Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يستخدم هذا البروتوكول فحص المناعة للكشف عن تلف الحمض النووي الناجم عن PM2.5في القلوب التشريحية لأجنة حمار وحشي.

Abstract

يمكن أن يؤدي التعرض للجسيمات الدقيقة المحيطة (PM2.5)إلى سمية نمو القلب ولكن الآليات الجزيئية الأساسية لا تزال غير واضحة. 8-هيدروكسي-2'deoxygenase (8-OHdG) هو علامة على تلف الحمض النووي التأكسدي وγH2AX هو علامة حساسة لاستراقات حبلا مزدوجة الحمض النووي. في هذه الدراسة، كنا نهدف إلى الكشف عن PM2.5-الناجمة عن 8-OHdG و γH2AX التغييرات في قلب أجنة حمار وحشي باستخدام فحص immunofluorescence. عولجت أجنة حمار وحشي مع المسائل العضوية القابلة للاستخراج (EOM) من PM2.5 في 5 ميكروغرام / مل في وجود أو عدم وجود مضادات الأكسدة N-أسيتيل-L-السيستين (NAC, 0.25 ميكرومتر) في 2 ساعة بعد الإخصاب (hpf). تم استخدام DMSO كتحكم في السيارة. في 72 حصان، تم تشريح القلوب من الأجنة باستخدام إبرة حقنة وثابتة و permeabilized. بعد حظرها، تم فحص العينات مع الأجسام المضادة الأولية ضد 8-OHdG و γH2AX. ثم تم غسل العينات واحتضانها بأجسام مضادة ثانوية. وقد لوحظت الصور الناتجة تحت المجهر الفلوري وتم قياسها كميا باستخدام ImageJ. تظهر النتائج أن EOM من PM2.5 عززت بشكل كبير إشارات 8-OHdG و γH2AX في قلب أجنة حمار وحشي. ومع ذلك ، فإن NAC ، الذي يعمل كزبال لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، تصدى جزئيا لتلف الحمض النووي الناجم عن EOM. هنا، نقدم بروتوكولا للمناعة للتحقيق في دور تلف الحمض النووي في عيوب القلب الناجمة عن PM2.5التي يمكن تطبيقها للكشف عن التغيرات البيئية الناجمة عن التعبير البروتيني الناجم عن المواد الكيميائية في قلوب أجنة حمار وحشي.

Introduction

تلوث الهواء هو الآن مشكلة بيئية خطيرة تواجه العالم. الجسيمات الدقيقة المحيطة (PM2.5)،والتي تعد واحدة من أهم مؤشرات جودة الهواء، يمكن أن تحمل عددا كبيرا من المواد الضارة وتدخل في نظام الدورة الدموية في الدم، مما يسبب ضررا خطيرا لصحة الإنسان1. وقد أظهرت الدراسات الوبائية أن التعرض PM2.5 يمكن أن يؤدي إلى زيادة خطر عيوب القلب الخلقية (CHDs)2,3. كما أظهرت الأدلة المستقاة من التجارب على الحيوانات أن PM2.5 يمكن أن يسبب نموا غير طبيعي في القلب في أجنة حمار وحشي وذرية الفئران ولكن الآليات الجزيئية لسمية نمو القلب من PM2.5 لا تزال غير معروفة إلى حد كبير4،5،6.

تلف الحمض النووي يمكن أن يسبب توقيف دورة الخلية والحث على موت الخلايا المبرمج، والتي قد تدمر على نطاق واسع إمكانات خلايا السلف، وبالتالي، يضعف نمو القلب7). وقد تم توثيق جيدا أن الملوثات البيئية، بما في ذلك PM2.5،لديها القدرة على مهاجمة الحمض النووي من خلال آليات الإجهاد التأكسدي8،9. كل من الإنسان والحمار الوحشي تطور القلب حساسة للإجهاد التأكسدي10،11،12. 8-OHdG هو علامة تلف الحمض النووي التأكسدي، وإشارة γH2AX هو علامة على فواصل حبلا مزدوجة الحمض النووي. N-أسيتيل-L-السيستين (NAC), السلائف الاصطناعية من السيستين داخل الخلايا والجلوتاثيون, يستخدم على نطاق واسع كمركب مضاد للأكسدة. في هذه الدراسة، ونحن نستخدم NAC للتحقيق في دور الإجهاد التأكسدي في PM2.5- تلف الحمض النووي المستحث13.

وقد استخدمت على نطاق واسع حمار وحشي كنموذج الفقاريات لدراسة تطور القلب وأمراض القلب والأوعية الدموية البشرية لأن آليات نمو القلب يتم الحفاظ عليها للغاية بين الفقاريات14،15. وتشمل مزايا استخدام حمار وحشي كنموذج صغر حجمها، والقدرة الإنجابية القوية، وانخفاض تكلفة التغذية. ذات أهمية خاصة لهذه الدراسات، أجنة حمار وحشي لا تعتمد على نظام الدورة الدموية خلال التنمية المبكرة ويمكن البقاء على قيد الحياة تشوه القلب الحاد14. وعلاوة على ذلك، فإن شفافيتها تسمح بمراقبة الجسم بأكمله مباشرة تحت المجهر. وهكذا، توفر أجنة حمار وحشي فرصة متميزة لتقييم الآليات الجزيئية المشاركة في تحريض سمية نمو القلب نتيجة التعرض لمختلف المواد الكيميائية البيئية5و16و17. لقد سبق أن ذكرت أن PM2.5-الناجم عن الإجهاد التأكسدي يؤدي إلى تلف الحمض النووي وموت الخلايا المبرمج, مما أدى إلى تشوهات في القلب في حمار وحشي18. في هذه الدراسة، ونحن نقدم بروتوكول مفصل للتحقيق PM2.5-الناجم عن تلف الحمض النووي في قلب أجنة حمار وحشي.

Protocol

تم الحصول على سمك الحمار الوحشي البري (AB) المستخدم في هذه الدراسة من المركز الوطني لموارد سمك الحمار الوحشي في ووهان، الصين. وقد تم استعراض جميع الإجراءات الحيوانية المبينة هنا والموافقة عليها من قبل مؤسسة رعاية الحيوان التابعة للجنة الأخلاقيات في جامعة سوتشو.

1. PM2.5 أخذ العينات واستخراج المركبات العضوية

ملاحظة: تم جمعPM 2.5 في منطقة حضرية في سوتشو، الصين، 1-7 أغسطس 2015، كما هو موضح سابقا5.

  1. خبز 47 مم مرشحات غشاء الكوارتز في فرن 500 درجة مئوية ل 2 ساعة لإزالة المكونات العضوية.
  2. ضع عامل تصفية في عينة PM2.5 لمدة 24 ساعة من أخذ العينات دون انقطاع.
  3. إزالة مرشح وجاف لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  4. تحديد عامل التصفية بتوازن تحليلي.
  5. استخراج المكونات العضوية من مرشح من قبل Soxhlet استخراج باستخدام ثنائي كلورو الميثان كمذيب19.
  6. جفف EOM بواسطة تبخر دوار في حمام مائي 60 درجة مئوية وتدفق النيتروجين. حل EOM في DMSO وتخزينها في -20 درجة مئوية.

2. زيبرافيش جمع الأجنة والعلاج

  1. الحفاظ على حمار وحشي في 28.5 ± 0.5 درجة مئوية في نظام تربية الأحياء المائية إعادة تعميم مع ضوء 14 ساعة و 10 ساعة دورة ضوئية داكنة.
  2. ضع سمك الحمار الوحشي البالغ السليم في خزان بنسبة 2:1 من الذكور إلى الإناث.
  3. في اليوم التالي، جمع الأجنة وغسلها مع مياه النظام (أي، حمار وحشي تربية المياه).
  4. حدد وتقسم عشوائيا أجنة حمار وحشي مما يدل على التطور الطبيعي (حجم موحد، والحبوب الكاملة، وليس تخثر البيض) إلى 4 مجموعات في أطباق بيتري الزجاج الفردية مع قطر 7 سم (حوالي 50 جنينا لكل طبق).
  5. علاج الأجنة مع PM2.5 (5 ملغ / لتر) في وجود أو غياب NAC في 0.25 ميكرومتر من 2 حصان حتى 72 حصان. استخدام DMSO كتحكم في السيارة إلى تركيز نهائي بنسبة 0.1٪ (v/v).

3. المراقبة الشكلية للأجنة حمار وحشي وتشريح القلب

  1. في 72 حصان، نقل الأجنة إلى الشرائح الزجاجية ومراقبة تحت المجهر ستيريو. سجل تشوهات القلب، مثل وذمة التامور، وتغيير الحلقات، وانخفاض الحجم.
  2. حساب معدلات التشوه (النسبة المئوية للأجنة المصابة بعيوب في القلب من إجمالي الأجنة الحية) وتحليل الاختلافات بين المجموعات التي تستخدم ANOVA ذات الاتجاه الواحد تليها اختبار المقارنة المتعددة في تركيا (p < 0.05 = ذات دلالة إحصائية).
  3. تخدير الأجنة مع 0.6 ملغم/ مل MS-222 لشل حركتها على الشرائح الزجاجية.
  4. سجل ضربات القلب لمدة 30 ق وقياس معدلات ضربات القلب باستخدام برنامج ImageJ5،20.
  5. تشريح القلوب من أجنة حمار وحشي مع إبرة حقنة المتاح تحت المجهر ستيريو. تنبيه: تجنب تدمير شكل القلب.

4. فحص الفلورة المناعية

  1. لاستخدام فحص المناعة للكشف عن تلف الحمض النووي المستحث PM2.5 في قلب أجنة حمار وحشي ، استخدم قلم حاجز مسعور لرسم دائرة على جانب زجاجي نظيف.
  2. إضافة 50 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد إلى 1.25 مل من ملحي الفوسفات المخزنة (PBS) لجعل حل التثبيت.
  3. ضع 3 قلوب تشريح في دائرة قلم حاجز مسعور واحد واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. decant الحل تحت المجهر وتجفيف العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق على الأقل، بحيث تعلق تماما قلوب الشرائح الزجاجية.
  5. غسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ توين 20 (PBST) لمدة 5 دقائق لكل غسل.
  6. إضافة 50 ميكرولتر من الألبومين مصل البقري (BSA) إلى 1000 ميكرولتر من PBST للحصول على حل BSA 5٪ واحتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة 1 ساعة لمنع ربط الأجسام المضادة غير محددة.
  7. Decant الحل وغسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل غسل.
  8. تمييع 2 ميكرولتر من الأجسام المضادة أحادية النسيلة الماوس ضد 8-OHdG و 2 ميكرولتر من الأجسام المضادة متعددة النسيلة أرنب ضد γH2AX في 296 ميكرولتر من PBST للحصول على حل كوكتيل الأجسام المضادة الأولية العاملة.
  9. احتضان عينات القلب مع 50 ميكرولتر من محلول كوكتيل الأجسام المضادة الأولية ضد 8-OHdG و γH2AX في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية (الحضانة بين عشية وضحاها يمكن أن تزيد من كثافة الإشارة).
  10. Decant الحل وغسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل غسل.
  11. تمييع 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة للفأرة الثانوية التي تحمل علامة FITC و1 ميكرولتر من الأجسام المضادة للأرانب الثانوية للماعز cy3 في 498 ميكرولتر من PBST للحصول على محلول كوكتيل الأجسام المضادة الثانوي العامل واحتضان العينات مع الأجسام المضادة الثانوية (1:500 في PBST) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  12. Decant الحل وغسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل غسل محمية من الضوء.
  13. إضافة 20 ميكرولتر من DAPI (4'،6-diamidino-2-phenylindole) إلى عينات لتلطيخ النووية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  14. تطبيق غطاء على الشريحة وختم مع طلاء الأظافر لمنع التجفيف والحركة. ثم صورة العينات تحت المجهر الفلوري وتحديد إشارة مضان منطقة القلب باستخدام برنامج ImageJ. حساب التغييرات النسبية مع متوسط نماذج التحكم DMSO. تحديد الأهمية الإحصائية للبيانات كما في الخطوة 3.2.

النتائج

هذا الفحص immunofluorescence هو وسيلة حساسة ومحددة لقياس التغيرات التعبير البروتين في قلوب أجنة حمار وحشي تتعرض للمواد الكيميائية البيئية.

في هذا التحليل التمثيلي، تم تقييم الأجنة المعرضة لPM2.5 في غياب أو وجود NAC المضادة للأكسدة لوجود تشوها?...

Discussion

على الرغم من أن سمك الحمار الوحشي هو نموذج فقاري ممتاز لدراسة سمية النمو القلبي للمواد الكيميائية البيئية ، بسبب صغر حجم قلب الجنين ، فمن الصعب الحصول على ما يكفي من البروتين لتحليل البقع الغربية. لذلك، نقدم طريقة immunofluorescence حساسة لتحديد مستويات التعبير البروتين من المؤشرات الحيوية تلف ال...

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة في الصين (رقم المنحة: 81870239، 81741005، 81972999) وتطوير البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
8-OHdG AntibodySanta Cruz Biotechnology, USAsc-66036Primary antibody
Analytical balanceSartorius,ChinaBSA124S
BSASolarbio,Beijing,ChinaSW3015For blocking
DAPIAbcam, USAab104139For nuclear counterstain.
DMSOSolarbio,Beijing,ChinaD8371
Fluorescence microscopeOlympus, JapanIX73For imaging fluorescence signals/
Goat Anti-Rabbit IgG Cy3Carlsbad,USACW0159Secondary antibody
Goat Anti-Rabbit IgG FITCCarlsbad,USARS0003Secondary antibody
N-Acetyl-L-cysteine(NAC)Adamas-Beta, Shanghai, China616-91-1
Orbital shakerQILINBEIER,ChinaTS-1
ParaformaldehydeSigma,ChinaP6148Make 4% paraformaldehyde for fixation.
Phosphate Buffered SalineHyClone,USASH30256.01Prepare 0.1% Tween in PBS for washing.
PM2.5 samplerTianHong,Wuhan, ChinaTH-150CFor 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling.
Re-circulating aquaculture systemHaiSheng,Shanghai,ChinaThe zebrafish was maintained in it.
Soxhlet extractorZhengQiao,Shanghai, ChinaBSXT-02For organic components extraction.
StereomicroscopeNikon,CanadaSMZ645For heart dissection from zebrafish embryos.
Tricaine methanesulfonate (MS222)Sigma,ChinaE10521To anesthetize zebrafish embryos
Tween 20Sigma,ChinaP1379
γH2AX AntibodyAbcam, USAab26350Primary antibody

References

  1. Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).
  2. Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan. The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).
  3. Mesquita, S. R., et al. Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain). Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).
  4. Zhang, H., et al. Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).
  5. Duan, J., et al. Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model. Chemosphere. 180, 24-32 (2017).
  6. Lorda-Diez, C. I., et al. Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis. Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).
  7. Kouassi, K. S., et al. Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire. Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).
  8. Gualtieri, M., et al. Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5. Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).
  9. Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes. Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).
  10. Yamashita, M. Apoptosis in zebrafish development. Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).
  11. Moazzen, H., et al. N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes. Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).
  12. Sun, S. Y. N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond. Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).
  13. Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
  14. Asnani, A., Peterson, R. T. The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease. Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).
  15. Li, M., et al. Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish. Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).
  16. Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio). Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).
  17. Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).
  18. van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. An emerging consensus on cardiac regeneration. Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).
  19. Yue, C., et al. Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways. Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).
  20. Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).
  21. Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
  22. Zhu, L., et al. DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

168 Immunofluorescence PM2 5

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved