أو الألم المرتبط بالجراحة.

1. إعداد قسطرة الحقن والسنانير الجراحية

  1. بناء قسطرة الحقن (الشكل 1). جمع المواد الضرورية بما في ذلك: MRE010، MRE025، والأنابيب MRE050، 20 G، 26 G و 27 G حقن الإبر(الشكل 2A)،600 حصى الصنفرة، superglue واثنين من مكونات 5 دقائق الايبوكسي.
    1. قطع 20 G و 26 G الإبر في 1 سم من محور إبرة وتلميع نهاية على الصنفرة (الشكل 2B). تدفق الإبر مع 10 مل من الماء المقطر مزدوجة لتنظيف إبرة تتحمل.
      ملاحظة: يتم استخدام تصميمين مختلفين(الشكل 1). تصميم 1 لديه موصل واحد ويستخدم لحقن من الحلول أو تعليق. تصميم 2 لديه 20 G و 26 G Luer قفل الموصلات لحقن الخلايا (20 غ إبرة) وتدفق من حجم القتلى (26 غ إبرة) لضمان تسليم كامل حجم الحل المحتوية على NSC.
  2. تصميم 1: إدراج 3-4 سم طول MRE010 القسطرة في قسطرة 15 سم طول MRE025 وآمنة مع superglue.
    1. قم بتوصيل الطرف الآخر من أنبوب MRE025 بشريحة من قسطرة MRE050، وآمن مع الغلية الفائقة. إدراج إبرة 20 ز مملة في نهاية المتبقية من القسطرة MRE050 وآمنة مع superglue(الشكل 1).
    2. تعزيز مواقع الاتصال مع الغراء الايبوكسي. هذا تصميم القسطرة هو الأمثل لحقن الكواشف (مثل الكيماويات أو الأدوية أو حلول بيولوجية أخرى مثل السيتوكينات).
  3. تصميم 2: إدراج 3-4 سم طول MRE010 القسطرة في قسطرة 15 سم طول MRE025 وآمنة مع superglue.
    1. قم بتوصيل الطرف الآخر من أنبوب MRE025 بشريحة من قسطرة MRE050، وآمن مع الغلية الفائقة. أدخل إبرة 20 G المملة في الطرف المتبقي من القسطرة MRE050 وآمن مع superglue.
    2. إدراج إبرة 26 G مملة في أنبوب MRE050 بالقرب من طرف الإبرة الأولى، بعد اتجاه تدفق الحقن، وآمنة مع superglue(الشكل 1 والشكل 2C). تعزيز كل من الإبر والجزء من أنبوب MRE050 مع الايبوكسي واضحة (الشكل 2C). يسمح هذا التصميم بحقن حل السيارة من خلال إبرة 2 (26 G) بعد حقن NSC من خلال إبرة 1 (20 جم) لطرد حجم الميت في القسطرة في الدورة الدموية في الدماغ، وتحقيق تحكم أكثر دقة في أحجام الحقن.
    3. استخدم إبرة 20 G لحقن NSC من أجل تقليل الضرر الذي يلحق بـ NSCs ، والذي يمكن أن يؤثر سلبًا على الجدوى.
  4. بعد البناء، قم بتدفّق القسطرة بـ 10 مل من الماء المقطر المزدوج، متبوعاً بنسبة 70% من الإيثانول، ثم نقعها في 70% من الإيثانول بين عشية وضحاها.
  5. قبل الجراحة، وإزالة القسطرة من 70٪ الإيثانول وتدفق مع 10 مل من برنامج تلفزيوني معقمة، ووضعها في علبة أداة جراحية autoclaved للتخزين والنقل.
  6. إعداد السنانير الجراحية
    1. قطع رمح إبرة 1.5- 2 سم طويلة من إبرة 27 G، وتلميع كلا طرفي على الصنفرة حتى مملة. ثم استخدام المشبك hemostatic صغيرة لثني رمح في خطاف في نهاية واحدة وعلى شكل حلقة في الطرف الآخر.
    2. أدخل 10-15 سم طويلة MRE025 من خلال حلقة وآمنة مع الشريط الجراحي واضحة (الشكل 2D). جعل 2 أكثر السنانير باستخدام نفس الأسلوب.
    3. انقع جميع السنانير وأنظمة القسطرة في 70٪ من الإيثانول حتى الاستخدام.

2. إعداد الحيوان: التسليم، والإسكان، والتكيف مع البيئة

  1. ذكور والإناث C57BL/6 الفئران (10-12 أسابيع، ن = 10/نقطة الوقت) والجرذان Wistar (10-12 أسابيع، ن = 10) استخدمت في هذه الدراسة.
  2. منزل لهم في vivarium الحيوان التي تسيطر عليها البيئة مع الغذاء والماء الإعلانية libitum.
  3. السماح لهم بالتكيف مع البيئة قبل أسبوع واحد على الأقل من جراحة السكتة الدماغية.
    ملاحظة: مات فأر واحد وجرذ واحد في 1 د بعد جراحة السكتة الدماغية وقتل فأر واحد في 3 د بعد السكتة الدماغية قبل حقن NSC لأسباب إنسانية بسبب الشلل الشديد.

3. ثقافة الماوس والخلايا الجذعية العصبية الفئران (NSCs)

ملاحظة: تم عزل NSCs وتنميتها بعد بروتوكول20.

  1. الماوس
    1. عزل النمط البري (WT) وGFP المسمى NSCs من القشرة الجنينية E18 من الفئران الإناث C57BL/6 الحوامل في الوقت المناسب التي تتزاوج مع الفئران الذكور إيجابية GFP (B6 ACTb-EGFP). لتحديد الأجنة GFP (+)، لاحظ الأجنة التي تم حصادها على مجهر الفلوروس باستخدام قناة FITC. GFP (+) الأجنة تعطي إشارة الفلورنس الأخضر في حين أن الأجنة WT تظهر فقط ضعف فلورا لصناعة السيارات(الشكل 3A).
  2. الفئران
    1. عزل NSCs من المنطقة دون البطينية (SVZ) من الفئران WT الشباب البالغين. تسمية لهم مع DiI فقط قبل الحقن بعد تعليمات الشركة المصنعة21.
  3. الماوس أو الفئران NSCs الجرذان حتى تتطور إلى neurospheres، ومرور عليها عندما يصل قطر الكرة إلى حوالي 100 ميكرومتر(الشكل 3B). استخدام NSCs للحقن بين المقاطع 3 و 5.
  4. التحقق من خصائص الخلايا الجذعية باستخدام لوحة علامة الخلايا الجذعية الجنينية (الشكل 3C).
  5. في يوم الحقن، وجمع المجالات NSC وتفكك مع حل مفرزة الخلية، وتعليق في برنامج تلفزيوني خالية من الكالسيوم والمغنيسيوم إلى تركيز 107 خلايا / مل، ووضع على الجليد الرطب حتى الحقن.

4. التحضير الجراحي

  1. قبل الجراحة، ضع علامة على نقطة على خياطة MCAO التجارية مع قلم علامة الفضة عند 9 مم (للفأرة) أو 15 مم (للجرذ) من طرف مرجع الجراحة لطول الإدراج. أوتوكلاف الأدوات الجراحية (مقص، ملقط) والأدوات قبل كل عملية جراحية، والحرارة تعقيم لهم في معقمة حبة الزجاج بين العمليات.
  2. حث التخدير في الحيوانات مع 5٪ isoflurane عن طريق الاستنشاق والحفاظ على التخدير مع 1-2٪ isoflurane. تقييم عمق التخدير من خلال مراقبة الظروف العامة (نمط التنفس، وحركة الخفقان، وموقف تصحيح الجسم العفوي)، ومنعكس القرنية والاستجابة لقرصة إصبع القدم.
  3. وضع supine الحيوان على وسادة التدفئة، وإعداد موقع العمليات الجراحية على الحيوان عن طريق قص وتنقية مع حل بيتادين تليها 70٪ الإيثانول. حماية عيون الحيوان من التجفيف عن طريق تطبيق مرهم العيون (على سبيل المثال، مرهم المسيل للدموع الاصطناعي) أثناء الجراحة.
  4. واعمل الجراحين على فرك أيديهم بدقة باستخدام فرك الإبادة الجرثومية وارتداء قناع وقفازات معقمة ومعطف مختبر نظيف.

5. الشريان الدماغي الأوسط انسداد (MCAO) جراحة السكتة الدماغية

ملاحظة: العمليات الجراحية للحث على السكتة الدماغية الإقفارية في نصف الكرة الأرضية واحد من الفأر أو الفئران متشابهة في أن يتم إدخال خياطة في الشريان السباتي الداخلي (ICA) لocclude تدفق الدم(الشكل 4)17,18,19,22. ومع ذلك، يختلف الشريان المحدد لإدراج الغرزة استنادًا إلى مساحة التشغيل المتوفرة المطلوبة لحقن الخلايا الجذعية اللاحقة. الجرذ لديه مساحة واسعة في الجزء الخارجي الشريان السباتي (ECA) للسماح اثنين من منفصلة، والعمليات الجراحية تسلسلي (السكتة الدماغية وحقن NSC)، ولكن الماوس لا، تتطلب نهجا بديلا. السكتة الدماغية الناجمة عن تغيرات تدفق الدم, وقد تم الإبلاغ عن حجم المخ فيلكت والعجز العصبي كما هو الحال في التقارير السابقة للمؤلفين17,18,19.

  1. للحث على السكتة الدماغية الإقفارية، تبدأ كل من الفئران والفأر العمليات الجراحية مع شق منتصف الخط على منطقة عنق الرحم، وعزل الشريان السباتي المشترك الأيسر (CCA)، اللجنة الاقتصادية لأفريقيا وICA(الشكل 4). توخي الحذر لعدم تمديد, إزاحة أو الضغط على العصب CCA أو المبهمة. منذ اختيار الشرايين والخطوات الجراحية تختلف بعد ذلك، سيتم وصف جراحة MCAO على الماوس والجرذ بشكل منفصل.
  2. MCAO جراحة على الماوس (الشكل 4A)
    1. مكان ثلاثة مضفر 6-0 خياطة النايلون تحت CCA (الشكل 4A، الخطوة 1) ، وجعل عقدة واحدة جراحية ضيقة لocclude السفينة بعيدا عن التشعب ممكن باستخدام سلسلة قريبة (الشكل 4A، الخطوة 2). تقليم أسفل ينتهي الغرز.
    2. جعل slipknot في الجانب القاصي من CCA (تحذير: لا الإفراط في تشديد كما سيتم الافراج عنه في الخطوة 6) وزلقة واحدة فضفاضة في ما بين عقدتين تشديد(الشكل 4A، الخطوة 2).
    3. قطع شق صغير (~ 1/4 - 1/3 من محيط) على مقربة من عقدة قريبة على CCA مع microscissors (الشكل 4A, الخطوة 3), وإدراج بعناية المطاط سيليكون التجارية المغلفة 7-0 خياطة النايلون الصلبة (الشكل 4A, الخطوة 4). تأمين هذه الغرزة مع سلسلة الأوسط، وتشديد بما فيه الكفاية(الشكل 4A،الخطوة 5) لضمان عدم تسرب الدم من شق وحركة من السيليكون المطاط المغلفة خيوط النايلون من قبل تدفق الظهر من ICA، في حين لا تزال تسمح للنهوض من خياطة نحو اللجنة الاقتصادية لأفريقيا مع دفع لطيف من قبل ملاقط.
    4. حرر الشريحة العليا (الوصاف)(الشكل 4A، الخطوة 6) وتقدم خياطة النايلون إلى ICA حتى يمر طرفها بالتشعب لـ 9 مم (باستخدام علامة الفضة على الغرز كمرجع). تشديد زلقة اثنين العلوي لتأمين خياطة ومنع تدفق الدم.
    5. سحب خيوط 1 ح في وقت لاحق(الشكل 4A, الخطوة 7) وligate CCA باستخدام عقدة الأوسط لمنع النزيف (الشكل 4A, الخطوات 5-7 في ترتيب عكسي, النتائج النهائية كما رأينا في الخطوة 8). أطلق العقدة العليا. أغلق الجرح بخياطة جراحية 4-0.
  3. MCAO جراحة على الفئران (الشكل 4B)
    1. مكان اثنين مضفر 6-0 خياطة النايلون تحت ECA (الشكل 4B، الخطوة 1) ، وجعل عقدة واحدة ضيقة في نهاية القاصي قدر الإمكان(الشكل 4B، الخطوة 2).
    2. ضع مقاطع السفينة على ICA وCCA لانسداد تدفق الدم الشرياني(الشكل 4B، الخطوة 3). يمكن استخدام زلكنوت كبديل لمقطع السفينة.
    3. جعل شق صغير على ايكا مع microscisors(الشكل 4B، والخطوات 3-4) ، إدراج المطاط سيليكون المغلفة التجارية 6-0 خيوط النايلون(الشكل 4B، الخطوة 5) ، وتأمين بشكل صحيح مع زلقة على اللجنة الاقتصادية لأفريقيا.
    4. إطلاق مقطع السفينة على ICA، تقدم خيوط في ICA حتى علامة الفضة (15 مم) تصل إلى تشعب(الشكل 4B،الخطوة 6)، ومن ثم تأمين خياطة مع عقدة2nd على رابطة ابكتا (الشكل 4B، الخطوة 6).
    5. بعد 1 ح من الإقفاري، وسحب هذا الخيط وligate شق لمنع النزيف(الشكل 4B, الخطوة 7), إزالة مقطع السفينة من CCA (النتيجة النهائية كما في الخطوة 8), وإغلاق الجرح مع خياطة جراحية 4-0.

6- التعافي

  1. بعد جراحة السكتة الدماغية، ضع الحيوانات على وسادة التدفئة حتى يستعيد وعيه بالكامل.
  2. توفير المسكن عن طريق الحقن تحت الجلد. إعادة الحيوانات إلى أقفاص منازلهم مع الحصول على الماء والغذاء الإعلانية libitum.

7. الحقن داخل الشرايين

  1. اغسل القسطرة بالكامل بنسبة 70% من الإيثانول واغمسها بين عشية وضحاها حتى الاستخدام. الحق قبل الحقن، وربط قفل لور من الإبرة مع حقنة معقمة، وغسل الجانب كامل تجويف من نظام القسطرة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني عقيمة.
  2. نافذة الوقت والتحضير لحقن NSC
    ملاحظة: استناداً إلى الخبرة والتقارير الواردة من فرق البحث الأخرى، فإن توقيت الحقن في NSC أمر بالغ الأهمية لبقاء كل من الأشخاص وNSCs الخارجية. في دراستنا التجريبية، حقن NSCs في وقت مبكر من النقاط (داخل أول 6 ح بعد إعادة ضخ) أدى إلى ارتفاع معدل الوفيات. وهكذا، اختبرنا في وقت لاحق حقن نقاط الوقت وتحديد الإطار الزمني بين 2 د (48 ح) إلى 3 د (72 ساعة) بعد السكتة الدماغية آمنة ومقبولة للحيوانات، وكفاءة في تحقيق التوزيع داخل 1000 NSCs. النتائج المقدمة هنا هي من الحيوانات تلقى حقن NSC في 3 د بعد الإصابة.
    1. تعيين حقن حقنة مضخة معدل في 20 ميكرولتر / دقيقة للفئران و 50 ميكرولتر / دقيقة للفئران. يمكن أن تؤدي السرعة المفرطة أو مدة الحقن إلى زيادة حجم الجهازية ، والتي تكون الفئران أكثر عرضة لها من الفئران.
    2. باختصار ، في 3 د بعد جراحة السكتة الدماغية ، تخدير الحيوانات مع isoflurane ووضعها على وسادة التدفئة.
    3. إعادة فتح الجرح عنق الرحم وفضح اللجنة الاقتصادية لأفريقيا، ICA وCCA مرة أخرى(الشكل 5،الخطوة 1). كما هو الحال في جراحات السكتة الدماغية، وتحديد مسار الحقن على أساس الأنواع. استخدام CCA لحقن NSC في الماوس، و 33 ا.ا.
  3. الحقن داخل الشرايين من خلال CCA في الماوس
    1. مكان اثنين 6-0 خياطة النايلون مضفر تحت CCA. إنشاء slipknot فضفاضة مع كل واحد منهم بين التشعب وعقدة أقل من جراحة السكتة الدماغية السابقة(الشكل 5, الخطوة 2).
    2. تشديد slipknot العلوي ومن ثم جعل شق صغير فوق عقدة أقل (الشكل 5، الخطوة 3). إدراج قسطرة MRE010 من خلال شق (الشكل 5, الخطوة 4) وآمن مع عقدة الأوسط دون عرقلة تدفق الحقن (الشكل 5, الخطوة 5). يجب أن يكون التدفق الخلفي للدم مرئيًا في القسطرة عند تحرير العقدة العلوية وضبط موضع القسطرة.
    3. ضع مقطع سفينة على 1 X 106 GFP-NSCs من خلال هذا القسطرة في 20 ميكرولتر/دقيقة لمدة 5 دقائق مع مضخة حقنة، تليها تدفق مع 50-100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني بالسرعة نفسها.
    4. بعد الحقن، ligate CCA فوق شق مع عقدة زلة العلوي وسحب القسطرة MRE010(الشكل 5، الخطوة 6). تشديد وتقليم عقدة الأوسط وعقدة العليا. إزالة مقطع السفينة من اللجنة الاقتصادية لأفريقيا. الرجوع إلى الصورة النهائية في الشكل 5، الخطوة 7.
    5. أغلق الجرح بخياطة جراحية 4-0.
    6. بعد توفير الانتعاش كافية على وسادة التدفئة والحقن تحت الجلد مسكن، عودة الحيوانات إلى قفص وطنهم.
  4. الحقن داخل الشرايين من خلال اللجنة الاقتصادية لأفريقيا في الفئران
    1. مؤقتاً occlude اللجنة الاقتصادية لأفريقيا وCCA مع لقطات السفينة(الشكل 5، الخطوة 2).
    2. إجراء شق صغير في الجانب القريب من اللجنة الاقتصادية لأفريقيا (الشكل 5، الخطوة 3) ، أدخل قسطرة MRE010 ، وآمن مع عقدة (الشكل 5، الخطوة 4).
    3. إزالة كل من لقطات السفينة، وحقن 5 × 106 NSCs في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في 50 ميكرولتر / دقيقة لمدة 2 دقيقة، تليها تدفق مع 50-100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني(الشكل 5،الخطوة 5) في نفس السرعة، وذلك باستخدام مضخة حقنة الآلية.
    4. بعد الحقن، و occlude CCA و ECA مع لقطات السفينة مرة أخرى وligate اللجنة الاقتصادية لأفريقيا في الجانب القريب من الشق الثاني بعد سحب القسطرة الحقن(الشكل 5، الخطوة 6).
    5. إزالة اثنين من قصاصات السفينة(الشكل 5، الخطوة 7) وإغلاق الجرح مع خياطة 4-0 الجراحية.
    6. بعد توفير الانتعاش كافية على وسادة التدفئة والحقن تحت الجلد مسكن، عودة الحيوانات إلى قفص وطنهم.
  5. فحص النسيج
    1. جمع العقول من الفئران والجرذان التي تلقت السكتة الدماغية الإقفارية تليها حقن NSCs أو حل السيارة بعد القتل الرحيم وضخ داخل القلب مع 4٪ شبهformaldehyde في 1 د (الماوس والجرذ) ، 7 د (الماوس) و 30 د (الماوس) بعد الحقن. وتألفت كل مجموعة من هذه المجموعات الأربع من 5 NSC و 5 سيارات حقن الحيوانات.
    2. إصلاح العقول بين عشية وضحاها وpreopreserve في 30٪ السكروز ل3 د.
    3. تضمين العقول في أكتوبر، شريحة في 40 ميكرومتر سمك، ودراسة توزيع NSCs بعد التحمّل المناعي مع علامات محددة الخلية، بما في ذلك البروتين حمضي الرجفان الدبقية (GFAP، الخلايا الفلكية)، Tuj1 (الخلايا العصبية الناضجة)، doublecortin (DCX، الخلايا العصبية غير ناضجة).
      ملاحظة: بسبب عدم وجود سلالة الفئران التي تعبر عن GFP، استخدمنا DiI، وهي تسمية فلورية عابرة، لـ NSCs الفئران، والتي لا تسمح إلا بالملاحظة قصيرة الأجل نسبياً. وبالتالي، تم فحص توزيع NSC فقط في 1 د بعد السكتة الدماغية في الفئران.

النتائج

تم الكشف عن NSCs المسمى GFP بسهولة في الدماغ الإقفاري ، ومعظمها في نصف الكرة المتوسطي ، خاصة في penumbra وعلى طول حافة الإصابة(الشكل 6). الفاحص كان وحيد التعمية أثناء التصوير والتحليل.

على سبيل المثال، في 1 د بعد الحقن، تم الكشف عن NSCs داخل قرن آمون الماوس. وأظهرت مجموع?...

Discussion

ولا يزال العلاج بالخلايا الجذعية للأمراض العصبية في مرحلة استكشافية مبكرة. وتتمثل إحدى القضايا الرئيسية في عدم وجود طريقة راسخة لإيصال الـ SCs أو NSCs إلى الدماغ.

على الرغم من أنه يمكن اكتشاف SCs/NSCs الخارجية في الدماغ بعد الحقن الوريدي (IV) أو داخل الصفاق (IP) أو الحقن داخل البارفين?...

Disclosures

اي.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا البحث من قبل ما يلي: جائزة AHA 14SDG20480186 لLC، فريق الابتكار الموضوع من جامعة شانشي للطب الصيني 2019-QN07 لBZ، والحبل الشوكي كنتاكي والرأس البحوث منحة 14-12A لKES وLC.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
20 G needleBecton & DickinsonBD PrecisionGlide 305175preparation of injection catheter
26 G needleBecton & DickinsonBD PrecisionGlide 305111preparation of injection catheter
27 G needleBecton & DickinsonBD PrecisionGlide 305136preparation of injection catheter
4-0 NFS-2 suture with needleHenry Schein Animal Health56905surgery
6-0 nylon sutureTeleflex/Braintree Scientific104-ssurgery
AccutaseSTEMCELL Technologies7922cell detachment solution
bladeBard-Parker10surgery
Buprenorphine-SR LabZooPharmBuprenorphine-SR Lab®analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d)
Calcium/magnisum free PBSVWR02-0119-0500NSC dissociation
DCX antibodyMilliporeAB2253immunostaining
GFAP antibodyInvitrogen180063immunostaining
IsofluraneHenry Schein Animal Health50562-1surgery
MCAO filament for mouseDoccol702223PK5Resurgery
MCAO filament for ratDoccol503334PK5Resurgery
MRE010 catheterBraintree ScientificMRE010preparation of injection catheter
MRE025 catheterBraintree ScientificMRE025preparation of injection catheter
MRE050 catheterBraintree ScientificMRE050preparation of injection catheter
Nu-Tears OintmentNuLife PharmaceuticalsNu-Tears Ointmenteye care during surgery
S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC AngledFine Science Tools00649-11surgery
S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC StraightFine Science Tools00632-11surgery
SupergluePacer Technology15187preparation of injection catheter
syringe pumpKent ScientificGenieTouchsurgery
Tuj1 antibodyMilliporeMAb1637immunostaining
two-component 5 minute epoxyDevcon20445preparation of injection catheter
Vannas spring scissorsFine Science Tools15000-08surgery
vascular clampsFine Science Tools00400-03surgery
Zeiss microscopeZeissAxio Imager 2microscopy

References

  1. Wang, Y. Stroke research in 2017: surgical progress and stem-cell advances. The Lancet. Neurology. 17, 2-3 (2018).
  2. Bliss, T., Guzman, R., Daadi, M., Steinberg, G. K. Cell transplantation therapy for stroke. Stroke. 38, 817-826 (2007).
  3. Boese, A. C., Le, Q. E., Pham, D., Hamblin, M. H., Lee, J. P. Neural stem cell therapy for subacute and chronic ischemic stroke. Stem Cell Research & Therapy. 9, 154 (2018).
  4. Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. Customized Brain Cells for Stroke Patients Using Pluripotent Stem Cells. Stroke. 49, 1091-1098 (2018).
  5. Savitz, S. I. Are Stem Cells the Next Generation of Stroke Therapeutics. Stroke. 49, 1056-1057 (2018).
  6. Wechsler, L. R., Bates, D., Stroemer, P., Andrews-Zwilling, Y. S., Aizman, I. Cell Therapy for Chronic Stroke. Stroke. 49, 1066-1074 (2018).
  7. Muir, K. W. Clinical trial design for stem cell therapies in stroke: What have we learned. Neurochemistry International. 106, 108-113 (2017).
  8. Guzman, R., Janowski, M., Walczak, P. Intra-Arterial Delivery of Cell Therapies for Stroke. Stroke. 49, 1075-1082 (2018).
  9. Misra, V., Lal, A., El Khoury, R., Chen, P. R., Savitz, S. I. Intra-arterial delivery of cell therapies for stroke. Stem Cells and Development. 21, 1007-1015 (2012).
  10. Argibay, B., et al. Intraarterial route increases the risk of cerebral lesions after mesenchymal cell administration in animal model of ischemia. Scientific Reports. 7, 40758 (2017).
  11. Kelly, S., et al. Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11839-11844 (2004).
  12. Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. Journal of Neuroscience Research. 87, 1718-1727 (2009).
  13. Fischer, U. M., et al. Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery: the pulmonary first-pass effect. Stem Cells and Development. 18, 683-692 (2009).
  14. Misra, V., Ritchie, M. M., Stone, L. L., Low, W. C., Janardhan, V. Stem cell therapy in ischemic stroke: role of IV and intra-arterial therapy. Neurology. 79, 207-212 (2012).
  15. Muir, K. W., Sinden, J., Miljan, E., Dunn, L. Intracranial delivery of stem cells. Translational Stroke Research. 2, 266-271 (2011).
  16. Boltze, J., et al. The Dark Side of the Force - Constraints and Complications of Cell Therapies for Stroke. Frontiers in Neurology. 6, 155 (2015).
  17. Huang, C., et al. Noninvasive noncontact speckle contrast diffuse correlation tomography of cerebral blood flow in rats. Neuroimage. 198, 160-169 (2019).
  18. Wong, J. K., et al. Attenuation of Cerebral Ischemic Injury in Smad1 Deficient Mice. PLoS One. 10, 0136967 (2015).
  19. Zhang, B., et al. Deficiency of telomerase activity aggravates the blood-brain barrier disruption and neuroinflammatory responses in a model of experimental stroke. Journal of Neuroscience Research. 88, 2859-2868 (2010).
  20. Walker, T. L., Yasuda, T., Adams, D. J., Bartlett, P. F. The doublecortin-expressing population in the developing and adult brain contains multipotential precursors in addition to neuronal-lineage cells. The Journal of Neuroscience. 27, 3734-3742 (2007).
  21. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3, 20130001 (2013).
  22. Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  23. Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
  24. Chua, J. Y., et al. Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).
  25. Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies. Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).
  26. Duma, C., et al. Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients. Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

160

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved