Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويهدف البروتوكول إلى توفير طريقة قياسية لتزجيج البويضات الأغنام البالغة والحدث. وهو يشمل جميع الخطوات من إعداد وسائل الإعلام النضج في المختبر لثقافة ما بعد الاحترار. يتم تزجيج البويضات في مرحلة MII باستخدام Cryotop لضمان الحد الأدنى من الحجم الأساسي.

Abstract

في الماشية، يمكن تطوير نظم إنتاج الأجنة في المختبر ومواصلة ذلك بفضل العدد الكبير من المبيضين والبويضات التي يمكن الحصول عليها بسهولة من المسلخ. يحمل المبيضان البالغان دائما العديد من بصيلات النمل ، بينما في المتبرعين قبل البلوغ ، تتوفر الأعداد القصوى من البويضات في عمر 4 أسابيع ، عندما يحمل المبيضان أعدادا كبيرة من بصيلات النمل. وهكذا، تعتبر الحملان 4 أسابيع من العمر المتبرعين جيدة، حتى لو كان الكفاءة التنموية للبويضات prepubertal أقل بالمقارنة مع نظيرتها الكبار.

وستعزز البحوث الأساسية والتطبيقات التجارية بإمكانية نجاح حفظ البويضات الزفيرة التي تم الحصول عليها من المتبرعين البالغين والمتبرعين قبل الاختزال. كما أن تزجيج البويضات التي يتم جمعها من المتبرعين قبل التكاثر سيسمح بتقصير فترة التوليد وبالتالي زيادة المكاسب الوراثية في برامج التربية. ومع ذلك ، فإن فقدان إمكانات النمو بعد التبريد يجعل البويضات الثديية على الأرجح واحدة من أصعب أنواع الخلايا للحفاظ على التبريد. من بين تقنيات التبريد المتاحة ، يتم تطبيق التزجيج على نطاق واسع على البويضات الحيوانية والبشرية. على الرغم من التطورات الأخيرة في هذه التقنية ، فإن التعرض لتركيزات عالية من العوامل الصفية المبردة وكذلك الإصابة المخيفة والإجهاد التناضحي لا يزال يحفز العديد من التعديلات الهيكلية والجزيئية ويقلل من الإمكانات التنموية للبويضات الثديية. هنا، نقوم بوصف بروتوكول لتزجيج البويضات الخرافية التي تم جمعها من المتبرعين الأحداث والبالغين ونضجت في المختبر قبل التبريد. ويشمل البروتوكول جميع الإجراءات من البويضات في النضج في المختبر إلى التزجيج والاحترار وفترة الحضانة بعد الاحترار. يمكن بالفعل تخصيب البويضات المهزوسة في مرحلة MII بعد الاحترار ، ولكنها تحتاج إلى وقت إضافي قبل الإخصاب لاستعادة الضرر بسبب إجراءات التبريد وزيادة إمكاناتها التنموية. وبالتالي، فإن ظروف الثقافة والتوقيت بعد الاحترار هي خطوات حاسمة لاستعادة إمكانات نمو البويضات، خاصة عندما يتم جمع البويضات من المتبرعين الأحداث.

Introduction

يمكن أن يوفر التخزين طويل الأجل للجامات الأنثوية مجموعة واسعة من التطبيقات ، مثل تحسين تربية الحيوانات المنزلية من خلال برامج الاختيار الجيني ، والمساهمة في الحفاظ على التنوع البيولوجي من خلال برنامج الحفاظ على أنواع الحياة البرية في الموقع السابق ، وتعزيز أبحاث وتطبيقات التكنولوجيا الحيوية في المختبر بفضل توافر البويضات المخزنة التي سيتم دمجها في إنتاج الأجنة المختبرية أو برامج زرع الأعضاء النووية1و2و3. كما أن تزجيج البويضات الأحداث سيزيد من الكسب الوراثي عن طريق تقصير فترة التوليد في برامج التربية4. ويعتبر حاليا التزجيج عن طريق التبريد السريع للغاية والاحترار من البويضات نهجا قياسيا للبويضات الماشية cryopreservation5. في المجترات ، قبل التزجيج ، عادة ما تنضج البويضات في المختبر ، بعد استرجاعها من الجريبات التي تم الحصول عليها من المبيضين المشتقة من المسلخ2. الكبار، وخاصة المبيضين prepubertal4،6، يمكن أن توفر في الواقع عدد غير محدود تقريبا من البويضات لتكون cryopreserved.

في الماشية، بعد التزجيج البويضات والاحترار، وقد تم الإبلاغ عن غلة الكيسة الأريمية في >10٪ عادة من قبل العديد من المختبرات خلال العقد الماضي3. ومع ذلك ، في التزجيج البويضات المجترات الصغيرة لا يزال يعتبر جديدا نسبيا لكل من البويضات الأحداث والكبار ، ولا يزال يتعين إنشاء طريقة قياسية لتزجيج البويضاتالخرافية 2،5. على الرغم من التطورات الأخيرة ، فإن البويضات الزخيفة والدافئ تقدم بالفعل العديد من التعديلات الوظيفية والهيكلية التي تحد من إمكاناتها التنموية7و8و9. وهكذا، ذكرت مقالات قليلة تطوير الكيسة الأريمية في 10٪ أو أكثر في البويضات الأغنام vitrified / الدافئة2. وقد تم بحث عدة نهج للحد من التعديلات المذكورة أعلاه: تحسين تكوين حلول التزجيج والذوبان10،11؛ تجريب استخدام أجهزة التبريد المختلفة8،12،13؛ وتطبيق علاجات محددة أثناء نضوج المختبر (IVM)4و14و15 و / أو خلال فترة النقاهة بعد ارتفاع درجة الحرارة6.

هنا نحن نصف بروتوكولا لتزجيج البويضات الأغنام التي تم جمعها من المتبرعين الأحداث والبالغين ونضجت في المختبر قبل cryopreservation. يتضمن البروتوكول جميع الإجراءات من نضوج البويضات في المختبر إلى التزجيج والاحترار وفترة ثقافة ما بعد الاحترار.

Protocol

10- يتفق البروتوكول المتعلق بالحيوانات والإجراءات المنفذة المبينة أدناه مع المبادئ التوجيهية الأخلاقية السارية في جامعة ساساري، امتثالا لتوجيه الاتحاد الأوروبي 86/609/EC وتوصية لجنة الجماعات الأوروبية 2007/526/EC.

1. إعداد وسائل الإعلام للتلاعب البويضات

  1. إعداد المتوسطة لنقل المبيضين التي تم جمعها عن طريق استكمال الفوسفات Dulbecco المخزنة المالحة مع 0.1 غرام / لتر البنسلين و 0.1 غرام / لتر streptomycin (PBS).
  2. إعداد المتوسطة لجمع البويضات والنضج عن طريق تخفيف 9.5 غرام من الأنسجة المتوسطة (TCM) 199 في مسحوق مع 1 لتر من الماء ميلي كيو تكملها البنسلين (0.1٪) والستريبتوميسين (0.1٪).
    1. بعد التخفيف، فلتر 100 مل من المتوسط وتخزينه في 4 درجة مئوية كما الأسهم Maturation المتوسطة (SMM) لاستخدامها لمدة أسبوع واحد.
    2. إعداد وسيطة التجميع (CM) عن طريق استكمال المتبقية 900 مل مع 25 mM HEPES, 0.36 غرام / لتر بيكربونات و 0.1٪ (ث / v) الكحول البوليفينيل (PVA) (درجة الحموضة 7.3, osmolality 290 mOsm/kg).
  3. إعداد المتوسطة النضج مع SMM تستكمل مع 0.021 غرام / لتر بيكربونات، 10٪ مصل الأغنام estrus المعالجة بالحرارة، 1 وحدة IU/mL FSH، 1 وحدة IU/mL LH، 100 ميكرولتر من السيسيتامين و 8 ملغم / مل من البيروفاتي.
    ملاحظة: يجب احتضان وسيط النضج بحجم 10 مل في ظروف قياسية (في جو رطب بحد أقصى عند 39 درجة مئوية في 5٪من ثاني أكسيد الكربون في الهواء) لمدة 4 ساعة على الأقل قبل الاستخدام.
  4. إعداد الوسط الأساسي (BM) للتلاعب بالبويضات بعد النضج في المختبر ، ويتكون في PBS بدون Ca++ و Mg++، مكملا بمصل عجل الجنين 20٪ (FCS).

2. جمع البويضات والنضج

  1. استعادة البويضات من الأحداث (30-40 يوما من العمر، وزن الجسم 6-10 كجم) والمبايض الكبار.
  2. نقل المبيضين التي تم جمعها من المسلخ التجاري إلى المختبر في غضون 1-2 ساعة في برنامج تلفزيوني في 27 درجة مئوية.
  3. بعد الغسيل في PBS المتوسطة الطازجة، شريحة المبيضين في CM باستخدام شفرة صغيرة للافراج عن محتوى الجريب.
  4. تحت فحص مجسم مع التكبير 60x، حدد مجمعات الركاميات البويضات (COCs) للنضوج في المختبر عن طريق اختيار تلك مع 4-10 طبقات من خلايا الحبيبية، البويضات مع السيتوبلازم موحدة، والتوزيع المتجانس لقطرات الدهون في السيتوبلازم ومع القطر الخارجي من حوالي 90 ميكرومتر (متوسط).
  5. غسل COCs مختارة ثلاث مرات في CM ونقلها في النهاية في المتوسط النضج.
    ملاحظة: بالنسبة للبويضات الأحداث، لتحسين البقاء على قيد الحياة بعد التزجيج، تكملة المتوسطة النضج مع تريهالوز 100 ميكرومتر.
  6. للنضوج في المختبر، نقل 30-35 COCs في 600 ميكروغرام من متوسط النضج في أطباق بيتري أربعة آبار، مغطاة 300 ميكروغرام من الزيت المعدني واحتضانها لمدة 22 (البويضات الكبار)/24 (البويضات الأحداث) ح في 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في الهواء في 39 درجة مئوية.
  7. بعد النضج في المختبر، وتكسير COCs من خلايا الركاز عن طريق الأنابيب بلطف. بعد الفحص تحت مجسم مع 60x التكبير، حدد فقط تلك التي تظهر البثق على الجسم القطبي الأول، وبالتالي في مرحلة ميتافاز الثاني (MII)، للتزجيج.

3. إجراءات جمع السائل المنوي وتجميده وذوبانه

  1. إعداد الوسط الأساسي لحفظ التبريد السائل المنوي تتكون من موسع رام (200 mM تريس; 70 mM حمض الستريك; 55 mM الفركتوز; درجة الحموضة 7.2, osmolality 300 mOsm/kg) تكملها صفار البيض 20٪ (v/v).
  2. جمع السائل المنوي فقط خلال موسم تربية الأغنام (أكتوبر-نوفمبر).
  3. الحصول على القذف عن طريق المهبل الاصطناعي من الكباش الكبار (الذين تتراوح أعمارهم بين 2-5 سنوات)، والحفاظ عليها في بيئة في الهواء الطلق وتغذية حصة صيانة الوزن الحي. إبقاء الكباش معزولة في أقلام منفصلة، ولكن مع الاتصال البصري بين بعضها البعض.
  4. كرر جمع السائل المنوي واحد في الأسبوع خلال موسم التكاثر بأكمله للحصول على ما لا يقل عن 8 القذف من كل ذكر.
  5. نقل عينات السائل المنوي إلى المختبر في درجة حرارة بيئية في غضون 5 دقائق بعد جمعها ومعالجتها على الفور. تجمع القذف من اثنين إلى ثلاثة كباش وتقييم الطيف تركيز الحيوانات المنوية.
  6. بعد تجميع, تمييع القذف تصل إلى 400 × 106 spermatozoa/mL مع وسيط قاعدة للحفاظ على التبريد السائل المنوي تكملها 4٪ الجلسرين. ثم يبرد السائل المنوي المخفف إلى 4 درجات مئوية على مدى 2 ساعة ويتوازن لمدة 20 دقيقة قبل التجميد.
  7. تجميد عينات السائل المنوي في شكل بيليه (0.25 مل) على الجليد الجاف ومن ثم يغرق لهم في النيتروجين السائل.
  8. للذوبان، وضع بيليه في الصقر الزجاجي المعقم ويغرق في حمام مائي لمدة 20 s في 39 درجة مئوية.

4. الإخصاب في المختبر وزراعة الأجنة

  1. إعداد المخزونات لدستور السائل الأوفيدكتال الاصطناعي (SOF).
    1. إعداد المخزون A: 99.4 مل من مياه ميليكيو؛ 6.29 غرام من NaCl؛ 0.534 غرام من KCl؛ 0.161 غرام من KH2PO4; 0.182 غرام من MgSO4 · 7H2O; و 0.6 مل من لاكتات الصوديوم. ابق عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
    2. إعداد المخزون B: 10 مل من مياه ميليكيو؛ 0.210 غرام من NaHCO3؛ و 2-3 غرام من فينول الأحمر. ابق عند 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد.
    3. إعداد المخزون C: 10 مل من مياه ميليكيو؛ و 0.051 غرام من بيروفات الصوديوم. ابق عند 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد.
    4. إعداد المخزون D: 10 مل من المياه ميلي كيو; و 0.262 غرام من CaCl2 2H2O. الاحتفاظ في 4 درجة مئوية لمدة 1 شهر.
    5. إعداد 10 مل من SOF تتكون من 7.630 مل من مياه ميليكيو، 1 مل من المخزون A، 1 مل من المخزون B، 0.07 مل من الأسهم C و 0.7 مل من المخزون D.
    6. إعداد الإخصاب في المختبر (IVF) المتوسطة: SOF تكملها مع 2٪ مصل الأغنام استروس المعالجة بالحرارة، 10 ميكروغرام / مل الهيبارين و 1 ميكروغرام / مل hypoutarine (osmolality 280-290 mOsm/kg).
      ملاحظة: يجب احتضان وسيط التلقيح الصناعي بحجم 10 مل في ظروف قياسية (في جو رطب بحد أقصى عند 39 درجة مئوية في 5٪ CO2و 5٪ O2 و 90٪ N2) على الأقل 4 ساعة قبل الاستخدام.
  2. نقل السائل المنوي المجمدة / المذابة aliquots في أنبوب مخروطي الزجاج المعقم أقل من 1.5 مل من المتوسط التلقيح الاصطناعي الدافئ واحتضانها لمدة 15 دقيقة في 39 درجة مئوية في جو رطب في 5٪ CO2 في الهواء.
  3. بعد الحضانة ، تسبح الحيوانات المنوية المتحركة نحو الجزء apical من العمود السائل. جمع الطبقة العليا ومراقبة لتقييم حركة الحيوانات المنوية.
    ملاحظة: يجب تقييم معلمات حركة الحيوانات المنوية باستخدام نظام تحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر (CASA) مع الإعدادات التالية: 25 إطارا تم الحصول عليها لتجنب تداخل تتبع الحيوانات المنوية ، والحد الأدنى للتباين 10 ، والحد الأدنى لسرعة المسار المتوسط 30 ميكرومتر / ثانية ، والحركة التدريجية > 80٪ استقامة. هذا النظام لديه إعداد محدد لتقييم الحيوانات المنوية رام. لكل عينة، يتم تحميل 5 ميكرولتر من نوع فرعي من تعليق الحيوانات المنوية في غرفة تحليل مسبقة الدفء بعمق 10 ميكرومتر. يتم تقييم حركة الحيوانات المنوية عند 37 درجة مئوية عند 40x باستخدام مجهر تباين المرحلة ويجب تحليل ما لا يقل عن 500 منوي لكل نوع فرعي في أربعة مجالات مجهرية مختلفة على الأقل. تم تقييم النسبة المئوية للحيوانات المنوية المتحركة والتقدمية الكلية. بالنسبة للتلقيح الاصطناعي، يجب أن تكون النسبة المئوية للحيوانات المنوية المتحركة التقدمية ≥ 30٪.
  4. تمييع السباحة المتابعة المستمدة spermatozoa المتحركة في 1 ×10 6 spermatozoa / مل التركيز النهائي والمشاركة في احتضانها مع البويضات MII في 300 ميكرولتر من المتوسط التلقيح الاصطناعي مغطاة بالزيوت المعدنية في أربعة أطباق بيتري جيدا.
  5. بعد 22 ح نقل الزيغوت المفترضة في أربعة أطباق بيتري جيدا تحتوي على SOF تكملها 0.4٪ الألبومين مصل البقر والأحماض الأمينية الأساسية وغير الأساسية في تركيز oviductal كما ذكرت من قبل16 تحت النفط المعدني وزراعة لهم في ظل ظروف قياسية تصل إلى مرحلة الكيسة الأريمية.
  6. في 22-, 26-و 32-h ما بعد التلقيح, تسجيل عدد البويضات المشقوقة, تظهر اثنين من blastomeres متميزة, من خلال الفحص تحت مجسمة مع التكبير 60x.
  7. مراقبة الأجنة يوميا بدءا من اليوم الخامس إلى التاسع من الثقافة وينبغي تسجيل الكيسات الأريمية التي تشكلت حديثا عن طريق الفحص تحت منظار مجسم مع التكبير 60x.

5. التزجيج البويضات والاحترار

ملاحظة: تنفيذ التزجيج باتباع طريقة الحد الأدنى من حجم الأساسية (MEV) باستخدام cryotops الجهاز17.

  1. توازن مجموعة من خمس بويضات في 38.5 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة في BM. استخدام BM يضمن تركيز الكالسيوم منخفضة ([Ca2++] 2.2 ملغم / ديسيلت)10.
  2. تجفيف البويضات مع التعرض 3 دقائق لمحلول التوازن التي تحتوي على 7.5٪ (v/v) ثنائي ميثيل سلفوإكسيد (DMSO) و 7.5٪ (v/v) غليكول الإيثيلين (EG) في BM.
  3. نقل البويضات إلى حل التزجيج التي تحتوي على 16.5٪ (v/v) DMSO، 16.5٪ (v/v) EG و 0.5 M trehalose في BM قبل تحميلها في جهاز التبريد وإغراقها مباشرة في النيتروجين السائل في غضون 30 ثانية.
  4. للتدفئة إلى درجة حرارة بيولوجية، نقل محتوى كل جهاز التزجيج من النيتروجين السائل إلى 200 μL قطرات من 1.25 M تريهالوز في BM لمدة 1 دقيقة في 38.5 درجة مئوية، ويحرك بلطف لتسهيل الاختلاط.
  5. لتعزيز إزالة المبردات داخل الخلايا، نقل البويضات تدريجيا إلى 200 قطرات ميكرولتر من محلول تريهالوز المتناقص (0.5 م، 0.25 م، 0.125 م تريهالوز في BM) لمدة 30 ثانية عند 38.5 درجة مئوية قبل أن يتم تسويتها لمدة 10 دقائق عند 38.5 درجة مئوية في BM.

6. تقييم جودة البويضات بعد الاحترار

  1. بعد الاحترار، واحتضان البويضات لمدة 6 ساعة في برنامج تلفزيوني دون Ca++ وMg++ بالإضافة إلى 20٪ FCS (BM) في 5٪ CO2 في الهواء عند 38.5 درجة مئوية.
    ملاحظة: القدرة على استعادة البويضات البيولوجية والهيكلية بعد التزجيج هي فيما يتعلق بأنواع وفئات البويضات المستخدمة.
  2. منذ قدرة البويضات لاسترداد الأضرار cryopreservation يعتمد على الوقت، وتقييم جودة البويضات في نقاط زمنية مختلفة من الثقافة في المختبر (0 ساعة، 2 ح، 4 ح، 6 ح) بعد الاحترار، لتحديد الإطار الزمني الأمثل للإخصاب البويضات.
    ملاحظة: في البويضات الأغنام الكبار, الوقت الأمثل هو 4 ح بعد الاحترار; لخلايا البويضات prepubertal، والوقت الأمثل هو 2 ساعة بعد الاحترار.

7. تقييم بقاء البويضات

  1. مباشرة بعد الاحترار ولكل نقطة زمنية من ثقافة ما بعد الاحترار، تقييم البويضات بشكل شكلي باستخدام المجهر المقلوب مع التكبير 100x.
    ملاحظة: يجب تصنيف البويضات ذات التعديلات الهيكلية، مثل السيتوبلازم الخافت و/أو الضرر الذي يلحق بزونا بيلوسيدا و/أو الغشاء على أنها منحلة.
  2. التحقق من صحة تقييم سلامة الغشاء باستخدام تلطيخ فلوري تفاضلي مزدوج.
  3. احتضان البويضات في 2 مل من BM التي تحتوي على يوديد البروبيديوم (PI؛ 10 ميكروغرام / مل) وهويشست 33342 (10 ميكروغرام / مل) لمدة 5 دقائق في 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في الهواء عند 38.5 درجة مئوية.
  4. بعد غسل ثلاث مرات في BM الطازجة، ومراقبة البويضات تحت المجهر الفلورسنت باستخدام مرشح الإثارة من 350 نانومتر وانبعاث 460 نانومتر لHoechst 33342 ومرشح الإثارة من 535 نانومتر وانبعاث 617 نانومتر لPI.
    ملاحظة: يمكن التعرف على البويضات ذات الغشاء السليم من خلال الفلورسينس الأزرق للحمض النووي الملون مع Hoechst 33342. تظهر البويضات ذات الأغشية التالفة مضان أحمر بسبب تلطيخ الحمض النووي مع PI.

8. تقييم نشاط الميتوكوندريا ومستويات ROS داخل الخلايا عن طريق الفحص المجهري بالليزر confocal

  1. إعداد MitoTracker الأحمر CM-H2XRos (MT-الأحمر) التحقيق.
    1. تمييع محتوى قارورة واحدة (50 ميكروغرام) مع 1 مل من DMSO للحصول على محلول 1 مللي متر. الحفاظ على قارورة مخففة في النيتروجين السائل.
    2. تمييع الحل 1 mM مع DMSO للحصول على حل المخزون 100 ميكرومتر وتخزينه في -80 درجة مئوية في الظلام.
  2. إعداد 2′,7′-ثنائي كلوروهيدروفلوروسيين diacetate (H2DCF-DA) التحقيق.
    1. تمييع H2DCF-DA في 0.1٪ بولي فينيل بيروليدون (PVA)/برنامج تلفزيوني للحصول على أول حل 100 mM. الحفاظ على الحل في -80 درجة مئوية في الظلام .
    2. تمييع الحل الأول في 0.1٪ PVA / PBS للحصول على حل الأسهم 100 ميكرومتر. تخزينه في -20 درجة مئوية في الظلام.
  3. إعداد المتوسطة المتصاعدة (MM): ل 10 مل من MM، أضف 5 مل من الجلسرين، 5 مل من برنامج تلفزيوني و 250 ملغ من أزيد الصوديوم. تخزينه في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  4. احتضان البويضات لمدة 30 دقيقة عند 38.5 درجة مئوية في BM مع 500 nM MT-Red (محلول المخزون: 100 ميكرومتر في DMSO).
  5. بعد الحضانة مع مسبار MT-Red، اغسل البويضات ثلاث مرات في BM واحتضن لمدة 20 دقيقة في نفس الوسائط التي تحتوي على 5 ميكرومتر H2DCF-DA (محلول المخزون: 100 ميكرومتر في BM).
  6. بعد التعرض للمسابير، وغسل البويضات في BM وإصلاح في 2.5٪ glutaraldehyde/ PBS لمدة 15 دقيقة على الأقل.
  7. بعد التثبيت، اغسل البويضات ثلاث مرات في BM واثبت على الشرائح الزجاجية في قطرة 4 ميكرولتر من MM مع 1 ملغم / مل Hoechst 33342 باستخدام وسائد الشمع لتجنب ضغط العينات.
  8. تخزين الشرائح عند 4 درجة مئوية في الظلام حتى التقييم.
  9. إجراء تحليل المقاطع التي تم تصنيفها بالمناعة باستخدام مجهر مسح ليزر كونفوج. تم تجهيز المجهر بأشعة الليزر Ar/He/Ne، باستخدام هدف زيتي 40/60x. تحليل المقاطع حسب الإثارة المتتابعة.
  10. لتقييم الميتوكوندريا، لاحظ العينات باستخدام ليزر متعدد الفوتون للكشف عن MT-Red (التعرض: 579 نانومتر؛ الانبعاثات: 599 نانومتر).
  11. استخدام أشعة الليزر أيونات الأرجون في 488 نانومتر ومرشح B-2 A (495 نانومتر التعرض و 519 نانومتر انبعاث) للإشارة إلى ثنائي كلوروفلوريسين (DCF)18.
  12. في كل البويضات الفردية، وقياس MT-الأحمر وDCF شدة الفلورسينس في الطائرة الاستوائية19.
  13. الحفاظ على المعلمات المتعلقة كثافة الفلورية في القيم الثابتة خلال جميع عمليات الاستحواذ على الصور (طاقة الليزر 26٪، إعدادات تسلسلية 1: PMT1 كسب 649-PMT2 كسب 482؛ الإعداد التسلسلي 2: كسب PMT1 625-PMT2 كسب 589; الإزاحة 0; حجم الثقب: 68).
  14. إجراء تحليل كمي لكثافة الفلورسينس باستخدام حزمة برامج تحليل الصور Leica LAS AF Lite ، باتباع الإجراءات الموحدة من قبل20.
  15. التقاط الصور مرة واحدة، تتحرك على محور Z، حتى تصل إلى الطائرة الاستوائية.
  16. لكل صورة، تم إيقاف التحويل إلى مقياس رمادي وإيقاف تشغيل القناة 1 (المتعلقة ب Hoechst blue). ثم رسم يدويا منطقة الاهتمام (ROI) على منطقة محدودة، وهذا هو حول المغزل meiotic.
    ملاحظة: البرنامج تلقائيا قراءة متوسط قيمة بكسل على القناة 2 (FITC) طرح قيمة الخلفية منه.
  17. سجل متوسط قيم وحدات البكسل وإرسالها للتحليل الإحصائي.

9. التحليلات الإحصائية

  1. تحليل الاختلافات التالية: معدلات البقاء على قيد الحياة في البويضات الأحداث مقابل الكبار، ومعدلات البقاء على قيد الحياة والكفاءة التنموية في السيطرة والبويضات الأحداث المعالجة trehalose، ومعدلات البقاء على قيد الحياة والتنشيط البارثينوجيني والكفاءة التنموية للبويضات الكبار تهتز مع وسائل الإعلام تركيز الكالسيوم المختلفة، ومعدلات الإخصاب وإنتاج الأجنة في البويضات الأحداث تهتز مع تركيز الكالسيوم منخفضة أو عالية، والأنماط الظاهرية الميتوكوندريا النشطة في البويضات الوترية الأحداث خلال نقاط زمنية مختلفة من ثقافة ما بعد الاحترار ومعدلات التنشيط البارثينوجينية بين البويضات الزهية الكبار والأحداث باستخدام اختبار تشي مربع.
  2. تحليل معدل الانقسام وانتاج الأجنة في البويضات الكبار الزهية خلال نقاط زمنية مختلفة من ثقافة ما بعد الاحترار، وكثافة الفلورية من نشاط الميتوكوندريا ومستويات ROS داخل الخلايا في البويضات الزحمة الأحداث خلال نقاط زمنية مختلفة من ثقافة ما بعد الاحترار من قبل ANOVA بعد تحليل لتجانس التباين من قبل اختبار ليفين. استخدم اختبار توكي اللاحق لتسليط الضوء على الاختلافات بين المجموعات وفيما بينها.
  3. إجراء تحليل إحصائي باستخدام برنامج إحصائي والنظر في احتمال P < 0.05 ليكون الحد الأدنى من الأهمية. يتم التعبير عن جميع النتائج على أنها متوسطة ± S.E.M.

النتائج

والتبريد من البويضات من المتبرعين الأحداث أقل بالمقارنة مع الكبار. التأثير الأول الملاحظ هو انخفاض معدل البقاء على قيد الحياة بعد الاحترار مقارنة بالبويضات البالغة(الشكل 1A؛ خي2 اختبار P<0.001). وأظهرت البويضات الأحداث سلامة الغشاء أقل بعد الاحترار (الشكل 1B

Discussion

يمكن أن يسمح الحفاظ على البويضات في الحيوانات المنزلية ليس فقط بالحفاظ على الموارد الوراثية الأنثوية على المدى الطويل ، ولكن أيضا تطوير التكنولوجيات الحيوية الجنينية. وبالتالي، فإن وضع طريقة قياسية لتزجيج البويضات من شأنه أن يستفيد منه كل من الثروة الحيوانية وقطاع البحوث. في هذا البروتو...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

ولم يتلق المؤلفان أي تمويل محدد لهذا العمل. البروفسورة ماريا غرازيا كاباي والدكتورة فاليريا باسيو معترف بامتنان لصوت الفيديو ولإعداد المختبر أثناء صنع الفيديو.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2′,7′-Dichlorofluorescin diacetateSigma-AldrichD-6883
Albumin bovine fraction V, protease freeSigma-AldrichA3059
Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342)Sigma-Aldrich14533
Calcium chloride (CaCl2 2H20)Sigma-AldrichC8106
Citric acidSigma-AldrichC2404
Confocal laser scanning microscopeLeica Microsystems GmbH,WetzlarTCS SP5 DMI 6000CS
Cryotop KitazatoMedical Biological Technologies
CysteamineSigma-AldrichM9768
D- (-) FructoseSigma-AldrichF0127
D(+)Trehalose dehydrateSigma-AldrichT0167
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2438
Dulbecco Phosphate Buffered SalineSigma-AldrichD8537
Egg yolkSigma-AldrichP3556
Ethylene glycol (EG)Sigma-Aldrich324558
FSHSigma-AldrichF4021
Glutamic AcidSigma-AldrichG5638
GlutaraldehydeSigma-AldrichG5882
GlycerolSigma-AldrichG5516
GlycineSigma-AldrichG8790
HeparinSigma-AldrichH4149
HEPESSigma-AldrichH4034
HypoutarineSigma-AldrichH1384
Inverted microscopeDiaphot, Nikon
L-AlanineSigma-AldrichA3534
L-ArginineSigma-AldrichA3784
L-AsparagineSigma-AldrichA4284
L-Aspartic AcidSigma-AldrichA4534
L-CysteineSigma-AldrichC7352
L-CystineSigma-AldrichC8786
L-GlutamineSigma-AldrichG3126
LHSigma-AldrichL6420
L-HistidineSigma-AldrichH9511
L-IsoleucineSigma-AldrichI7383
L-LeucineSigma-AldrichL1512
L-LysineSigma-AldrichL1137
L-MethionineSigma-AldrichM2893
L-OrnithineSigma-AldrichO6503
L-PhenylalanineSigma-AldrichP5030
L-ProlineSigma-AldrichP4655
L-SerineSigma-AldrichS5511
L-TyrosineSigma-AldrichT1020
L-ValineSigma-AldrichV6504
Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O)Sigma-AldrichM2393
Makler Counting ChamberSefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l.
Medium 199Sigma-AldrichM5017
Mineral oilSigma-AldrichM8410
MitoTracker Red CM-H2XRosThermoFisherM7512
New born calf serum heat inactivated (FCS)Sigma-AldrichN4762
Penicillin G sodium saltSigma-AldrichP3032
Phenol RedSigma-AldrichP3532
Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000)Sigma-AldrichP8136
Potassium Chloride (KCl)Sigma-AldrichP5405
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655
Propidium iodideSigma-AldrichP4170
Sheep serumSigma-AldrichS2263
Sodium azideSigma-AldrichS2202
Sodium bicarbonate (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
Sodium chloride (NaCl)Sigma-AldrichS9888
Sodium dl-lactate solution syrupSigma-AldrichL4263
Sodium pyruvateSigma-AldrichP2256
Sperm Class AnalyzerMicroptic S.L.S.C.A. v 3.2.0
Statistical software Minitab 18.12017 Minitab
Stereo microscopeOlimpusSZ61
Streptomycin sulfateSigma-AldrichS9137
TaurineSigma-AldrichT7146
TRISSigma-Aldrich15,456-3

References

  1. Arav, A. Cryopreservation of oocytes and embryos. Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).
  2. Mullen, S. F., Fahy, G. M. A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep. Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).
  3. Hwang, I. S., Hochi, S. Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
  4. Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), (2007).
  5. Quan, G., Wu, G., Hong, Q. Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective. Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).
  6. Succu, S., et al. A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 110, (2018).
  7. Succu, S., et al. Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance. Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).
  8. Succu, S., et al. Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).
  9. Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes. Reproductive BioMedicine Online. , (2015).
  10. Succu, S., et al. Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes. Theriogenology. 75 (4), (2011).
  11. Sanaei, B., et al. An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator. Cryobiology. 84, 82-90 (2018).
  12. Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices. Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).
  13. Fernández-Reyez, F., et al. maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices. Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).
  14. Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).
  15. Barrera, N., et al. Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes. PLoS ONE. 13 (6), (2018).
  16. Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations. Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).
  17. Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
  18. Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes. Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).
  19. Dell'Aquila, M. E., et al. Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
  20. Gadau, S. D. Morphological and quantitative analysis on α-tubulin modifications in glioblastoma cells. Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).
  21. los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation. Theriogenology. , (2011).
  22. Leoni, G. G., et al. Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model. PLoS ONE. 10 (4), (2015).
  23. Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).
  24. Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 148, 216-224 (2020).
  25. Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes. Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).
  26. Ciotti, P. M., et al. Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing. Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).
  27. Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1. Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).
  28. Palmerini, M. G., et al. In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).
  29. Leoni, G. G., et al. Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).
  30. Succu, S., et al. Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes. Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).
  31. Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes. Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).
  32. Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution. Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).
  33. Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
  34. De Santis, L., et al. Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters. Placenta. 32, 280-281 (2011).
  35. Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification. Nanomedicine. 6 (6), 1115-1129 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

173 ROS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved